Y Chromosome AZF Analysis System

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1 TECHNICAL MANUAL Y Chromosome AZF Analysis System 2800 Woods Hollow Rd. Madison, WI USA Dispositivo medico diagnostico in vitro MDSS GmbH Schiffgraben Hanover, Germania ISTRUZIONI PER L USO DEL PRODOTTO MD1631 Printed in USA

2 Y Chromosome AZF Analysis System Manuale tecnico TM252 ISTRUZIONI PER L USO DEL PRODOTTO MD1631. Tutta la letteratura tecnica è disponibile su Internet all indirizzo Visitare il sito web per verificare che si stia utilizzando la versione più aggiornata del presente manuale tecnico. 1. Uso previsto del prodotto Descrizione Componenti del prodotto Considerazioni generali...3 A. Campione modello di DNA...3 B. Condizioni della PCR...4 C. Termociclatori...4 D. Controllo della contaminazione...5 E. Reazioni di controllo...5 MDSS GmbH Schiffgraben Hanover, Germania 5. Reazioni di amplificazione...5 A. Preparazione delle reazioni...6 B. Protocollo ottimale per cicli termici PCR per l'uso con termociclatore Perkin-Elmer Model C. Elettroforesi su gel d agarosio...8 D. Analisi dei dati Controlli...9 E. Analisi dei dati Campioni sperimentali Bibliografia Appendice...11 A. Composizione dei tamponi e delle soluzioni...11 B. Fogli di lavoro Uso previsto del prodotto Il sistema Y Chromosome AZF Analysis System (a ) soddisfa i requisiti della Direttiva UE 98/79/CE sui dispositivi medicali per diagnosi in vitro. Il sistema Y Chromosome AZF Analysis System rappresenta un metodo basato su tecnica PRC mutiplex per analizzare l'integrità della regione AZF del cromosoma umano Y. Il sistema Y Chromosome AZF Analysis System deve essere usato nell'ambito di un iter diagnostico finalizzato a caratterizzare l'infertilità maschile. I risultati diagnostici ottenuti mediante questo sistema devono essere interpretati insieme ad altri dati clinici o di laboratorio. Queste informazioni sono potenzialmente utili per i pazienti che intendono sottoporsi alla fertilizzazione in vitro, poiché le delezioni enlla regione AZF del cromosoma Y si trasmettono ai figli maschi generati mediante fertilizzazione in vitro, determinando l'infertilità della prole di sesso maschile. ITALIANO Page 1

3 2. Descrizione Il sistema Y Chromosome AZF Analysis System rappresenta un metodo per la rilevazione della regione AZF del cromosoma umano Y. Il sistema consiste in 20 coppie di primer omologhi a siti precedentemente identificati e mappati (STS; 1-7). Quando vengono usati in reazioni a catena della polimerasi (PCR; 6, 8), questi primer amplificano i bracci corti di DNA non polimorfo del cromosoma Y. I primer sono stati combinati in cinque gruppi Multiplex Master Mix da utilizzare nella PCR multiplex. Ciò consente di determinare la presenza o l assenza di tutti i 20 STS eseguendo cinque amplificazioni con PCR concomitanti (Figura 1). Le delezioni del cromosoma Y nelle regioni amplificate mediante questi gruppi di primer sono state associate all infertilità maschile (1,2,6,9-17). Le adiacenti regioni del cromosoma Y generalmente non si presentano come prodotti di amplificazione in sequenza all interno di una singola reazione di amplificazione multiplex. Le eccezioni sono SY242 e SY208 del locus DAZ, che sono rappresentati come prodotti di amplificazione in sequenza usando reazioni Multiplex B Master Mix, e SY84 e SY86 dei loci DYS273 e DYS148, che sono rappresentati come prodotti di amplificazione in sequenza nelle reazioni Multiplex E Master Mix. Multiplex Master Mixes A-D contiene una coppia di primer di controllo che amplifica i frammenti del locus SMCX (X-linked). Il quinto Multiplex Master Mix, Multiplex E, contiene una coppia di primer di controllo che amplifica una regione esclusiva nel DNA sia maschile che femminile (ZFX/ZFY). Queste coppie di primer di controllo sono controlli interni per le reazioni di amplificazione multiplex e verificano l integrità del campione di DNA genomico. Infine, Multiplex E Master Mix include anche una coppia di primer che amplifica una regione del gene SRY, agendo da amplificazione di controllo per il fattore determinante la formazione del testicolo (TDF, testis-determining factor) sul braccio corto del cromosoma umano Y. bp M A 1 2 M B 3 4 M C 5 6 M D E 7 8 M 9 10 M TA09_3A Figura 1. Esempio di amplificazione del DNA genomico maschile. Amplificazione del DNA genomico maschile (MD115A) (corsie 1, 3, 5, 7, 9), nonché controllo negativo di DNA (corsie 2, 4, 6, 8, 10), per ciascuno dei cinque Multiplex Master Mix. Page 2

