CONTRATTO DI RICERCA CON L AZIENDA TORTUGA S.r.l. Titolo della ricerca: "Sviluppo di trasformati ittici freschi a lunga shelf life"

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1 CONTRATTO DI RICERCA CON L AZIENDA TORTUGA S.r.l. Titolo della ricerca: "Sviluppo di trasformati ittici freschi a lunga shelf life" Responsabile Scientifico: dott.ssa Amalia Conte RELAZIONE FINALE Nell ambito del progetto "Sviluppo di trasformati ittici freschi a lunga shelf life" le attività svolte hanno preliminarmente riguardato l ottimizzazione di rivestimenti edibili in grado di migliorare la shelf life di filetti di orata. Successivamente, sono state effettuate prove di combinazione delle strategie selezionate durante la precedente fase progettuale. Nello specifico, sono stati condotti test di shelf life su orate trattate combinando l uso di sostanze antimicrobiche di origine naturale, rivestimenti edibili, atmosfere modificate e idoneo sistema di confezionamento. Di seguito viene riportato un dettaglio delle attività svolte. Materiali e metodi Orate fornite dall azienda sono state trasferite presso i laboratori UNIFG in contenitori di polistirolo provvisti di ghiaccio. Il prodotto è stato eviscerato, sfilettato, lavorato e confezionato entro 2 ore dalla cattura. Dopo essere stati trattati secondo le specifiche strategie individuate, i filetti di orata sono stati adagiati su pad assorbente in vaschette di plastica monouso di polistirene e confezionati in buste di polietilene disponibili commercialmente (200x300mm) con caratteristiche di media barriera ai gas. I campioni confezionati in atmosfera ordinaria (Ctrl Air) sono stati saldati mediante una confezionatrice (Gandus sealers, Milano) mentre per quelli in atmosfera modificata (MAP) è stata impiegata una confezionatrice Reepack RV 200 con miscelatore dei gas PBI dansensor MAP Mix 9001 ME. Nello specifico, la combinazione gassosa utilizzata era composta dal 5% di ossigeno e dal 95% di anidride carbonica. Dopo la saldatura tutti i campioni sono stati conservati a 4±1 C in cella refrigerata. Ad intervalli di tempo regolari si è provveduto all espletamento delle analisi si seguito riportate: Misurazione dei gas dello spazio di testa: lo spazio di testa delle confezioni è stato monitorato a ciascun tempo di campionamento mediante l ausilio di un analizzatore di O 2 e CO 2 (PBI Dansensor, Checkmate 9900). Ogni confezione è stata usata per una singola misura e tutte le misurazioni sono state eseguite in doppio.

