,QWURGX]LRQH 6WUXWWXUDGHJOLDQWLFRUSL. Introduzione

Transcript

1 Indice,QGLFH 1 Indice Riassunto Nomenclatura Misure di grandezza Abbreviazioni Introduzione Struttura degli anticorpi Catene leggere (L, light chains, MW ca Da) Catene pesanti (H, heavy chains, MW ca Da) Mieloma Multiplo Cenni Storici Definizione Mieloma Multiplo Criteri per la diagnosi di Mieloma Multiplo Determinazione attuale delle catene leggere totali Difficoltà diagnostiche Siero Urina Soluzioni Materiali e metodi Ricerca e conservazione dei campioni Metodo Principio Nefelometria (luce riflessa) Realizzazione grafici Risultati Discussione Maggiore sensibilità del metodo Freelite Metodo Freelite in sostituzione dell urina delle 24 ore Metodo Freelite per il monitoraggio della terapia Metodo Freelite per una prognosi Conclusioni Ringraziamenti Bibliografia...26 Allegati Morfologia del midollo osseo Morfologia delle plasmacellule Programmazione nefelometro Alkeran Prednison Intron A Myrim Fortecortin

2 Riassunto 5LDVVXQWR L obiettivo di questo studio è quello di testare il nuovo metodo Freelite della ditta Binding Site (USA), da poco uscito sul mercato, utilizzando il nefelometro Dade Behring II (BN II) e valutare in quali misure il metodo potrebbe aiutare il medico nella diagnosi e nella valutazione del successo di una terapia del Mieloma Multiplo. Per poter realizzare questo studio, quindi, sono stati raccolti 20 campioni (siero) di pazienti affetti da Mieloma Multiplo o comunque con una paraproteinemia monoclonale. Dopodiché in ogni campione sono stati determinati i seguenti parametri: catene totali kappa e lambda, catene libere NDSSDHODPEGDPHWRGR)UHHOLWHŒFLVWDWLQD& PLFURJOREXOLQDHSURWHLQHWRWDOL Si è giunti alla conclusione che il metodo potrebbe aiutare il medico sia nella diagnosi, grazie alla migliore sensibilità, che nella valutazione del successo di una terapia del Mieloma Multiplo. Si auspica comunque che questo studio possa proseguire per poter confermare i dati ottenuti, in quanto il tempo a disposizione per la realizzazione (7 mesi) è stato ridotto. 2

3 Nomenclatura 1RPHQFODWXUD 0LVXUHGLJUDQGH]]D 6LPEROR 'HVFUL]LRQH Da dalton g/dl grammi al decilitro mg/dl milligrammi al decilitro mg/l milligrammi al litro C gradi Celsius ml millilitri / microlitri $EEUHYLD]LRQL Ig Ac IgG MW H L C V C V Ag k l MM flc BN II ELSE IF BJP g PFA Immunoglobulina Anticorpo Immunoglobulina di classe G Massa molecolare Catena pesante di un anticorpo Catena leggera di un anticorpo Regione costante della catena leggera di un anticorpo Regione variabile della catena leggera di un anticorpo Regione costante della catena pesante di un anticorpo Regione variabile della catena pesante di un anticorpo Antigene Catena leggera del tipo kappa di un anticorpo Catena leggera del tipo lambda di un anticorpo Mieloma Multiplo Catene leggere libere Nefelometro Dade Behring II Elettroforesi Immunofissazione Proteine Bence Jones Accelerazione gravitazionale terrestre Proteine della fase acuta 3

4 Introduzione,QWURGX]LRQH 6WUXWWXUDGHJOLDQWLFRUSL La struttura molecolare di base a quattro catene delle immunoglobuline (Ig), è costituita da due tipi di catene polipeptidiche. La catena più piccola (detta leggera) ha una massa molecolare di 25'000 Dalton (Da) ed è comune a tutte le classi, mentre la catena più grande (detta pesante) ha una massa molecolare di 50'000 77'000 Da ed è strutturalmente diversa per ciascuna classe o sottoclasse. Le catene polipeptidiche sono legate fra loro da forze covalenti e non covalenti. Come modello per la struttura di un anticorpo (Ac) si considera quella dell Ig di classe G (IgG, MW 150'000 Da) formata, come descritto sopra, da quattro catene polipeptidiche, due pesanti (H, heavy chains ) e due leggere (L, light chains ), legate tra di loro da dei ponti solfuro. Quest ultimi si trovano anche all interno delle varie catene formando così dei domini (-S-S-). 1 )LJXUD 6WUXWWXUDGLEDVHGLXQDPROHFRODGLLPPXQRJOREXOLQD,J*ODUHJLRQH1WHUPLQDOHqFDUDWWHUL]]DWDGDOOD YDULDELOLWj9GHOODVHTXHQ]DDPLQRDFLGLFDVLDDOLYHOORGHOODFDWHQDSHVDQWHFKHOHJJHUD9 H9 ULVSHWWLYDPHQWHLOUHVWRGHOODPROHFRODHYLGHQ]LDVHTXHQ]HFRVWDQWL&/DUHJLRQHFRVWDQWHGHOODFDWHQDOHJJHUD qqrwdfrqodvljod& PHQWUHODUHJLRQHFRVWDQWHGHOODFDWHQDSHVDQWHSXzHVVHUHXOWHULRUPHQWHVXGGLYLVDLQWUH GLYHUVHVXEUHJLRQL& 1 & 2 & 3 4XHVWHUHJLRQLJOREXODULFKHVRQRUHVHVWDELOLGDOODSUHVHQ]DGLSRQWLGL VROIXURLQWUDFDWHQDULVRQRFKLDPDWL³GRPLQL 2 4