4 3. Componenti del prodotto Prodotto Dim. N. di cat. Y Chromosome AZF Analysis System 25 reazioni MD1631 Non destinato alla vendita negli Stati Uniti. Solo per l esportazione. Il sistema Y Chromosome AZF Analysis System include: 10 C Simboli 30 C MD154A Multiplex A Master Mix 500 µl MD155A Multiplex B Master Mix 500 µl MD156A Multiplex C Master Mix 500 µl MD157A Multiplex D Master Mix 500 µl MD158A Multiplex E Master Mix 500 µl M300C GoTaq DNA Polymerase (c) 200 u P119F Nuclease-Free Water 1,25 ml G452C 50bp DNA Step Ladder (340 ng/µl) 90 µg MD115A Male Genomic DNA (50 ng/µl) 2,5 µg G190B Blue/Orange 6X Loading Dye 1 ml Dispositivo medico diagnostico in vitro 30 C 10 C Conservare a -10 a 30 C Condizioni di conservazione: conservare tutti i componenti a 10 a 30 C. Evitare di congelarli e scongelarli più volte. MDSS GmbH Schiffgraben Hanover, Germania <n> Contenuto sufficiente per n test 4. Considerazioni generali A. Campione modello di DNA La concentrazione, la purezza e la quantità del DNA sono considerazioni importanti per garantire il successo dell analisi con il sistema Y Chromosome AZF Analysis System. Un DNA di qualità scadente può determinare un aumento del fondo o compromettere la riuscita dell amplificazione. La mancata riuscita dell amplificazione può manifestarsi con la completa assenza di amplificazione di tutte le bande con tutti i Mutiplex Master Mix o la sparizione delle sottopopolazioni degli alleli nei singoli master mix. Per evitare ciò, utilizzare solo DNA di alta qualità con una percentuale di assorbanza A 260 /A 280 1,8. Il DNA non deve essere tagliato e deve essere privo di contaminazione da proteine, etanolo o sali (soprattutto EDTA; la concentrazione di EDTA deve essere <0,4 mm). Misurare con precisione il DNA prima di usarlo con il sistema Y Chromosome AZF Analysis System, poiché l utilizzo di una quantità eccessiva o insufficiente di DNA può determinare la mancata riuscita delle reazioni. Le letture spettrofotometriche (assorbanza) a 260 nm (A 260 ) possono essere usate per la stima della concentrazione del DNA dove 1 Au = 50 µg di DNA a doppio filamento/ml. In ciascuna reazione di amplificazione con PCR si devono utilizzare cinquanta nanogrammi di DNA. La concentrazione di DNA può essere sovrastimata dalla spettrofotometria se il rapporto A 260 /A 280 è basso o se il valore dell assorbanza è basso (inferiore a 0,1). Rappresentante autorizzato ITALIANO Page 3