2 Analisi microbiologiche (determinazione di batteri mesofili e psicrofili anaerobi, microflora aerobia specifica di spoilage (HSPB), batteri produttori di idrogeno solforato (PHAB), Enterobatteriaceae, pseudomonadaceae, lattobacilli e lieviti): I test microbiologici sono stati condotti utilizzando la tecnica del conteggio in piastra, impiegando substrati colturali selettivi e tempi e temperature di incubazione appropriate per ciascun gruppo microbico oggetto di studio. Tutte le analisi microbiologiche sono state condotte in doppio. Il carico cellulare è stato monitorato fino al raggiungimento del limite microbiologico o sensoriale. Per le analisi microbiologiche i campioni sono stati preparati pesando circa 20 g di prodotto in un sacchetto di plastica sterile per omogeneizzazione nel quale sono stati aggiunti 180 ml di diluente rappresentato da una soluzione fisiologica contenente cloruro di sodio allo 0,9% p/v. I campioni sono stati omogenati mediante l ausilio di un omogeneizzatore peristaltico a pale (Stomacher, International PBI, Milano, Italia). In questo modo è stata realizzata una diluizione 1/10 del campione detta diluizione madre. Da quest ultima sono state eseguite diluizioni seriali in soluzione fisiologica per effettuare la semina in piastra delle stesse. Per l analisi dei gruppi microbici considerati i terreni di coltura e le condizioni adottate sono state le seguenti: 1. Plate Count Agar (PCA, Oxoid, Milano) incubato a 30 C per 48 ore e a 5 C per 7 giorni, per la conta dei batteri mesofili e psicrofili anaerobi, rispettivamente. 2. Iron Agar (IA) incubato a 25 C per 3 gg e 7 C per 10 gg, per la microflora aerobia specifica di spoilage (HSPB) e i batteri produttori di idrogeno solforato (PHAB), rispettivamente. 3. Violet Red Bile Glucose Agar (VRBGA, Oxoid, Milano) incubato a 37 C per ore per le Enterobatteriaceae. 4. Pseudomonas Agar Base (PAB, Oxoid, Milano) reso selettivo mediante aggiunta di supplemento SR103 E incubato a 25 C per 48 ore per le Pseudomonas spp. 5. de Man, Rogosa and Sharp Agar (MRS Agar, Oxoid, Milano) reso selettivo mediante aggiunta, dopo sterilizzazione, di cicloeximmide (0,17 g/l) e incubato a 30 C per 48 ore, per i lattobacilli. 6. Sabouroud Dextrose Agar (SAB, Oxoid, Milano) reso selettivo mediante aggiunta di cloroanphenicolo (0,1 g/l) incubato a 25 C per 48 ore per i lieviti. Come limite soglia per la carica batterica totale (microflora mesofila anaerobia) è stato fissato il valore di 7 Log ufc/g come riportato dall International Commission on Microbiological Specification on Food (7.00 log/g o log/cm 2 a 30 ; ICMSF, 1986). Analisi sensoriale: La valutazione delle caratteristiche organolettiche dei filetti d orata e della qualità percepita è stata determinata avvalendosi di otto valutatori appartenenti al laboratorio di Confezionamento Alimentare. Durante la valutazione sensoriale, la qualità globale dei filetti è stata

3 definita attraverso la valutazione dell aspetto generale, dell odore, del colore e della consistenza. Ai panelisti è stato chiesto di quantificare gli attributi sensoriali appena considerati attraverso una scala di valutazione provvista di 7 punti e tesa ad individuare l'intensità con cui i suddetti parametri erano percepiti. Un punteggio di 4 rappresentava la soglia di accettabilità del prodotto. Analisi chimico-fisiche: Nel corso di ogni seduta d analisi si è provveduto alla valutazione dei parametri chimico-fisici dei filetti di orata attraverso la determinazione del ph e delle modificazioni nelle caratteristiche colorimetriche. Le misure del ph sono state effettuate tramite un ph-metro (Crison, Barcellona, Spagna) dopo opportuna calibrazione a ph 7.02 e ph Il ph è stato misurato sui campioni diluiti 1/10 in soluzione fisiologica ed omogeneizzati all interno di uno Stomacker, mentre le modificazioni colorimetriche sono state determinate con un colorimetro (Chromameter CR-400, Minolta). Il colore è descritto dalle coordinate di colore CIE L*a* b*: chiarezza coordinata L* contenuto in rosso valori di a* positivi in verde valori di a* negativi in giallo valori di b* positivi in blu valori di b* negativi Risultati Fase 1: prove preliminari di rivestimento con matrici edibili Il rivestimento edibile (coating) consiste in una pellicola che viene formata attorno al prodotto con lo scopo di esercitare un azione antimicrobica. La pellicola è trasparente e può essere consumata insieme all alimento. Prima di valutare l effetto di tale trattamento sul prodotto finito attraverso il monitoraggio dei parametri di qualità (stabilità microbica e valutazioni sensoriali) è stato necessario individuare la matrice più idonea al rivestimento dei filetti. Allo scopo, è stato effettuato uno screening di diversi composti (gelatina animale e alginato di sodio) potenzialmente compatibili con il prodotto da trattare. Per valutare l aderenza al prodotto, ciascuna delle matrici sopra riportate è stata testata adottando un piano fattoriale composto da 2 variabili e 3 livelli. I campioni sono stati valutati da un panel di assaggiatori esperti che ha permesso di individuare la combinazione di variabili che massimizza la qualità dei rivestimenti messi a punto. Allo scopo, è stato applicato un Central Composite Design (CCD) (Tabella 1), composto da 2 variabili: Variabile 1= quantità di composto di rivestimento Variabile 2= quantità di reticolante