5 Introduzione &DWHQHOHJJHUH/³OLJKWFKDLQV 0:FD 'D Una catena leggera di IgG è formata da 220 aminoacidi, che costituiscono una regione costante (C ) e una regione variabile (V ) composte di ca. 110 aminoacidi. Nella regione variabile della catena leggera si possono evidenziare tre regioni differenti nelle quali si osserva una variabilità particolarmente elevata: la regione iper-variabile, che grazie alla sua caratteristica può formare un numero importante di Ac diversi (con paratopi diversi) che permettono loro di riconoscere e legare in modo specifico ogni tipo di antigene (Ag), con tutti i suoi differenti epitopi. Nella parte C-terminale, che caratterizza la regione costante, sono stati riconosciuti due tipi differenti di catene leggere, denominate kappa (k) e lambda (l). Una molecola è costituita solamente da un tipo di catena, o kappa o lambda, ma per ogni classe di Ig sono possibili le due varianti. In un siero umano normale, il 65% delle catene leggere sono della variante kappa. 3 &DWHQHSHVDQWL+³KHDY\FKDLQV 0:FD 'D Costituita da ca. 450 aminoacidi, è anch essa costituita da una parte costante (C ) e da una parte variabile (V ), chiamati domini. Contrariamente alla catena leggera, la regione costante si differenzia molto tra le diverse classi di Ig e sono quindi caratteristiche per ogni classe. L N-terminale è anch esso costituito da tre regioni iper-variabili, che contribuiscono quindi alla formazione del paratopo. Il sito del legame tra l Ac con il suo Ag è formato dalle regioni variabili di una catena pesante e di una leggera. Ogni molecola di Ac può di conseguenza legare due Ag. Le catene pesanti formano tra il dominio C 1 e C 2 una regione cerniera, che permette all Ac di reagire con due epitopi, situati su molecole differenti, molto vicini o più distanti fra loro. 3 0LHORPD0XOWLSOR &HQQL6WRULFL La scoperta del Mieloma inizia nel 1848 quando gli inglesi Watson e McIntyre inviarono separatamente al chimico Henry Bence Jones l urina di un loro paziente, ricevendo come risposta la descrizione di una particolare sostanza che prese il nome di corpo di Bence Jones. Nel 1850 McIntyre, dopo il decesso del paziente e i risultati dell autopsia, descrisse il caso nel suo complesso clinico, chimico e anatomo-patologico sotto la denominazione di Mollities et fragilitas ossium. Nel 1873 von Rustitzki coniò il termine Mieloma Multiplo (MM), basandosi sull osservazione istologica del tessuto patologico; nel 1889 Kahler descrisse minuziosamente il decorso della malattia, ma fu solo nel 1902 che Wright, descrivendo le cellule del tessuto mielomatoso, affermò che la malattia era causata dall espansione di plasmacellule, uguali o molto simili a quelle descritte per la prima volta nel 1875 da Waldeyer nel midollo normale e così chiamate per la ricchezza del citoplasma. 4 5

6 Introduzione 'HILQL]LRQH0LHORPD0XOWLSOR Si tratta di una proliferazione monoclonale di plasmacellule nel tessuto midollare (vedi allegato 2), che produce una paraproteina monoclonale, o frammento di essa, con diminuzione delle immunoglobuline normali (ipogammaglobulinemia), riduzione della produzione ematopoietica, osteolisi per stimolazione degli osteoclasti e disfunzione renale. Come mostra la tabella seguente, la paraproteinemia monoclonale è formata principalmente da IgG o IgA e, in minor casi, da IgE o IgD. Può però anche essere presente sotto forma di catene leggere libere e anche, se con una bassa frequenza, in forma biclonale. 4 7DEHOOD 1HOODWDEHOODVRQRULSRUWDWHOHIUHTXHQ]HGLRJQL,JLQSD]LHQWLDIIHWWLGD00 5 Può essere scoperta per caso, per un anemia, per una pancitopenia, per la presenza di rotoli di monete e plasmacellule nello striscio periferico, per una VES elevata, per dolori ossei soprattutto alla colonna vertebrale, oppure ancora, per fratture ossee patologiche (ossia non adeguate al trauma) o spontanee. Una volta definita la presenza di una paraproteina monoclonale è indispensabile l esame del tessuto midollare. L incidenza globale del MM, che rappresenta approssimativamente l 1,5% di tutte le neoplasie e il 19% di quelle ematologiche, è di circa 4 casi ogni abitanti. 4 6

7 Introduzione )LJXUD 4XHVWDILJXUDPRVWUDOHYDULHIUHTXHQ]HGLPDODWWLHDVVRFLDWHDOODSURGX]LRQHGLSDUDSURWHLQHPRQRFORQDOL 6 L età media alla diagnosi è compresa tra 60 e 65 anni, pur essendo descritti casi anche in età più giovane e, molto raramente, nei bambini; la frequenza è maggiore nel sesso maschile e doppia nelle persone di colore. L eziologia è sconosciuta, ma studi epidemiologici hanno dimostrato una relazione con occupazioni agricole, esposizioni a radiazioni o a benzene, oltre alla presenza di fattori genetici predisponenti e di situazioni protratte di stimolazione antigenica. Il trattamento prevede la chemioterapia, la radioterapia e/o la plasmaferesi. 4 7

8 Introduzione &ULWHULSHUODGLDJQRVLGL0LHORPD0XOWLSOR Secondo Durie e Salomon (1975) per la diagnosi sono necessari due criteri maggiori, cioè œ Biopsia ossea o tessutale positiva; œ Infiltrazione midollare di plasmacellule > 30% (o cellule chiaramente patologiche); œ Paraproteinemia - nel siero: IgG > 3.5 g/dl, IgA > 2 g/dl - nell urina: proteina di Bence Jones (BJP) nelle 24 ore in quantità uguali o superiori a quelle sieriche; oppure contemporaneamente un criterio maggiore e tre criteri minori, cioè œ Infiltrazione midollare di plasmacellule compresa fra 10 30%; œ Paraproteinemia monoclonale minore di quanto detto per i criteri maggiori; œ Osteolisi; œ Diminuzione delle immunoglobuline normali (IgG < 600 mg/dl, Ig A < 100 mg/dl, IgM < 50 mg/dl). 7 'HWHUPLQD]LRQHDWWXDOHGHOOHFDWHQHOHJJHUHWRWDOL Quando le plasmacellule nel midollo osseo producono le immunoglobuline, le catene pesanti (G, A, M, D o E) e le catene leggere (kappa o lambda) vengono generate separatamente. Dopodiché, solo in un secondo tempo, le catene leggere vanno a legarsi alle catene pesanti formando così le immunoglobuline complete. In una persona sana, le catene leggere vengono prodotte in eccesso e di conseguenza una minima parte sarà presente nel siero in forma libera (flc). Nel MM però, come in altre gammopatie monoclonali, la produzione di flc supera i valori di riferimento (siero k: mg/l; l: ±PJ/ TXR]LHQWH± Inoltre, in condizioni normali il livello di flc nell urina è molto basso (urina k: mg/l; l: PJ/ TXR]LHQWH±TXHVWRSHUFKé vengono riassorbite dai tubuli renali. Anche in questo caso, l aumento delle flc nell urina, o anche chiamate proteine di BJP, può essere indice di un MM come pure di una malattia renale o di una sindrome linfoproliferativa. 8 8