5 B. Condizioni della PCR Nei Multiplex Master Mix conservati a 20 C si possono formare gradienti di concentrazione. Dopo lo scongelamento, agitare ciascuna provetta su vortex per secondi prima dell'uso. Preriscaldare lo strumento fino a 94 C prima di collocare le provette al suo interno. Non usare più di 1 u di GoTaq DNA Polymerase per ciascuna reazione di amplificazione con PRC multiplex. I normali volumi PCR finali usando il sistema Y Chromosome AZF Analysis System sono di 25µl. Volumi PCR di 12,5 µl possono determinare l'assenza di bande multiple e non vanno usati. C. Termociclatori Il sistema Y Chromosome AZF Analysis System è stato ottimizzato per l'uso con il Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480. L'uso di altri termociclatori richiede l'ottimizzazione e la validazione del protocollo da parte dell'utente. Si raccomanda di usare esclusivamente provette con pareti sottili. Per il termociclatore Perkin-Elmer Model 480 usare provette di reazione GeneAmp da 0,5 ml a pareti sottili. 1. Termociclatori con coperchio riscaldato e non riscaldato I termociclatori sono disponibili con coperchio riscaldato o non riscaldato. Per i termociclatori con coperchio non riscaldato (il Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480), è necessario coprire la reazione con olio minerale per impedire l evaporazione durante i cicli termici. Per i termociclatori con coperchio riscaldato, la copertura con olio minerale non è necessaria. Il coperchio riscaldato di questi termociclatori impedisce l evaporazione della reazione durante i cicli termici. Verificare però che il coperchio riscaldato funzioni correttamente. Un indicazione che il coperchio riscaldato di un termociclatore non funziona è data dalla presenza di condensa nel coperchio e intorno alla parte superiore delle provette di reazione amplificate; i risultati inoltre possono indicare una esecuzione non corretta delle amplificazioni. Se non si è sicuri riguardo alla calibrazione del coperchio riscaldato o si nota la presenza di condensa nella provetta di reazione, coprire con olio minerale. 2. Velocità di riscaldamento/raffreddamento del termociclatore Il tempo che un termociclatore impiega per il passaggio dalle temperature di denaturazione, ibridazione ed estensione dei profili nei cicli termici della PCR (spesso chiamato "tempo di rampa") può influire sull'efficienza dell'amplificazione con PCR. La velocità con cui un termociclatore passa alle diverse temperature di un profilo di cicli termici della PCR dipende dalla sua fabbricazione. Il protocollo dei cicli termici della PRC è stato otimizzato per il termociclatore Perkin-Elmer Model 480. L'uso di altri termociclatori richiede la validazione dei tempi di rampa da parte dell'utente. 3. Calibrazione dell apparecchiatura Il successo dell amplificazione con PCR, soprattutto nella PCR multiplex, dipende dall accuratezza dei cicli termici. Verificare che il termociclatore utilizzato con il sistema Y Chromosome AZF Analysis System sia calibrato. Page 4

6 D. Controllo della contaminazione È fondamentale evitare la contaminazione da DNA dei componenti della reazione. Per evitare la contaminazione, occorre isolare le aree di pre-amplificazione e postamplificazione, destinando preferibilmente stanze separate. Utilizzare sempre puntali per pipette resistenti alla formazione di aerosol, pipette dedicate per la preparazione delle reazioni, guanti monouso puliti ed evitare la contaminazione da trasporto delle soluzioni madre. Le workstation e le pipette devono essere pulite con una soluzione candeggiante neutra prima e dopo l uso. E. Reazioni di controllo Con ciascun esperimento occorre includere reazioni di controllo idonee. 1. Le reazioni di amplificazione usando come modello il controllo positivo con Male Genomic DNA fornito devono sempre essere eseguite in parallelo con i campioni. L amplificazione con PCR del controllo positivo con Male Genomic DNA fornito deve sempre generare i risultati di amplificazione attesi (consultare la sezione 7.B, Tabella 1, per le quantità attese). 2. In parallelo con i campioni occorre anche eseguire una reazione di amplificazione con PCR del controllo negativo senza DNA per verificare che i reagenti non siano contaminati da DNA. L amplificazione con PCR di un controllo senza DNA non deve produrre risultati di amplificazione. 5. Reazioni di amplificazione Materiali che devono essere forniti dall operatore (Le composizioni delle soluzioni sono fornite nell Appendice, Sezione 7.A.) Olio minerale leggero senza nucleasi Termociclatore Provette di amplificazione a pareti sottili Per il Perkin-Elmer DNA Thermal Cycler 480, usare provette di reazione GeneAmp da 0,5 ml a pareti sottili (Applied Biosystems Part# N , N , o N ) Gel d'agarosio preformato: 4% NuSieve 3:1 e minigel Reliant d'agarosio preformati in tampone TBE (Cambrex Cat.# 54927, o 54929) Tampone TBE 1X Bromuro di etidio Puntali per pipette resistenti alla formazione di aerosol Transilluminatore UV ITALIANO Page 5