4 Tabella 1. Codici dei livelli relativi alle variabili indipendenti utilizzate nel CCD composto di rivestimento quantità di reticolante Relativamente alla prima variabile considerata, il quantitativo minimo applicato è stato l 1% e un intervallo tra i 3 livelli pari a 1, in questo modo le quantità di composto di rivestimento utilizzate sono state l 1, il 2 e il 3%. Per la seconda variabile (quantità di reticolante) l intervallo tra i livelli era pari a 2.5 e il quantitativo minimo da impiegare era pari al 5%, dunque i diversi campioni sono stati reticolati con 5, 7.5 e 10% di composto. Per tutti i campioni analizzati il tempo di contatto tra il prodotto rivestito e il reticolante era pari a 0.5 minuti. In Tabella 2 sono riportate le combinazioni dei diversi campioni sottoposti all' analisi sensoriale. Tabella 2. Combinazioni del Central Composite Design. Campione Variabile 1 Variabile 2 A B 2 10 C 2 5 D E F 3 10 G 1 10 H 3 5 I 1 5 In questo modo è stato possibile valutare la capacità di formare una pellicola attorno ai filetti e la qualità del rivestimento formato. Dalle analisi svolte è emerso che, realizzando il rivestimento con la gelatina animale non era possibile ottenere una pellicola che ricoprisse in maniera omogenea il prodotto e che fosse sensorialmente accettabile, mentre l alginato di sodio era il composto più idoneo alla realizzazione di un prodotto accettabile. In particolare, il campione A (2% di alginato di sodio e 7.5% di reticolante) era il più apprezzato dai giudici coinvolti nella valutazione (dati non mostrati).

5 Fase 2: test di shelf life su filetti di orata con rivestimento edibile attivo I test di shelf life sono stati effettuati sui filetti di orata cotati con il rivestimento ottimale composto da alginato di sodio al 2% reticolato ad una concentrazione del 7.5% con 0.5 minuti di contatto. Tale rivestimento è stato impiegato tal quale o con aggiunta di nanoparticelle d argento (AgMMT) a 3 diverse concentrazioni (150ppm, 250ppm e 500ppm) in maniera tale da valutare la capacità di inibire lo sviluppo dei microrganismi sia del singolo rivestimento che della combinazione tra il rivestimento e un composto antimicrobico. I campioni oggetto d analisi erano i seguenti: - Campione di riferimento 1 (Ctrl Air), costituito da filetti di orata confezionati tal quali in condizioni di atmosfera ordinaria; - Campione di riferimento 2 (Ctrl Coat), costituito da filetti di orata confezionati tal quali in condizioni di atmosfera modificata; - Coat 150ppm, costituito da filetti di orata rivestiti di alginato caricato con 150ppm di nanoparticelle d argento e in atmosfera modificata; - Coat 250ppm, costituito da filetti di orata rivestiti di alginato caricato con 250ppm di nanoparticelle d argento e in atmosfera modificata; - Coat 500ppm, costituito da filetti di orata rivestiti di alginato caricato con 500ppm di nanoparticelle d argento e in atmosfera modificata. L atmosfera modificata utilizzata era composta dal 5% di ossigeno e dal 95% di anidride carbonica. Risultati fase 2 Qualità microbiologica In figura 1 viene mostrata l evoluzione della carica batterica totale mesofila (CBT-m) nei filetti di orata analizzati nella fase 2. Al momento del confezionamento il carico cellulare del prodotto era pari a 3.18 log UFC/g. Durante la conservazione è stata osservata una crescita esponenziale della popolazione microbica che nel filetto confezionato in atmosfera ordinaria (Ctrl Air) ha superato i limiti suggeriti dall ICMSF (2011) dopo 10 giorni di conservazione (7.01 log UFC/g). Nell altro campione di riferimento (Ctrl Coat) è stato osservato lo stesso andamento ma titoli pari a 7.08 log UFC/g sono stati ritrovati al 29 giorno d analisi. Il rivestimento con alginato di sodio e l impiego dell atmosfera modificata hanno permesso di ottenere un prodotto microbiologicamente accettabile per un periodo di tempo maggiore rispetto al semplice filetto confezionato in atmosfera ordinaria. Nei filetti di orata rivestiti con alginato caricato con diverse concentrazioni di nanaoparticelle d argento è stata osservata una crescita della popolazione microbica più contenuta e il valore limite di 7 cicli logaritmici non è mai stato superato durante l intero periodo di osservazione (29 giorni).