9 Introduzione )LJXUD 3URGX]LRQHGHOOHFDWHQHSHVDQWL*$0'R(HGHOOHFDWHQHOHJJHUHNDSSDRODPEGDGDSDUWHGHOOH SODVPDFHOOXOHQHOPLGROORRVVHR 8 Attualmente al Laboratorio Centrale di Chimica ed Immunologia Clinica (LC-CIC) di Bellinzona, mediante il nefelometro Dade Behring II (BN II) e quindi sfruttando il principio della nefelometria, vengono determinate le catene leggere totali. Ciò significa che vengono quantificate sia le flc che quelle legate alla catena pesante. Prima di quantificarle però, solitamente si esegue un elettroforesi (ELSE) e, se è il caso, un immunofissazione (IF) che permette di evidenziare la presenza o meno di flc. 'LIILFROWjGLDJQRVWLFKH La struttura delle flc e di quelle legate alla catena pesante è identica, perciò per anni è stato vano il tentativo di quantificare in modo accurato le flc in presenza di Ac interi. Infatti, utilizzando il metodo nefelometrico attuale non si può evidenziare quale percentuale di catene leggere è presente in forma libera e quale è legata alla catena pesante. Inoltre, bisogna anche considerare che l ELSE e l IF sono delle tecniche con una bassa sensibilità. 8 6LHUR Quando vi è un sospetto di MM, in laboratorio, viene effettuata un ELSE e se essa dovesse risultare dubbia o positiva, si effettua un IF. Questi metodi però sono stati riconosciuti inadatti a causa di una bassa sensibilità che potrebbe condurre ad interpretazioni errate. Infatti di tutti i casi di MM, circa il 20% sono mielomi a catene leggere (Bence Jones) i quali non sono stati rilevati mediante un ELSE. Mentre circa il 2% sono mielomi non secernenti i quali sono 9

10 Introduzione risultatati negativi sia all ELSE che all IF. Di conseguenza, testando solo il campione di siero, si arriva fino al 22% di MM non diagnosticati (falsi negativi). 8 6HQVLELOLWj Elettroforesi siero Immunofissazione siero /LPLWHGLULOHYDELOLWjGLIOF mg/l mg/l 8ULQD Per poter escludere un mieloma Bence Jones, il laboratorio dovrebbe poter disporre dell urina delle 24 ore. Dopodiché il campione sarà concentrato 100x e successivamente sarà effettuata un ELSE e, se è il caso, un IF. Sfortunatamente la raccolta dell urina delle 24 ore può porre dei problemi al paziente (raccolta al quanto scomoda), perciò spesso quest analisi non viene effettuata. Quando però l urina giunge in laboratorio, spesso non si riesce ad evidenziare la presenza di proteine BJP. Infatti, il 35% dei laboratori, con una concentrazione di proteine Bence Jones pari a 60 mg/l, non sono in grado di evidenziarle. Di conseguenza può accadere che alle prime analisi non viene diagnosticato un mieloma Bence Jones in pazienti che in realtà ne sono affetti. 8 6HQVLELOLWj /LPLWHGLULOHYDELOLWjGLIOF Elettroforesi urina (concentrata 100x) Immunofissazione urina (concentrata 100x) mg/l mg/l 6ROX]LRQL Il nuovo test Freelite della Binding Site (USA), utilizzato con il nefelometro BN II, permette un accurata e rapita quantificazione delle flc nel siero, nell urina e nel liquor. Infatti, grazie a questo metodo, il nefelometro è in grado di quantificare solo le flc senza determinare anche le catene leggere legate alla catena pesante dell Ac. Ciò è reso possibile grazie alla presenza di Ac specifici che legano esclusivamente le flc (Ag). 8 10

11 Introduzione Inoltre, possiede un elevata sensibilità: 6HQVLELOLWj 1HIHORPHWULD VLHUR 1HIHORPHWULD VLHUR ELSE siero IF siero 1HIHORPHWULD XULQD 1HIHORPHWULD XULQD ELSE urina IF urina /LPLWHGLULOHYDELOLWjGLIOF 1.2 mg/l 1.6 mg/l mg/l mg/l 0.06 mg/l 0.08 mg/l mg/l mg/l Oltre a ciò, si sa che l emivita delle flc nel siero (2-4 ore) è molto più corta delle Ig complete (3 settimane), questo permette quindi di poter valutare un eventuale risposta ad un trattamento a distanza di giorni e non di settimane. 9 11

12 Materiali e metodi 0DWHULDOLHPHWRGL 5LFHUFDHFRQVHUYD]LRQHGHLFDPSLRQL Per poter realizzare questo studio occorre disporre di un certo numero di campioni di siero ed essi sono stati raccolti seguendo principalmente due criteri, ossia: Esempio: IF 1. ogni qualvolta che, al laboratorio centrale, ci si trovava di fronte ad un IF in cui erano visibili delle bande o comunque degli addensamenti solamente nella regione kappa e/o lambda, il campione in questione veniva separato, etichettato, congelato (-20 C) e schedato. )LJXUD,QHQWUDPELLJHOVLSXzRVVHUYDUHGHJOLDGGHQVDPHQWLQHOOD]RQDODPEGDLTXDOLQRQVHPEUHUHEEHUROHJDWLDG XQDFDWHQDSHVDQWH,J*,J$,J