7 A. Preparazione delle reazioni La Figura 2 illustra un diagramma riepilogativo del protocollo di preparazione delle reazioni. In questa procedura, aliquote di DNA campione vengono collocate in una provetta di reazione. Separatamente, la Taq DNA polimerasi viene aggiunta a ciascuno dei Multiplex Master Mix. Quindi, il Multiplex Master Mix contenente la Taq DNA polimerasi viene aggiunto alle provette di reazione contenenti il DNA campione. Ciascun campione di DNA viene analizzato usando ciascuno dei Multiplex Master Mix. Diluire il DNA campione (in Nuclease-Free Water) e preparare i controlli Preparare le miscele di Multiplex Master Mix e Taq DNA polimerasi, una per ciascun Multiplex Master Mix. DNA campione Controllo positivo con Male Genomic DNA Controllo negativo senza DNA Preparare le reazioni: 1. Collocare il DNA campione Multiplex o il controllo nelle provette. Master Mix per ciascun campione 2. Aggiungere la miscela di Multiplex Master Mix e Taq DNA polimerasi. A B C D Taq DNA polimerasi per ciascun campione E DNA Controllo campione positivo Controllo negativo A B C Cicli termici D E Elettroforesi su gel d'agarosio 3856MA10_2A Figura 2. Rappresentazione schematica dell analisi con il sistema Y Chromosome AZF Analysis System. Page 6

8 1. Scongelare i Multiplex Master Mix, la Nuclease-Free Water e il Male Genomic DNA in ghiaccio. Una volta scongelati, conservare i prodotti in ghiaccio. Agitare i Multiplex Master Mix su vortex per 5 10 secondi prima di usarli. 2. Compilare la tabella sottostante per determinare il numero di reazioni per ciascun Multiplex Master Mix. Per ciascun campione di DNA vi sono cinque provette di reazione, una per ciascun Multiplex Master Mix. Includere un controllo positivo con Male Genomic DNA e un controllo negativo senza DNA per ciascun Multiplex Master Mix. N. di Controllo Controllo Totale Multiplex campioni positivo con Male negativo provette di Master Mix DNA Genomic DNA senza DNA reazione A 1 1 B 1 1 C 1 1 D 1 1 E Preparare ed etichettare il numero necessario di provette di reazione come stabilito sopra. Utilizzare provette di amplificazione con pareti sottili. Collocare le provette di reazione nel ghiaccio. 4. In una provetta separata, diluire ciascun campione di DNA in 10 ng/µl usando la Nuclease-Free Water fornita. Miscelare bene su vortex per 5 10 secondi. Aggiungere 5 µl di DNA diluito alle provette di reazione con l etichetta corretta poste nel ghiaccio. Controllo positivo con campione di DNA: per il controllo positivo con campione di Male Genomic DNA, diluire il Male Genomic DNA in 10 ng/µl aggiungendo 6 µl di Male Genomic DNA in 24 µl di Nuclease-Free Water. Miscelare bene su vortex per 5 10 secondi. Aggiungere 5 µl nelle provette di reazione con l etichetta corretta poste nel ghiaccio. Controllo negativo senza DNA: per il controllo negativo (senza DNA), aggiungere 5 µl di Nuclease-Free Water nelle provette di reazione con l etichetta corretta poste nel ghiaccio. 5. Preparare cinque miscele Multiplex Master Mix/GoTaq DNA polimerasi in ghiaccio, una per ciascun Multiplex Master Mix. Agitare i Multiplex Master Mix su vortex prima di usarli. Volume per Volume per Componente reazione 10 reazioni Multiplex Master Mix 20 µl 200 µl GoTaq DNA polimerasi (5 u/µl) 0,2 µl 2 µl Volume finale 20,2 µl 202 µl 6. Agitare su vortex per miscelare. 7. Aggiungere 20 µl della miscela Multiplex Master Mix/GoTaq DNA polimerasi alle provette di reazione appropriate, contenenti il DNA campione o i controlli, poste nel ghiaccio. 8. Agitare delicatamente su vortex per miscelare. ITALIANO Page 7

