Biologia e genetica di popolazioni in ambito forense, dalla traccia biologica allo studio dei polimorfismi STR's

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1 Biologia e genetica di popolazioni in ambito forense, dalla traccia biologica allo studio dei polimorfismi STR's Dott. Giorgio Portera Dip. di Biologia e Genetica per le Scienze Mediche Università degli Studi di Milano

2 Laboratorio di Biologia Forense Ispezione: ricerca tracce (sangue, saliva, sperma,capelli capelli.) Estrazione (resine magnetiche, colonnine, fenolo/cloroformio) Quantificazione (rt rt-pcr pcr) Amplificazione (multiplex multiplex) Tipizzazione ( XL) 3130XL) PROFILI GENOTIPICI PER LA RICOSTRUZIONE DELLA DINAMICA DELITTUOSA

3 Tipologia dei reperti Vestiti con evidenti tracce ematiche Vestiti con minime tracce ematiche

4 Ricerca di tracce ematiche da reperti ripuliti dopo il crimine

5 Indumenti usati per travisare il viso,investigati per la ricerca di saliva e residui epiteliali

6 Ricostruzioni parentali da resti cadaverici o ossei

7 TEST GENERICI E DI SPECIE Utili nell identificazione del tipo di fluido biologico in fase di ispezione TEST GENERICI combur test sangue (test colorimetrico) amilasi saliva (test colorimetrico) psa sperma sperma (immunocromatografico immunocromatografico) TEST DI SPECIE obti test: specifico per sangue di primate (immunocromatografico immunocromatografico) semelogenina: specifico per sperma umano (proteina secreta in vescicole seminali, immunocromatografico)

8 COMBUR TEST - Combur 3 Test E (ROCHE) Commercializzato per la diagnosi clinica delle urine, saggio colorimetrico per il livello di glucosio, proteine e eritrociti sostanza: tetrametilbenzidina il tampone reagisce colorandosi di verde in presenza di attività perossidasica dell emoglobina emoglobina FALSI POSITIVI: perossidasi vegetali, ruggine, ossidanti vari, ecc.

9 COMBUR TEST - Combur3 Test E (ROCHE)

10 AMILASI TEST test per diagnosi clinica della pancreatite acuta sostanza: 2-cloro cloro-4-nitrofenolo legato a maltotrioso indicatore colorimetrico che reagisce con l α-amilasi l della saliva,in presenza di saliva si colora di giallo FALSI POSITIVI: sudore, urina, altri fluidi corporei

11 AMILASI TEST

12 PSA TEST test per diagnosi clinica del tumore alla prostata, dell iperplasia prostatica benigna (bph bph) e delle infezioni alla prostata; saggio immunologico semiquantitativo per la determinazione dell antigene specifico prostatico nel sangue, siero e plasma sostanza: anticorpi anti antigene psa coniugati a oro colloidale utilizzato per identificare tracce di sperma falsi positivi: in donne utilizzatrici di pillole anticoncezionali

13 TEST SPECIFICI OBTI TEST - HEXAGON OBTI (HUMAN) : anticorpi anti hb umani coniugati a particelle cromogene (blu) utilizzato per la diagnosi specie - specifico per il sangue dei primati superiori. TEST PER SEMELOGENINA: specifico per sperma umano (α- semelogenina,proteina secreta in vescicole seminali)

14 LAMPADA CRIMESCOPE lampada con luce monocromatica a lunghezza d onda variabile ( nm) Principio: differente emissione assorbimento tra fluidi biologici e substrati

15 SLIP con tracce di sperma FODERA di una giacca con tracce di sudore

16 Aree luminescenti Crimescope C16 Aree positive al test dell Amilasi

17 Esempio di un reperto con numerose aree luminescenti 22R 22 O 22Q 22N 22P 22I 22L 22M

18 ESTRAZIONE DEL DNA FENOLO-CLOROFORMIO solventi organici immiscibili con acqua: si formano 2 fasi, DNA in quella acquosa, proteine in quella organica RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU COLONNA DNA affine alla resina, rimane legato nella membrana della colonna, successivamente viene eluito RESINE AGLI OSSIDI DI SILICIO SU BIGLIE MAGNETICHE stessa chimica del precedente metodo, ma la resina è libera in soluzione. Viene poi recuperata con un magnete e il DNA eluito RESINE SINTETICHE AFFINI AL DNA PER CARICA ELETTROSTATICA: il DNA si lega alla resina al variare del ph della soluzione