6 Come è possibile notare in figura 1, all aumentare della concentrazione di antimicrobico utilizzata nel rivestimento vengono ritrovati titoli inferiori e pari a 6.61 log UFC/g (Coat 150ppm), 6.65 log UFC/g (Coat 250ppm) e 5.91 log UFC/g (Coat 500ppm). Figura 1. Evoluzione della carica batterica totale mesofila nei filetti di orata analizzati nella fase 2. Qualità sensoriale In figura 2 viene mostrata l accettabilità generale dei campioni di orata analizzati nella fase 2 in funzione del tempo. Il filetto di orata confezionato in atmosfera ordinaria (Ctrl Air) è stato rigettato per primo poiché al 3 giorno d analisi l odore e l aspetto del prodotto avevano subito modificazioni tali da comprometterne la qualità globale (4.75) mentre, allo stesso giorno d analisi, l altro campione di riferimento (Ctrl Coat) era giudicato ancora accettabile (5.00). Quest ultimo è stato rigettato dopo 6 giorni di conservazione (4.50) ma come è possibile notare in figura 2, il prodotto mostrava già al 4 giorno di conservazioni modificazioni tali da giustificarne l inaccettabilità. Tra i campioni rivestiti con coating attivo (Coat 150ppm, Coat 250ppm e Coat 500ppm) non emergono differenze significative, i suddetti campioni vengono giudicati inaccettabili (4.00) durante l analisi sensoriale svolta al 12 giorno di conservazione. Come è possibile notare dalla figura, nel corso della precedente analisi effettuata a 6 giorni dal confezionamento tutti i campioni ottenevano un punteggio ancora accettabile (5.00) ma il colore e l aspetto del prodotto ottenevano un punteggio pari a 4.75 (dati non mostrati) e tali modificazioni hanno influito negativamente sulla qualità globale del prodotto.

7 Alla luce dei risultati ottenuti è possibile notare che non emergono differenze significative tra i campioni rivestiti con alginato e le diverse concentrazioni di nanoparticelle d argento ma buoni risultati, sia dal punto di vista microbiologico che sensoriale, possono essere ottenuti impiegando la minore concentrazione tra quelle testate (150ppm) dunque, nella successiva fase di combinazione delle diverse strategie finora valutate tale campione verrà considerato come riferimento su cui applicare gli ulteriori trattamenti finalizzati all estensione della conservabilità del prodotto. Figura 2. Analisi sensoriale dei filetti di orata analizzati nella fase 2. Fase 3: test di shelf life su filetti di orata con combinazione delle strategie individuate I test di shelf life sono stati effettuati sui filetti di orata cotati con il rivestimento ottimale composto da alginato di sodio al 2% reticolato ad una concentrazione del 7.5% con 0.5 minuti di contatto. I campioni oggetto d analisi erano 3: - Campione di riferimento (Ctrl Air), costituito da filetti di orata confezionati tal quali in condizioni di atmosfera ordinaria; - Dipping/Coating non attivo, costituito da filetti di orata sottoposti ad un trattamento preliminare di immersione in soluzione antimicrobica (trattamento dipping). Tale soluzione era composta da chitosano con aggiunta di timolo e GFSE, prima del confezionato in atmosfera modificata il prodotto è stato rivestito con alginato tal quale (coating non attivo); - Dipping/Coating 150ppm, costituito da filetti di orata preparati secondo quanto descritto per il campione Dipping/Coating non attivo, ad eccezione dell aggiunta di 150ppm di AgMMT nell alginato.