9 9. Centrifugare brevemente le provette per portare il contenuto sul fondo delle provette. Collocare le provette di reazione nel ghiaccio finché si è pronti per i cicli termici. 10. Per i termociclatori con coperchio non riscaldato (ad esempio il Perkin-Elmer Model 480) è necessario coprire le reazioni nella provetta di reazione con olio minerale. Inclinare le provette e aggiungere una goccia di olio sul lato della provetta, permettendo all olio di scorrere in basso lungo il lato della provetta. B. Protocollo ottimale per cicli termici PCR per l'uso con termociclatore Perkin-Elmer Model 480 Il seguente protocollo è stato otimizzato per il termociclatore Perkin-Elmer Model 480. Se usa un termociclatore diverso, l'utente è tenuto ad eseguire l'ottimizzazione e la validazione del protocollo. È fondamentale preriscaldare lo strumento fino a 94 C prima di collocare le provette al suo interno. Termociclatore Provette di reazione DNA polimerasi Condizioni della PCR Model ml GeneAmp a pareti sottili GoTaq DNA Polymerase 94 C per 2 minuti, quindi 94 C per 1 minuto 57 C per 30 secondi 72 C per 1 minuto Ripetere per 35 cicli, quindi: 72 C per 5 minuti immergere a 4 C C. Elettroforesi su gel d agarosio 4% NuSieve 3:1 e minigel Reliant preformati in tampone TBE (Cambrex, n. di cat , o 54929) sono necessari per l elettroforesi e la successiva visualizzazione ottimale dei prodotti di amplificazione. 1. Diluire il marker di peso molecolare come segue: Componente Volume 50bp DNA Step Ladder 12 µl Blue/Orange 6X Loading Dye 4 µl Nuclease-Free Water 8 µl 2. Aggiungere 2,5 µl di Blue/Orange 6X Loading Dye a ciascuna provetta di amplificazione e miscelare. 3. Caricare 10 µl del marker di peso molecolare diluito sul primo pozzetto del gel. 4. Caricare 10 µl/pozzetto di ciascun campione. 5. Caricare 10 µl del marker di peso molecolare diluito sull ultimo pozzetto del gel. Page 8