13 Materiali e metodi 2. grazie all aiuto del personale del Laboratorio di Ematologia Morfologica (LEM) di Bellinzona, è stato possibile seguire i pazienti affetti da MM e di conseguenza raccoglierne i campioni. Infatti sapendo il giorno in cui i pazienti si sarebbero recati al laboratorio dell Ospedale S.Giovanni (ORBV), ci si poteva organizzare di conseguenza. Poi, una volta raccolto il campione (usando una provetta BD Vacutainer col gel di 6 ml), quest ultimo veniva centrifugato (15 minuti a 400g), separato, etichettato, congelato (-20 C) e schedato. Una volta raccolto un numero sufficiente di campioni (con un minimo di 20 pazienti), questi ultimi sono stati tolti dal congelatore (-20 C) e messi in frigorifero (8 C) 24 ore prima di effettuare le analisi. I campioni (siero) sono stabili per 72 ore a 2-8 C, mentre tenendoli a 20 C la stabilità è prolungata. 0HWRGR Mediante il nefelometro Dade Behring II (BN II) e quindi sfruttando il principio della nefelometria, è stato utilizzato il nuovo test Freelite della Binding Site (USA) fornito dalla ditta SODIAG SA di Losone. Infatti quest ultima ci ha fornito gratuitamente due Kit per la ricerca delle catene kappa e lambda libere umane. In essi sono presenti: - 2 x 2.2 ml Human kappa o lambda Free Reagent, - 2 x 1.0 ml Human kappa o lambda Free Standard, - 1 x 1.5 ml Human kappa o lambda Free BNII High Control, - 1 x 1.5 ml Human kappa o lambda Free BNII Control, - 1 x 3.0 ml kappa o lambda Free Supplemementary Reagent, ognuno dei quali è già pronto all uso. I Kit devono essere mantenuti ad una temperatura che può oscillare dai 2 ai 8 C e, una volta aperti, sono stabili per 3 mesi. Ognuno di essi permette di poter effettuare 100 test. Il nefelometro in questione, prima di effettuare le analisi, è stato programmato seguendo la metodica contenuta nel Kit (vedi allegato 3). 3ULQFLSLR 1HIHORPHWULDOXFHULIOHVVD La metodica si basa su di un processo di immunoprecipitazione in fase liquida, che non viene valutata ad occhio nudo (quindi in modo molto approssimativo), ma in modo quantitativo con un principio fisico. La nefelometria si basa sulla misura della luce riflessa, dovuta alla torbidità della soluzione causata dalla formazione degli immunocomplessi Ag/Ac 11. Si lavora nella regione situata a sinistra della 13

14 Materiali e metodi curva di Heidelberg, dove si ha un eccesso di Ac, per avere una maggiore linearità del rapporto tra concentrazione dell Ag e gli immunocomplessi 13. Per la quantificazione vengono usate delle curve standard, dove la concentrazione crescente dell Ag o dell Ac sono note. 11 La figura 3.1 mostra la curva di Heidelberg, che descrive graficamente i rapporti di precipitazione. Risulta quindi facile osservare che per uno stesso valore di precipitato (asse delle y), corrispondono due regioni differenti. Una di queste si troverà nell eccedenza dell Ac mentre l altra nell eccedenza dell Ag. Quest effetto è molto importante e deve sempre essere tenuto presente per non incorrere in errori analitici. Nel caso in cui non si è sicuri da quale parte della curva si stia misurando, si può controllare eseguendo delle diluizioni appropriate. Se ci si trova nella regione dell eccesso di Ac, una diluizione dell Ag porterà ad una riduzione del precipitato, mentre si avrà un aumento nel caso in cui la situazione presenta un eccesso di Ag. 12 Il BN II dispone di un sistema di controllo per non incorrere in questo errore, infatti l apparecchio HIIHWWXDXQDSUHUHD]LRQHFRQXQTXDQWLWDWLYRPLQLPRGLFDPSLRQH /6HTXHVWDGDXQVHJQDOH superiore al limite di allarme presente nel programma, il nefelometro provvederà a diluire il campione e ripeterà la stessa preanalisi finchè la prereazione sarà sotto il limite di allarme: con questo sistema il BN II sa che il segnale corrisponde al valore che sta a sinistra della curva d equilibrio e calcolerà il risultato in base alle diluizioni effettuate. Quando la prereazione iniziale è sotto il valore di allarme, l apparecchio provvede quindi da aggiungere il resto del campione necessario ed esegue normalmente l analisi. )LJXUD 14

15 Materiali e metodi &XUYDGL+HLGHOEHUJODFRQFHQWUD]LRQHGHOO $FSUHVHQWHQHOODUHD]LRQHqFRVWDQWHPHQWUHDXPHQWD JUDGXDOPHQWHTXHOODGHOO $JDVVH[/ DVVHGHOOH\PRVWUDO DXPHQWRGHOSUHFLSLWDWRSURSRU]LRQDOPHQWHDOOD GLPLQX]LRQHGHOO $FLQHFFHVVRILQRDUDJJLXQJHUHXQPDVVLPRQHOOD]RQDGLHTXLYDOHQ]DSHUSRLVFLRJOLHUVL TXDQGRO $JqLQHFFHGHQ]D 13 Il fascio di luce (lampada al laser) è direzionato verso il campione contenente gli immunocomplessi. Il raggio colpisce quindi le particelle formatisi dal legame tra Ag/Ac (immunocomplessi) diffondendosi in tutte le direzioni. La luce riflessa con un angolazione particolare, viene quantificata da un detettore. Ad esempio, il nefelometro utilizzato per questo studio (BN II) possiede un raggio di luce con una lunghezza d onda di 840 nm, l angolo per la quantificazione è situato fra i 13 e 24, e gli immunocomplessi raggiungono una grandezza che possono superare i nm di diametro. 11 )LJXUD 3ULQFLSLRGHOODQHIHORPHWULD 11 5HDOL]]D]LRQHJUDILFL Visto che le flc possiedono una scala molto diversa dalle catene totali, si è pensato di realizzare dei grafici con i valori di normalizzazione. Per cui, per poter ottenere i valori normalizzati si è diviso il valore ottenuto per il valore di riferimento: Valore normalizzato = Valore ottenuto/valore di riferimento 15