8 Risultati fase 3 Composizione gassosa Nel campione di riferimento confezionato in aria (Ctrl Air) è stato osservato un repentino decremento nella concentrazione di ossigeno ed un incremento nella concentrazione di anidride carbonica. Alla fine del periodo di osservazione (10 giorno d analisi), l ossigeno raggiungeva un valore del 17% mentre nelle confezioni era presente il 3.9% circa di anidride carbonica. Nei campioni confezionati in condizioni di atmosfera modificata (Dipping/Coating non attivo e Dipping/Coating 150ppm) sono stati osservati andamenti costanti nel tempo fino all ultimo giorno d analisi (21 giorno di conservazione). In particolare, le concentrazioni di ossigeno erano pari a 5.9% e 5.54%, mentre l anidride carbonica era presente ad una concentrazione del 90.4% e 91.45%, rispettivamente (dati non mostrati). Qualità microbiologica In Figura 3 è illustrata l evoluzione della crescita microbica per la carica batterica totale mesofila (CBT-m) in tutte le tipologie di campioni testati. Dalla figura è possibile osservare che il campione di riferimento (Ctrl Air) mostra un repentino aumento del carico cellulare nel tempo superando il limite imposto dall ICMSF (7 Log UFC/g) dopo 10 giorni di conservazione. Per i campioni rivestiti con coating non attivo (Dipping/Coating non attivo) o caricato con antimicrobico (Dipping/Coating 150ppm) confezionati in MAP è stato osservato un rallentamento della crescita per la popolazione microbica alterante. In particolare, durante il periodo di osservazione (21 giorni) il carico cellulare era inferiore a 7 Log UFC/g e non sono emerse differenze significative tra i suddetti campioni poiché i titoli osservati erano pressochè simili. In tabella 3 vengono riportati i carichi cellulari di tutti i gruppi microbici ricercati. Per ciascun campione analizzato i valori presenti in tabella sono riferiti all ultimo giorno d analisi, 10 giorno per il campione di riferimento (Ctrl Air) e 21 giorno per gli altri campioni analizzati. Nel campione di riferimento si osservano titoli maggiori rispetto agli altri campioni oggetto d analisi per tutte le popolazioni microbiche ricercate. In particolare, dopo 10 giorni di conservazione sono presenti titoli superiori ai limiti suggeriti dalla Nordic Committee on Food Analysis (2006) a carico della microflora aerobia specifica di spoilage (6.76 log UFC/g) e dei batteri produttori di idrogeno solforato (6.94 log UFC/g), inoltre le pseudomonadaceae hanno superato i 7 cicli logaritmici e tale situazione è generalmente collegata ad un decadimento della qualità microbiologica dei prodotti ittici. Relativamente agli altri gruppi microbici ricercati (batteri lattici, lieviti ed enterobacteriaceae) si osserva una contaminazione molto contenuta e compresa tra i 2-3 cicli logaritmici. Tra i campioni Dipping/Coating non attivo e Dipping/Coating 150ppm sono state

9 rilevate contaminazioni simili a carico dei HSPB, PHAB, pseudomonadaceae e lieviti mentre non è stata rilevata la presenza di enterobacteriaceae e batteri lattici. Figura 3. Evoluzione della carica batterica totale mesofila (CBT) nei filetti di orata analizzati nella fase 3. Tabella 3. Evoluzione dei principali gruppi microbici di alterazione nei filetti di orata (log UFC/g). Gruppo Microbico Ctrl Air Dipping/Coating Dipping/Coat 150ppm CBT-Mesofila 7.78 ± ± ±0.31 CBT-Psicrofila 7.78± ± ±0.31 HSPB 6.76± ± ±0.72 PHAB 6.94± ± ±0.75 Pseudomonadaceae 7.24± ± ±0.58 Lieviti 4.78± ± ±0.58