10 6. Analizzare il gel in TBE 1X contenente 0,5 µg/ml di bromuro di etidio a 5 V/cm (misurato come la distanza tra gli elettrodi) finché il blu di bromofenolo non migra sul fondo del gel. 7. Fotografare il gel usando un transilluminatore UV (320 nm). D. Analisi dei dati Controlli Prima di analizzare i campioni, determinare che le reazioni di controllo abbiano prodotto i risultati attesi. I fogli di lavoro forniti (consultare la sezione 7.B, Tabella 1) possono essere usati sia per l analisi dei controlli che dei campioni sperimentali. 1. Controllo negativo senza DNA Non vi dovrebbero essere prodotti di amplificazione specifici nelle corsie contenenti le reazioni con il controllo negativo senza DNA. Vi potrebbero essere bande o strisce di basso peso molecolare dovute alle interazioni dei primer. I risultati non devono essere considerati validi se nelle reazioni con controllo negativo senza DNA si osservano prodotti di amplificazione. Ciò indica la presenza di contaminazione da DNA e l esperimento va ripetuto prestando attenzione a evitare la contaminazione. 2. Controllo positivo con Male Genomic DNA Nella Tabella 1 (sezione 7.B) sono indicati il numero e la quantità dei prodotti di amplificazione per ciascun Multiplex Master Mix. La reazione con controllo positivo contenente Male Genomic DNA per ciascun Multiplex Master Mix deve presentare tutte le bande indicate per il Multiplex Master Mix specifico (sezione 7.B, Tabella 1). Le quantità dei prodotti di amplificazione possono essere stimate mediante un confronto con il marker 50bp DNA Step Ladder analizzato sul gel. Se non tutte le bande attese sono presenti nelle reazioni con il controllo positivo contenente Male Genomic DNA, o se vi sono bande supplementari prominenti, significa che vi sono problemi con i reagenti di amplificazione o con il termociclatore. I risultati non devono essere considerati validi se nelle reazioni con il controllo positivo contenente Male Genomic DNA si osserva l assenza di uno qualsiasi dei prodotti di amplificazione attesi. 3. Primer di controllo nei Multiplex Master Mix Nelle reazioni con Multiplex A, B, C e D Master Mix, si deve osservare la generazione del più piccolo prodotto di amplificazione (83bp) da un locus SMCX (X-linked). Nel Multiplex E Master Mix, si deve osservare la generazione del più grande prodotto di amplificazione (496bp) dai geni ZFY/ZFX. L assenza di questi prodotti indica un problema relativo a quella particolare amplificazione con PCR multiplex. Se queste bande di controllo sono presenti con il controllo positivo contenente Male Genomic DNA ma non con il DNA campione, significa che potrebbe esservi un problema con il DNA genomico usato come modello. Possibili problemi con il DNA campione: presenza di impurità, misurazioni non accurate del DNA o DNA deteriorato. Verificare il DNA modello su un gel d agarosio prima di ripetere l amplificazione. Ripetere le amplificazioni dalle reazioni con DNA campione nelle quali il prodotto di controllo è assente. Potrebbe essere necessario isolare nuovamente il DNA genomico modello. ITALIANO Page 9

11 E. Analisi dei dati Campioni sperimentali I fogli di lavoro forniti nell'appendice (sezione 7.B) possono essere usati per l'analisi di campioni sperimentali. Determinare la presenza o l'assenza dei prodotti di PCR attesi (sezione 7.B, Tabella 1). I prodotti eventualmente mancanti dalle reazioni possono essere mappati usando il foglio di lavoro della mappa del cromosoma Y (sezione 7.B, Tabella 2). Tutte le delezioni devono essere contigue. Se per un campione mancano più bande di amplificazione, e tali bande non sono mappate in regioni adiacenti del cromosoma Y (sezione 7.B, Tabella 2), esse rappresentano bande mancanti, non delezioni. In questo caso il test deve essere ripetuto. Una sola banda di amplificazione mancante in un campione può rappresentare una banda assente e il test deve essere ripetuto per confermare che il locus non si amplifica. Si noti che un locus presente in un campione può non amplificarsi, se esiste una mutazione di uno dei siti di legame primer per il locus. I risultati diagnostici ottenuti mediante questo sistema possono essere interpretati solo insieme ad altri dati clinici o di laboratorio. La figura 3 mostra un esempio di analisi su gel del DNA campione che evidenzia una delezione del cromosoma Y dalle posizioni da 15 a 20 nella mappa. A B C D E 1 M 2 3 M 4 5 M 6 7 M 8 9 M TA Figura 3. Esempio di analisi su gel che evidenzia delezioni del cromosoma Y. Sono illustrati i prodotti di amplificazione ottenuti dalle reazioni con i Multiplex A-E Master Mix. Ciascun Multiplex Master Mix viene utilizzato per l amplificazione di campioni con Male Genomic DNA (MD115A) (corsie 1, 3, 5, 7, 9) e di un campione rappresentativo contenente delezioni del cromosoma Y (corsie 2, 4, 6, 8, 10). Le bande ottenute dall amplificazione del controllo positivo con Male Genomic DNA vengono confrontate alle bande ottenute dal DNA genomico del test con delezioni del cromosoma Y (notare le bande delete in tutte queste corsie tranne che nel Multiplex E). Il marker (corsie M) è il 50bp DNA Step Ladder fornito con il sistema. Sono state osservate bande non specifiche sopra o sotto i prodotti di amplificazione attesi sul gel d agarosio in particolare una banda debole è stata osservata in Multiplex D a circa 150bp e in Multiplex E sopra il controllo. Verificare che i controlli negativi in uso (amplificazioni senza campione di DNA) mostrino prodotti di amplificazione senza PCR rilevabili. Se i controlli negativi non mostrano prodotti di amplificazione con PCR, le bande non specifiche non hanno alcun effetto sull analisi. Nota: E possibile osservare un amplificazione del locus SY133 in alcuni individui con una delezione della regione AZFb, suggerendo che questo locus possa essere ripetuto anche in altre parti del cromosoma. Page 10