19 ESTRAZIONE CON RESINA MAGNETICA metodo di estrazione del DNA che ne sfrutta la carica negativa metodica veloce e modulabile a seconda del tipo di traccia (possibilit possibilità di aumentare il numero dei lavaggi, estrazione da diversi volumi) estrazione automatizzabile resina + DNA - DNA - resina -

20 AUTOMAZIONE ESTRAZIONE AUTOMATIZZATA ATTRAVERSO L UTILIZZO DI ROBOT (MICRO-PIPETTATORI) uniche fasi compiute dall operatore: posizionamento dei campioni e reagenti VANTAGGI possibilità di estrarre in meno di 2h fino a 96 tracce riduzione rischio di errori dell operatore alta precisione nel dosaggio dei reagenti

21 CODICE A BARRE TRACCIABILITÀ DEI CAMPIONI possibilità di poter attribuire un indicativo (codice a barre classico o bidimensionale) dalla prima fase del prelievo della traccia alla conservazione dell estratto estratto i codici delle diverse fasi di lavorazione (ispezione, estrazione ) vengono collegati attraverso lettori ottici COLLEGAMENTO CON LETTORE OTTICO

22 QUANTIFICAZIONE CON REAL TIME I campioni vengono quantificati con STANDARD con DNA noto e privo di inibizione (da 50ng/µl a 23 pg/µl) importanza dell IPC nella lettura della quantificazione dei campioni per valutare la qualità del DNA estratto (eventuale PURIFICAZIONE) INIBIZIONE: non è possibile valutare la presenza o assenza di DNA PURIFICAZIONE

23 Real -Time IPC campioni + standard, curva molto simile IPC inibito

24 POSSIBILITÀ DI QUANTIFICARE NELLA STESSA REAZIONE DNA GENOMICO UMANO E DNA MASCHILE REPERTO Umano (pg/ul) Y Maschile (pg/ul) Ratio H/Y Condom1-ext 91± 20% 60 ± 20% 1.5 ± 20% Condom1-int 44 ± 30% 69 ± 20% 0.6 ± 30% Condom2-ext 44 ± 30% 15 ± 30% 3 ± 30% Condom2-int 10 ± 30% 10 ± 30% 1 Condom3-ext 180 ± 10% 348 ± 10% 0.5 ± 10% Condom3-int ± 10% ± 10% 1.2 ± 10% Condom4-ext 59 ± 20% 13 ± 30% 4.5 ± 30% Condom4-int 4239 ± 10% ± 10% 0.4 ± 10% Condom5-ext 390 ± 10% 201 ± 10% 1.9 ± 10% Condom5-int 1534 ± 10% 1633 ± 10% 0.9 ± 10% Condom6-ext 124 ± 10% - - Condom6-int 25 ± 30% 45 ± 30% 0.9 ± 30%

25 Amplificare e tipizzare l intero l genoma sarebbe improponibile per costi e tempo Studi di popolazioni hanno permesso di individuare marcatori con le seguenti caratteristiche: 1. POLIMORFICI anche in popolazioni isolate (lo stesso marcatore deve presentare diverse varianti nella popolazione) 2. STABILI alle mutazioni (importanza della scelta dei primers) 3. EQUILIBRIO con la legge di Hardy-Weinberg 4. INDIPENDENTI AMPLIFICAZIONE caratteristiche di un marcatore forense Microsatelliti STR (Short Tandem Repeat)

26 STRUTTURA DI UN STR GATA...ACAGATGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATATGT.. GATA è la sequenza del core-repeat Il microsatellite in questione è un tetranucleotidico Le varianti (alleli alleli) hanno un numero diverso di repeat 8 ripetizioni...acagat GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT... 9 ripetizioni...acagat GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT ripetizioni...acagat GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA GATA TGT...

27 Per convenzione gli alleli degli STR vengono chiamati in base al numero di repeat NOME DEL MARCATORE POTENZIALI ALLELI; IDENTIFICATI CON IL NUMERO DI RIPETIZIONI DEL CORE REPEAT

28 SCELTA DEGLI STR Studi di genetica di popolazione hanno permesso di isolare 13 specifici marcatori STR, denominati Loci Codis TPOX D3S1358 D5S818 FGA CSF1PO D8S1179 D7S820 TH01 VWA AMEL D13S317 D16S539 D18S51 D21S11 AMEL

29 Studi di popolazione 13 Loci Codis

30 MULTIPLEX I 13 loci Codis vengono amplificati in un unica reazione di PCR, spesso con aggiunta di altri loci per aumentarne il potere discriminante gli attuali kit di amplificazione caratterizzano contemporaneamente 15 loci STR (Multiplex) le attuali multiplex permettono di amplificare concentrazioni di estratto inferiori ai 50 pg/µl DNA nucleare cellula diploide ~ 6 pg, 50/6= 8 cellule/µl 20 cellule x reazione!!!