16 Risultati 5LVXOWDWL Tutti i risultati dei pazienti considerati sono stati raccolti in una tabella per essere analizzati. Qui di seguito si può osservare la tabella in questione in cui sono presenti tutti i risultati ottenuti nelle GHWHUPLQD]LRQLFDWHQHWRWDOLHOLEHUHNDSSDHODPEGDFLVWDWLQD& PLFURJOREXOLQDHSURWHLQH totali) come pure i risultati dell ELSE e dell IF tratti dalla documentazione già esistente dei pazienti con l eventuale indicazione clinica. Il risultati dell ELSE e dell IF sono stati rappresentati con 3 lettere e cioè: œ N che indica un caso negativo, œ D che indica un caso dubbio e œ P che indica un caso positivo. Mentre il restante dei dati sono seguiti da + o -, indicando così se un valore si trova al di sopra (+) o al di sotto (-) dei valori di riferimento, indicati qui di seguito: - catene leggere totali kappa: g/l lambda: g/l - catene leggere libere kappa: mg/l lambda: mg/l kappa/lambda quoziente: cistatina C: mg/l PLFURJOREXOLQDPJ/ - proteine totali: g/l Si è visto che nel caso del paziente 8, le flc di tipo kappa sono maggiori delle catene totali di tipo kappa e, per problemi di tempo e di materiale a disposizione, non si è potuto ripetere l analisi. Perciò, bisogna tener conto di questo problema nell interpretazione di questi risultati. 16

17 + # "!. - (,. - (,. - (, Risultati *) ( # ' %& $ # #. - (,. - (,. - (,. - (, # -, 1 80 D N P Prob.gammopatia mon P P P P Mieloma multiplo Mieloma multiplo Mieloma multiplo P P P Mieloma multiplo Mieloma multiplo D N P D P P P P P Mieloma multiplo Mieloma multiplo P P P P P P Mieloma multiplo Mieloma multiplo D P P P Mieloma multiplo? Mieloma multiplo? Mieloma multiplo? P P P P Mieloma multiplo D P P P P P P P Mieloma multiplo Mieloma multiplo P P P P Sosp. Mieloma multiplo P P P P P P Mieloma multiplo P P Mieloma multiplo P P P P P P Sosp.Mieloma P P Sosp.Mieloma multiplo DEHOOD,QTXHVWDWDEHOODVRQRSUHVHQWLLGDWLRWWHQXWLQHOOHGHWHUPLQD]LRQL 17

18 Discussione 'LVFXVVLRQH Nella maggior parte dei casi (ca. 82%) vi è un aumento sia della cistatina C che della microglobulina. Infatti la cistatina C aumenta nei casi in cui la funzionalità glomerulare renale è FRPSURPHVVDPHQWUHOD PLFURJOREXOLQDè un marcatore tumorale che segnala un forte turnover (crescita clonale) di linfociti B indicando così la possibile presenza di plasmacellule cancerogene, ma è anche un indicatore dell attività renale se quantificato nell urina. Il loro aumento è giustificato dal fatto che sono stati analizzati campioni di pazienti affetti da MM o comunque con una paraproteinemia. Infatti una paraproteinemia, con il passare del tempo, può danneggiare i reni e di conseguenza compromettere la funzionalità renale. Le proteine totali, nella maggior parte dei casi, rientrano nei valori di riferimento, ma bisogna fare attenzione a giudicare questi risultati normali. Infatti, nel MM o nella paraproteinemia l aumento delle proteine totali è causato dall aumento delle proteine della fase acuta e dalla paraproteinemia stessa, ma quest aumento viene compensato sia da uno stato infiammatorio che porta alla diminuzione delle proteine totali, ed in particolar modo dell albumina, che dalla diminuzione delle Ig normali (Paraproteinemia 3)$,J $OEXPLQD Nei capitoli che seguiranno saranno evidenziati quattro aspetti fondamentali del metodo Freelite : 0DJJLRUHVHQVLELOLWjGHOPHWRGR)UHHOLWHŒ œ Il paziente 1, affetto da un insufficienza renale cronica, mostra un ELSE del siero e le catene totali normali, ma nonostante ciò vi è un aumento delle flc. Questo mostra la maggior sensibilità del metodo Freelite. Inoltre, l ELSE dell urina è risultata dubbia, infatti la banda non era chiara, per cui si sarebbe potuto anche non evidenziarla e di conseguenza tralasciare, almeno per i primi mesi, una probabile gammopatia monoclonale. œ I cromatogrammi dei pazienti 4 e 5 sono risultati dubbi, infatti nella regione gamma non vi era un picco monoclonale e ciò sarebbe potuto sfuggire all occhio dell osservatore, cosa che non sarebbe potuto accadere mediante la determinazione delle flc che sono risultate positive grazie alla maggiore sensibilità. œ Il paziente 11DIIHWWRGD00GLWLSR,J* PRVWUDXQDPHQWRGHOOHIOFGLWLSRNDSSDHFLò non è stato rilevato mediante le due IF (siero e urina), questo perché la sensibilità dell IF è inferiore a quella del nuovo metodo. Probabilmente se nei mesi successivi fosse stata eseguita un altra IF dell urina, forse si sarebbe potuto evidenziare anche la presenza di flc di tipo kappa, grazie alla maggiore concentrazione, ma a quel punto sarebbero trascorsi mesi, che potrebbero essere molto importanti per un eventuale modifica della terapia. 0HWRGR)UHHOLWHŒLQVRVWLWX]LRQHGHOO XULQDGHOOHRUH œ L IF del siero del paziente 14, probabilmente affetto da MM, ha mostrato una banda PRQRFORQDOHGLWLSR,J$ PHQWUHO,)GHOO XULQDKDHYLGHQ]LDWRXQDIRUWHEDQGD monoclonale nella regione kappa. Ciò spiega l aumento delle catene totali (4,51 g/l) e leggere libere (71.30 mg/l) di tipo kappa. Avendo però a disposizione la possibilità di determinare le flc si sarebbe potuto evitare di effettuare un IF dell urina delle 24 ore e 18