12 6. Bibliografia 1. Vollrath, D. et al. (1992) The human Y chromosome: A 43-interval map based on naturally occurring deletions. Science 258, Reijo, R. et al. (1995) Diverse spermatogenic defects in humans caused by Y chromosome deletions encompassing a novel RNA-binding protein gene. Nature Genet. 10, Foote, S. et al. (1992) The human Y chromosome: Overlapping DNA clones spanning the euchromatic region. Science 258, Affara, N. et al. (1996) Report of the second international workshop on Y chromosome mapping Cytogenet. Cell. Genet. 73, Kent-First, M.G. et al. (1996) Gene sequence and evolutionary conservation of human SMCY. Nat. Genet. 14, Kent-First, M.G. et al. (1999) Defining regions of the Y-chromosome responsible for male infertility and identification of a fourth AZF region (AZFd) by Y-chromosome microdeletion detection. Mol. Reprod. and Dev. 53, Vogt, P.H. et al. (1997) Report of the third international workshop on Y-chromosome mapping Cytogenet. Cell Genet. 79, Skaletsky, H. et al. (2003) The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes. Nature 423, Pryor, J.L. et al. (1997) Microdeletions in the Y chromosome of infertile men. New Eng. J. Med. 336, Kent-First, M.G. et al. (1996) The incidence and possible relevance of Y-linked microdeletions in babies born after intracytoplasmic sperm injections and their fathers. Mol. Hum. Reprod. 2, Kostiner, D.R., Turek, P.K. and Reijo, R.A. (1998) Male infertility: Analysis of the markers and genes on the human Y chromosome. Hum. Reprod. 13, Kuroda-Kawaguchi, T. et al. (2001) The AZFc region of the Y chromosome features massive palindromes and uniform recurrent deletions in infertile men. Nat. Genet. 29, Lahn, B.T. and Page, D.C. (1997) Functional coherence of the human Y chromosome. Science 278, Reijo, R. et al. (1996) Severe oligozoospermia resulting from deletions of azoospermia factor gene on Y chromosome. Lancet 347, Repping, S. et al. (2002) Recombination between palindromes P5 and P1 on the human Y chromosome causes massive deletions and spermatogenic failure. Am. J. Hum. Genet. 71, Saxena, R. et al. (1996) The DAZ gene cluster on the human Y chromosome arose from an autosomal gene that was transposed, repeatedly amplified and pruned. Nat. Genet. 14, Simoni, M. et al. (1999) Laboratory guidelines for molecular diagnosis of Y-chromosomal microdeletions. Int. J. Androl. 22, ITALIANO 7. Appendice A. Composizione dei tamponi e delle soluzioni Tampone TBE 1X 89 mm Tris base 110 mm acido borico 2 mm EDTA Page 11