31 TIPIZZAZIONE I frammenti vengono separati e caratterizzati tramite elettroforesi capillare utilizzando un sequenziatore automatico (310, 3100, 3130XL), leggendo i segnali dei diversi DYE che discriminano i frammenti overlappanti RAW DATA DATO GREZZO

32 PROFILO GENETICO ELABORATO

33 DIMOSTRAZIONE D IDENTITA un profilo secondo gli standard FBI (codis) e formato da 13 marcatori poniamo che ogni marcatore presenti alleli la cui frequenza e pari a 0,1 nella popolazione di riferimento poniamo che ogni marcatore presenti lo stesso allele su entrambi i cromosomi (omozigosi) la probabilita di ottenere la combinazione data per ogni marcatore e pari a 0,1*0,1=0,01 la probabilita di ottenere la combinazione data per tutto il profilo e 0,01*0,01* 0,01 (13 volte) ovvero 10-26, 1 su miliardi di miliardi di individui.. IL PROFILO PUO ESSERE RITENUTO UNICO

34 VIOLENZA SESSUALE Reperti Foto vetrino

35 indiziato tampone vaginale vittima sperma vestaglia

36 indiziato tampone vaginale vittima vestaglia

37 indiziato tampone vaginale vittima vestaglia

38 indiziato tampone vaginale vittima vestaglia

39 Nuove applicazioni e possibilità di sviluppo in biologia forense Studio DNA degradato ( tracce stressate e residui epiteliali) Ricerca mrna su tracce forensi

40 DNA DEGRADATO La caratterizzazione di ampliconi più corti (loci Mini-STR), permette di analizzare estratti molto degradati come quelli di sudore e residui epiteliali Tracce attaccate da batteri, muffe, stress ambientale

41 ministr Primers per STR Locus Primers per ministr Degradazione Degradazione

42 250<x< <x<350 Amplificazione con kit Identifiler (16 sistemi STR) 25pg/ul 250<x< <x< cellule 140<x<190 Amplificazione con kit Minifiler (9 sistemi mini-str) 110<x<180 70<x<120 80<x<130

43 RICERCA RNA MESSAGGERO SU TRACCE FORENSI Possibilità di DATARE la traccia in base alla quantità di messaggero ancora presente, ma soprattutto stabilire l ORIGINE TISSUTALE, in modo da eliminare i limiti delle diagnosi specifiche e generiche e valutazioni ispettive. Esempio: luminescenza alla crimescope di urina molto simile a secrezioni vaginali, distinzione tra perdite ematiche da trauma o perdite sangue mestruale

44 INDAGINI SU SANGUE MESTRUALE In passato la diagnosi di sangue mestruale veniva fatta attraverso la ricerca microscopica di cellule dell endometrio, dosaggio ormonale o rapporto tra degradazione fibrina/fibrinogeno. SVANTAGGI necessità di elevate tracce di sangue non applicabilità in tracce forensi (sporche e non sempre ben repertate) in alcuni casi di violenza sessuale o omicidio è importante determinare l origine delle tracce ematiche PERDITE DA TRAUMA O FISIOLOGICHE?

45 CASEWORK scomparsa e rinvenimento cadavere di una donna di circa 30 anni il sopralluogo dell abitazione consente di rinvenire un lenzuolo con consistenti tracce ematiche, poi tipizzate ed appartenenti alla donna viene accusato di omicidio il marito, che giustifica le abbondanti tracce ematiche del lenzuolo come perdite mestruali

46 RICERCA DI UN TRASCRITTO SPECIFICO PER SANGUE MESTRUALE. vengono raccolti vari campioni: campioni autoptici di vari tessuti, tra cui cellule della mucosa dell endometrio sangue mestruale di volontarie sangue da traumi vari ESTRAZIONE RNA MESSAGGERO RETROTRASCRIZIONE PCR

47 Dott. Giorgio Portera