19 Discussione quindi creare di conseguenza meno disagi al paziente, ma si sarebbero potute evidenziare anche già ai primi stadi, cosa non possibile in questo caso per la scarsa sensibilità. œ Una situazione simile è stata rilevata nel paziente 15 dove l IF nel siero ha mostrato solo una SDUDSURWHLQHPLDGLWLSR,J* PHQWUHO,)QHOO XULQDKDHYLGHQ]LDWRXQ XOWHULRUHEDQGD monoclonale di tipo Bence Jones, quindi se non si avesse effettuato l IF nell urina, non si sarebbe vista la banda monoclonale di tipo Bence Jones oppure si sarebbe potuto evitare di far raccogliere al paziente le urine delle 24 ore, in quanto il metodo Freelite le avrebbe evidenziate grazie alla maggiore sensibilità. œ Il paziente 20DIIHWWRSUREDELOPHQWHGD00GLWLSR,J* SUHVHQWDXQDXPHQWRVRORGHOOH catene totali di tipo kappa (13.70 g/l), mentre le flc rientrano nella norma (13.70 mg/l). Grazie a quest ultima determinazione, il medico potrebbe escludere la presenza di catene leggere, in quanto normali, e potrebbe quindi indirizzarsi verso una gammopatia monoclonale dovuta all eccessiva produzione di Ig complete di tipo kappa senza il bisogno di effettuare l ELSE ed eventualmente l IF delle urine delle 24 ore. Bisogna inoltre considerare che i tubuli prossimali renali sono in grado di riassorbire fino a 30 g al giorno di flc, per cui vengono riscontrate nell urina solo quando vi è un alta produzione o un danno tubulare, rischiando così di non evidenziarle già ai primi stadi. 0HWRGR)UHHOLWHŒSHULOPRQLWRUDJJLRGHOODWHUDSLD Come mostrano i grafici dei pazienti 2, 10 e 13, a distanza di giorni, le flc diminuiscono più velocemente delle catene totali. Questo perché, come già detto, l emivita delle flc (2-4 ore) è molto più corta delle Ig complete (3 settimane). Inoltre, come mostra il grafico del paziente 2, le flc aumentano più velocemente delle catene totali, nel momento in cui vi è nuovamente una produzione delle Ig. / :9 6<; Q1RTSAU V8W:X VZY:[ P I G HNO O G MJ IL KJ H I F G w p n ouv v n tq ps rq o p m n = 4 Kappa totali Kappa libere >1?@7A4B9C? 03DAE5>1? D Kappa libere Kappa totali \^] _a`cbd]3ec`gfih1j8_k`ghl] 19

20 Discussione x1y3z5{ 8}:~ ZT Š ˆ ˆ Ž Š Œ Š ˆ Kappa libere Kappa totali { 1ƒ@}A{B~gƒ y3 A 5 1ƒ 8{ *UDILFL $QGDPHQWRGHOOHFDWHQHNDSSDWRWDOLHOLEHUH œ Paziente 2: grazie alla cartella clinica, si è venuti a conoscenza che il paziente, affetto da 00GLWLSR,J* KDHIIHWWXDWRXQGRSSLRDXWRWUDSLDQWRGLPLGROORRVVHRHGRSRGLFKè non ha ricevuto nessuna terapia. Il primo campione (giorno 0) è stato raccolto un giorno prima del secondo autotrapianto e si può osservare come a distanza di 15 giorni sia le catene totali che le flc diminuiscono (remissione). Si può inoltre notare che le flc diminuiscono più velocemente delle catene totali. Il fatto interessante è che il sedicesimo giorno, quindi a distanza di un giorno, le flc aumentano, mentre le catene totali rimangono quasi invariate. Questo potrebbe dunque essere un campanellino d allarme per il medico. 'DWDFDPSLRQLH œ Paziente 10LOSD]LHQWHDIIHWWRSUREDELOPHQWHGD00GLWLSR,J* DOPRPHQWRGHOOD raccolta del primo campione (giorno 0) non era sotto terapia, stando così stabile per diversi giorni. Il secondo campione, invece, è stato raccolto nel giorno in cui il paziente ha iniziato una terapia con cortisone e si può osservare come le flc diminuiscono più rapidamente delle catene totali. 'DWDFDPSLRQLH œ Paziente 13LOSD]LHQWHDIIHWWRGD00GLWLSR,J* KDULFHYXWRXQGRSSLRWUDSLDQWRGL midollo osseo ed ora è in remissione. Questa remissione è documentata nel grafico in cui si può osservare che le flc scendono più velocemente delle catene totali. 'DWDFDPSLRQLH 20

21 š Ì Discussione Invece, i grafici seguenti, dei pazienti 3, 6 e 8, mostrano che le flc aumentano in tempi più brevi delle catene totali. «ª ª T A 8 : < 0 28 Lambda libere Lambda totali œC i Cœ TžiŸ5 1œ ž à ¼ º»Á  º À½ ¼ ¾½» ¼ ¹ º ±:² <³ 0 76 Kappa totali Kappa libere µ1 C±i ²C T i 5µ1 Ä1ÅTÆAÇ È8É:Ê È<Ë Û Ô Ò ÓÙÚ Ú Ò ØÕ Ô ÖÕ Ó Ô Ñ Ò Kappa libere Kappa totali Ç Í1ÎCÉiÇ ÊCÎ ÅTÏiÐ5Í1Î Ï Ç *UDILFL $QGDPHQWRGHOOHFDWHQHWRWDOLHOLEHUH œ Paziente 3LOSD]LHQWHDIIHWWRGD00GLWLSR,J* GRSRFLFOLGL³$ONHUDQ (vedi allegato 1) e Prednison (vedi allegato 2) è ancora sotto terapia, infatti assume una volta alla settimana Intron A (vedi allegato 3) per il mantenimento. Nel grafico si può osservare che a distanza di 28 giorni le catene totali aumentano di poco, mentre le flc aumentano notevolmente. 'DWDFDPSLRQLH œ Paziente 6: grazie alla cartella clinica, si è venuti a conoscenza che il paziente, affetto da 00GLWLSR,J* è sotto terapia. Infatti dal , il paziente prende un medicamento di nome Myrim (vedi allegato 4) e visto che quest ultimo non portava benefici ma, anzi, vi era una progressione, il alla terapia si è aggiunto un ulteriore medicamento di nome Fortecortin (vedi allegato 5). 21