13 B. Fogli di lavoro Tabella 1. Profilo dei prodotti di amplificazione con PCR per campioni del test Annotare la presenza (+) o l assenza ( ) dei prodotti di amplificazione con PCR attesi per ciascun campione sperimentale. Multiplex A Master Mix Campioni (+/ ) Quantità di Posizione STS Locus prodotto (bp) sulla mappa SY254 DAZ SY157 DYS SY81 DYS SY130 DYS SY182 KAL-Y SMCX 83 Controllo Multiplex B Master Mix Campioni (+/ ) Quantità di Posizione STS Locus prodotto (bp) sulla mappa SYPR3 SMCY SY127 DYS SY242 DAZ SY208 DAZ SMCX 83 Controllo Multiplex C Master Mix Campioni (+/ ) Quantità di Posizione STS Locus prodotto (bp) sulla mappa SY128 DYS SY121 DYS SY145 DYF51S SY255 DAZ SMCX 83 Controllo Multiplex D Master Mix Campioni (+/ ) Quantità di Posizione STS Locus prodotto (bp) sulla mappa SY133 DYS SY152 DYS SY124 DYS SMCX 83 Controllo Multiplex E Master Mix Campioni (+/ ) Quantità di Posizione STS Locus prodotto (bp) sulla mappa ZFX/ZFY 496 Controllo SY14 SRY SY134 DYS SY86 DYS SY84 DYS Page 12

14 4320MA09_3A ITALIANO CSF2RA IL3RA ANT3 ASMT XE7 MIC2p MIC2 SRY RPS4Y ZFY TSPY AMELY Centromero KAL-Y SMCY DYZ19 (ripetuto) RBMY1, RBAY2 (Cluster) DAZ (Cluster) Yp pseudoautosomico Eucromatina Eterocromatina Yq pseudoautosomico AZFc/AZFd prossimale SRY AZFa AZFb AZFc SRY DYS271 DYS148 DYS273 KALY DYS212 SMCY DYS215 DYS218 DYS219 DYS221 DYS223 DYS224 DYF51S1 DYS236 DAZ DAZ DAZ DAZ DYS240 SMCX SMCX SMCX SMCX ZFX ZFY SY14 SY81 SY86 SY84 SY182 SY121 SYPR3 SY124 SY127 SY128 SY130 SY133 SY134 SY145 SY152 SY242 SY208 SY254 SY255 SY157 Control Multiplex A Control Multiplex B Control Multiplex C Control Multiplex D Control Multiplex E Tabella 2. Foglio di lavoro della mappa del cromosoma Y. Per ulteriori dettagli vedere la Figura 2 supplementare del riferimento bibliografico 8. I palindromi 8, 7, 6, 5 e 4 si collocano nella mappa nella direzione prossimale di SY121 e nella direzione distale di SY182 (1). SY121 si situa presso il confine distale di P4 (8). AZFb si estende da P5 a P1 prossimale (8). AZFc include P1 e P2 (8). Almeno una copia di SY157 si situa nella mappa al di fuori del confine AZFc. Nota: E possibile osservare un amplificazione del locus SY133 in alcuni individui con una delezione della regione AZFb, suggerendo che questo locus possa essere ripetuto anche in altre parti del cromosoma. Page 13

15 (a) U.S. Pat. No. 6,242,235, Australian Pat. No , Canadian Pat. No. 2,335,153, Chinese Pat. No. ZL , Hong Kong Pat. No. HK , Japanese Pat. No , European Pat. No and other patents pending. 2013, 2014 Promega Corporation. All Rights Reserved. GoTaq is a registered trademark of Promega Corporation. GeneAmp is a registered trademarks of Roche Molecular Systems, Inc. Reliant is a registered trademark of CBM Intellectual Properties, Inc. NuSieve is a registered trademark of Lonza Sales AG. Please contact Promega Technical Services or access our web site at for the most up-to-date information on Promega products. Page 14