10 Enterobacteriaceae 3.17± ± ±0.58 Lattici 3.48± ± ±0.69 Qualità sensoriale I risultati relativi alla qualità sensoriale dei filetti di orata sono riportati in Figura 4 dove viene mostrato l andamento della qualità globale in funzione del tempo di conservazione. Tale attributo (qualità globale) riassume l andamento dei parametri (odore, colore e consistenza) considerati durante la valutazione sensoriale. Il campione di riferimento (Ctrl Air) è stato considerato accettabile fino a 7 giorni di conservazione, successivamente al 10 giorno d analisi la qualità globale veniva compromessa dall odore. Differentemente, entrambe i campioni con rivestimento edibile (attivo e non) confezionati in MAP risultavano accettabili per un periodo di tempo maggiore (fino a circa 17 giorni) non mostrando grandi differenze tra loro. Infatti, il campione Dipping/Coating non attivo otteneva un punteggio pari a 5.31 mentre il campione con rivestimento attivo (Dipping/Coating 150ppm) otteneva allo stesso giorno d analisi un punteggio di Durante la successiva analisi, effettuata al 21 giorno di conservazione, la qualità globale era inferiore alla soglia di accettabilità a causa di un peggioramento del colore e della consistenza (campione Dipping/Coating non attivo) mentre l altro campione analizzato (Dipping/Coating 150ppm) presentava esclusivamente un alterazione del colore. Figura 4. Analisi sensoriale dei filetti di orata (qualità globale in funzione del tempo).

11 Qualità chimico-fisiche I valori di ph per i campioni testati si mantenevano pressoché costanti durante tutto il periodo di stoccaggio. L aggiunta delle sostanze antimicrobiche impiegate per migliorare la shelf life del prodotto (chitosano, timolo, Gfse e AgMMT) e il confezioanmento in atmosfera modificata non hanno apportato modificazioni ai valori di ph rispetto al campione di riferimento. Conclusioni I risultati ottenuti dalle prove eseguite sui filetti di orata hanno evidenziato che per migliorare l aspetto microbiologico del prodotto è necessaria l aggiunta di sostanze attive applicate sia come trattamento dipping che come rivestimento attivo (coating). In tabella 4 vengono riportati i carichi cellulari dei filetti analizzati durante la fase 2 e 3 della ricerca. Come è possibile notare dalla tabella, confrontando i carichi cellulari presenti nel prodotto allo stesso giorno d analisi (20 giorno di conservazione) nei campioni Dipping/Coating non attivo e Dipping/Coat 150ppm ottenuti combinando il trattamento di immersione in soluzione antimicrobica (trattamento dipping) e il rivestimento con alginato (attivo e non), è evidente una maggiore riduzione della popolazione microbica (3.46 e 3.13 log UFC/g, rispettivamente), rispetto ai titoli osservati nei campioni ottenuti senza il trattamento dipping ma esclusivamente rivestendo il prodotto con alginato (attivo e non) (campioni Ctrl Coat e Coat 150ppm). Le strategie proposte (dipping e rivestimento attivo) consentono di stabilizzare microbiologicamente il prodotto, inoltre tale combinazione permette di preservare le caratteristiche organolettiche del prodotto fino a 21 giorni di conservazione. Come è possibile osservare nella tabella 5, confrontando l accettabilità generale che i campioni della fase 2 e 3 ottengono allo stesso giorno d analisi (12 giorno di conservazione), è possibile notare punteggi maggiori 5.38 (Dipping/Coating non attivo) e 3.69 (Dipping/Coating 150ppm) nei filetti trattati con entrambe le strategie proposte rispetto al singolo uso del rivestimento attivo e non (campioni Ctrl Coat e Coat 150ppm).

12 Tabella 4. Confronto tra i campioni analizzati nella fase 2 e 3: carichi cellulari (log UFC/g) al 20 giorno di conservazione. Campione log UFC/g Ctrl Coat 6.43±0.41 Coat 150ppm 5.36±0.06 Dipping/Coating non attivo 3.46±0.44 Dipping/Coat 150ppm 3.13±0.16 Tabella 5. Confronto tra i campioni analizzati nella fase 2 e 3: accettabilità generale al 12 giorno di conservazione. Campione Accettabilità generale (score) Ctrl Coat 4.00±0.00 Coat 150ppm 4.00±0.00 Dipping/Coating non attivo 5.38±0.23 Dipping/Coat 150ppm 5.69±0.26 Bibliografia International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF), Sampling plans for fish and shellfish, In: Microorganisms in Foods 2, Sampling for Microbiological Analysis: Principles and Scientific Applications, 2nd Edition. University of Toronto Press, Toronto, Canada, pp Nordic Committee on Food Analysis (2006). Aerobic Count and Specific Spoilage Organisms In Fish and Fish Products, NMKL Method No. 184, Espoo, Finland.