22 Discussione Questa progressione è documentata nel grafico in cui vi è un aumento sia delle catene totali che quelle libere. Quest ultime però aumentano più velocemente e ciò permetterebbe al medico di modificare la terapia in tempi più brevi. 'DWDFDPSLRQLH œ Paziente 8: una situazione simile è stata rilevata in questo caso, infatti il paziente, affetto da 00GLWLSR,J* GDODOSUHQGHYD³0\ULP (vedi allegato 4) ma, anche in questo caso, non vi è stato nessun miglioramento ma una progressione. Il grafico mostra, infatti, che il paziente non risponde alla terapia e che già a distanza di giorni le flc iniziano ad aumentare. 'DWDFDPSLRQLH Tutto ciò mostra come le flc siano più adatte nel seguire una terapia, infatti quest ultime aumentano o diminuiscono in tempi notevolmente più brevi. Inoltre, le flc potrebbero essere utilizzate come marcatori per una eventuale ricaduta e quindi per la valutazione del decorso. 22

23 Discussione 0HWRGR)UHHOLWHŒSHUXQDSURJQRVL Come mostra il grafico 7-3, tratto dalla pubblicazione Clinical Laboratory International del Prof. A. Bradwell, le flc possono essere un indice di sopravvivenza dal momento della diagnosi. Infatti lo studio, effettuato con 137 pazienti affetti da amiloidosi, ha dimostrato come il tempo di sopravvivenza aumenta con la diminuzione della concentrazione delle flc mediata da una chemioterapia. 14 *UDILFR /DVWXGLRLQSD]LHQWLDIIHWWLGDDPLORLGRVLPRVWUDFRPHODVRSUDYYLYHQ]DGLSHQGHGDOO HIILFDFLDGHOOD FKHPLRWHUDSLD 14 Grazie a questo studio possiamo quindi dire che il paziente 2 segue l andamento del primo grafico (flc >50%) con una maggiore probabilità di sopravvivenza, mentre i pazienti 10 e 13 seguono l andamento del secondo grafico (flc < 50%) ed infine i pazienti 3, 6 e 8 seguono l andamento dell ultimo grafico (flc non soppresse) con una probabilità di sopravvivenza molto ridotta. I pazienti 7, 9, 12, 16, 17, 18, e 19 non sono stati discussi in quanto non hanno dato nessun tipo di informazione allo studio. Questi dati devono comunque essere confermati, poiché sono stati seguiti dei pazienti affetti da MM e quest ultima è una malattia che ha un decorso molto lungo. Per cui si auspica che il progetto venga sviluppato maggiormente. 23

24 Conclusioni &RQFOXVLRQL Testando il metodo si è giunti alla conclusione che il test Freelite sarebbe utile in diverse circostanze: 1. evidenziare le flc nel siero anche in piccole concentrazioni grazie alla migliore sensibilità del metodo Freelite rispetto all ELSE e l IF, permettendo così al medico di diagnosticare un eventuale gammopatia monoclonale già ai primi stadi. 2. creare meno disagi al paziente ed evitare di cadere in errori preanalitici (raccolta errata da parte del paziente), sostituendo l ELSE e l IF delle urine delle 24 ore con la determinazione delle flc nel siero mediante il metodo Freelite. 3. permettere di valutare in modo migliore il successo di una terapia, sfruttando il fatto che le flc possiedono un emivita più breve delle catene totali. Inoltre, le flc possono essere utilizzate come marcatori per una eventuale ricaduta e quindi per la valutazione del decorso. 4. permettere di porre una prognosi, infatti le flc possono essere un indice di sopravvivenza dal momento della diagnosi. 24

25 Ringraziamenti Vorrei ringraziare il responsabile del progetto 5LQJUD]LDPHQWL œ Dr. Keller Franco, capo servizio di Immunologia Clinica di Bellinzona, per avermi aiutata nella realizzazione di questo studio; come pure œ il medico assistente Wannesson Luciano dell Istituto di Oncologia di Bellinzona, per avermi permesso di accedere alle cartelle cliniche dei pazienti; œ i laboratoristi medici (Bonocore Martina, Heusser H.Joerg, Sassi Elisa, Stoira Anna e Torrente Silvia) ed il capo laboratorio (Medici Graziano) del Laboratorio Centrale di Chimica ed Immunologia Clinica di Bellinzona, per avermi aiutata nella ricerca dei campioni e nella realizzazione delle analisi; œ la laboratorista medico Lucia Nesurini del Laboratorio di Ematologia Morfologica di Bellinzona, per avermi aiutata nella ricerca di pazienti; œ le insegnanti (Marcacci Daniela e Marci Sonia) e il Vice Direttore (Andrea Boffini) della Scuola Superiore Medico Tecnica di Locarno, per avermi aiutata nella realizzazione scritta del progetto. 25

26 Bibliografia %LEOLRJUDILD 1. Roitt I., Immunologia, Bologna, Ed. Zanichelli, 1998; Roitt I., Immunologia, Bologna, Ed. Zanichelli, 1998; Roitt I., Immunologia, Bologna, Ed. Zanichelli, 1998; D Onofrio G., Zini G., Morfologia del sangue, Roma, Ed. Verduci, 1997; Kaestli M., Roux-Lombard R., Labo Life, Ginevra, No.1, 1998; Kaestli M., Roux-Lombard R., Labo Life, Ginevra, No.1, 1998; D Onofrio G., Zini G., Morfologia del sangue, Roma, Ed. Verduci, 1997; The Binding Site Limited, 2003, 9. Bradwell A., Clinical laboratory international, University of Birmingham, 2003; 9 10.Le Carrer D., Electrophorèse et immunofixation des protéines sériques, France, Laboratoires Sebia, 1994; Keller F., Immunologia,dispense corso ; Keller F., Immunologia,dispense corso ; Grob P.J., Immunologie für Medizinstudenten, Universitätsspital Zürich, Wintersemester ; Bradwell A., Clinical laboratory international, University of Birmingham, 2003; D Onofrio G., Zini G., Morfologia del sangue, Roma, Ed. Verduci, 1997; D Onofrio G., Zini G., Morfologia del sangue, Roma, Ed. Verduci, 1997; Metodica contenuta nel kit Freelite della Binding Site (USA) 18. Foglietto illustrativo del medicamento, febbraio Foglietto illustrativo del medicamento, dicembre Foglietto illustrativo del medicamento, aprile Foglietto illustrativo del medicamento, settembre Foglietto illustrativo del medicamento, marzo

27 Allegati $OOHJDWL Ho ritenuto importante inserire degli allegati al progetto per completezza dello studio. Infatti, avendo seguito pazienti affetti da MM, mi è sembrato opportuno inserire delle informazioni sul midollo osseo, luogo in cui si sviluppa la malattia. Inoltre, avendo utilizzato campioni di pazienti in terapia, ho inserito le informazioni più importanti sui vari medicamenti permettendo così di avere una maggior chiarezza sui vari casi. In aggiunta, avendo dovuto programmare il nefelometro, mi è sembrato opportuno allegare la metodica del kit che ho seguito. 0RUIRORJLDGHOPLGROORRVVHR Il MM si comporta abitualmente come una neoplasia a espansione selettivamente midollare con aspetti quantitativi, qualitativi e topografici molto eterogenei. Dal punto di vista quantitativo la presenza di un infiltrazione di plasmacellule compresa tra 10 e il 20% mette in discussione la diagnosi differenziale nei confronti delle plasmocitosi reattive (Tab. 1.1), nelle quali l entità dell aumento delle plasmacellule mostra una buona correlazione con l ipergammaglobulinemia; per valori superiori al 20% il sospetto di infiltrazione midollare mielomatosa diviene consistente e oltre il 30% è soddisfatto un criterio diagnostico maggiore. Numerosi ricercatori hanno correlato la prognosi con la percentuale di infiltrazione mielomatosa alla diagnosi, direttamente connessa con la massa neoplastica: i pazienti che all esordio presentano un infiltrazione mielomatosa maggiore del 50% della cellularità midollare, hanno una sopravvivenza significativamente più breve rispetto ad altri. 15 0DODWWLH(PDWRORJLFKH Linfomi Hodgkin e non Hodgkin Malattie mieloproliferative Leucemie acute non linfoidi Anemia Aplastica Anemia emolitica autoimmune Anemia sideropenica e megaloblastica Porpora trompotica trombocitopenica Porpora trombocitopenica immunologica 0DODWWLHQRQHPDWRORJLFKH Infezioni batteriche, virali e protozoarie Malattie infiammatorie croniche Tumori: carcinoma del polmone e della prostata Farmaci: citotossici, penicillina e solfonamidi Condizioni varie: diabete mellito, amiloidosi 7DEHOOD 3ULQFLSDOLFRQGL]LRQLDVVRFLDWHDSODVPRFLWRVLPLGROODUHUHDWWLYD 15 27

28 Allegati 0RUIRORJLDGHOOHSODVPDFHOOXOH Gli aspetti morfologici di maturità o immaturità cellulare non rappresentano un criterio assoluto per la diagnosi differenziale nei casi con infiltrazione moderata, perché molti mielomi alla diagnosi hanno un infiltrazione di plasmacellule morfologicamente indistinguibili da quelle normali. Si tratta GLFHOOXOHRYRLGDOLFRQGLDPHWURPDJJLRUHGL PHLQIHULRULGL PLOQXFOHRè sempre eccentrico, quasi polare, con profilo ovale: l asse maggiore del nucleo è in genere orientato perpendicolarmente all asse maggiore del citoplasma. Il nucleolo non è visibile con le colorazioni panottiche, pur essendo sempre evidenziabile con il microscopio elettronico. La cromatina è azzollata in grossolani cromocentri (in media da sette a nove) dal contorno poligonale, disposti caratteristicamente alla periferia della membrana nucleare (cromatina a ruota di carro). Quadri midollare di plasmocitosi reattiva, d altra parte, possono comprendere elementi con atipie e immaturità nucleari e citoplasmtiche. Non è eccezionale, ad esempio, trovare anche nei soggetti normali alcuni elementi binucleati o addirittura con tre o più nuclei. Le cariocinesi plasmacellulari sono sempre molto rare: spesso si tratta di divisioni nucleari amitotiche che avvengono per strozzamento centrale e progressivo del nucleo o per gemmazione e distacco della porzione gemmata (nuclei di dimensioni differenti), non seguite da citodieresi. L eccentricità dei nuclei è legata alla presenza di un grosso centrosoma incolore o debolmente acidofilo situato quasi sempre in prossimità del nucleo (area chiara paranucleare, arcoplasma), espressione del particolare sviluppo dell apparati di Golgi in queste cellule. Il restante citoplasma è intensamente basofilo per la presenza di numerosi granuli di ribonucleoproteine che aderiscono alla superficie esterna dei sacchi del reticolo endoplasmatico rugoso, che in queste cellule è molto sviluppato. E anche possibile individuare nel citoplasma alcune areole chiare, rotonde o ovalari, che sono immagini al negativo dei mitocondri, e alcuni granuli di secrezione. Nel citoplasma delle plasmacellule si osservano a volte vacuoli ialini di numero e grandezza variabile, nonché passerelle più o meno omogenee che prendono il nome di di corpi di Russel dell autore che li descrisse per primo nel 1890, intepretandoli come parassiti cellulari presenti nelle neoplasie. 16 )LJXUD $VSLUDWRPLGROODUHSUHVHQ]DGLSODVPDFHOOXOH 15 28

29 Allegati 3URJUDPPD]LRQHQHIHORPHWUR 17 29

30 Allegati $ONHUDQ Š 18 30

31 Allegati 3UHGQLVRQ Š 19 31

32 Allegati,QWURQ$ Š 20 32

33 Allegati 0\ULP Š Il medicamento Myrim contiene come sostanza il Thalidomide: 21 33

34 Allegati )RUWHFRUWLQ Š 22 34