MUTAGENESI DEL DNA. A cosa serve la mutagenesi del DNA?

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1 A cosa serve la mutagenesi del DNA? MUTAGENESI DEL DNA 1. Studio delle sequenze nucleotidiche, delle funzioni dei geni e di particolari aminoacidi nelle proteine. 2. Ingegnerizzazione di proteine in modo da renderle più adatte alle applicazioni industriali o terapeutiche. 1

2 Le proprietà fisico-chimiche delle proteine naturali possono non essere adatte ad applicazioni di tipo industriale Soluzioni: 1. Si cercano proteine più adatte in organismi che crescono in condizioni estreme (es: α-amilasi da Bacillus stearothermophilus) 2. Mutagenesi convenzionale e selezione (in vivo) 3. Mutagenesi mirata (in vitro) ESEMPI: Migliorare il rendimento catalitico (V max / K m ) di un enzima K m (costante di Michaelis: rispecchia la forza di legame enzima-substrato) V max (velocità massima di trasformazione del substrato) Modificazione del sito di legame con il co-fattore Alterazione della regolazione allosterica di un enzima Cambiamento della tolleranza al calore o al ph Aumento della specificità di un enzima Aumento della resistenza a proteasi Alterazione della solubilità 2

3 Mutagenesi mirata (in vitro) SITO-SPECIFICA quando si hanno informazioni sulla struttura tridimensionale (cristallografia a raggi X) RANDOM quando non si sa quali specifici cambiamenti introdurre in un determinato sito MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Cosa è possibile fare? Sostituzioni di nucleotidi Inserzioni o delezioni Cambiare un aminoacido in maniera specifica Proteine di fusione Inattivare geni specifici ( knockouts ) 3

4 Mutagenesi sito-specifica tramite oligonucleotidi con DNA di M13 Mutagenesi sito-specifica tramite oligonucleotidi con DNA di M13 1. Screening mediante ibridazione con una sonda di DNA in condizioni molto stringenti 2. Estrazione del gene mutato e clonaggio in un vettore di espressione plasmidico per E. coli Resa teorica: 50% Resa reale: 1-5% 4

5 Arricchimento del DNA mutato mediante passaggio attraverso un ceppo dut (*) e ung (**)di E. coli (1) Arricchimento del DNA mutato mediante passaggio attraverso un ceppo dut (*) e ung (**)di E. coli (2) ~1% (*)dut : dutpasi negativo (**)ung : Uracil-N-Glicosilasi negativo 5

6 Mutagenesi sito-specifica tramite oligonucleotidi con DNA plasmidico SCHEMA GENERALE 1. Annealing di un oligonucleotide sintetico (contenente la mutazione desiderata) alla regione target del DNA stampo. Selezione dei plasmidi mutati tramite resistenza agli antibiotici 2. Estensione tramite una DNA polimerasi e successiva reazione di ligasi. 3. Trasformazione in E. coli del plasmide recante la mutazione. 4. Selezione dei mutanti, estrazione del DNA e sequenziamento 6

7 CONSIDERAZIONI PER LA SCELTA DEGLI OLIGO Il/i mismatch/es devono trovarsi vicino al centro del primer per permettere un buon appaiamento alle estremità 5 e 3 : 1 mismatch: lunghezza nucleotidi 2 mismatches: lunghezza 25 nucleotidi basi complementari alle estremità 5 e 3 CONSIDERAZIONI PER IL DNA STAMPO (plasmide) Il DNA deve essere purificato e integro. La purificazione deve avvenire da un ceppo batterico compatibile con il ceppo usato per la procedura di mutagenesi. Delezioni: basi complementari alle estremità 5 e 3 Alto grado di specificità e purificazione; Evitare oligonucleotidi che formano strutture secondarie; Utilizzare oligonucleotidi fosforilati all estremità 5 ; 7

8 Il meccanismo di riparazione in E. coli agisce di preferenza su sequenze non metilate (tipicamente quelle del filamento polimerizzato in vitro) Utilizzo di ceppi che recano le mutazioni mutl, muts, muth che bloccano il sistema di correzione degli errori basato sulla metilazione Resa teorica: 50% 50% 8

9 MUTAGENESI SITO-SPECIFICA BASATA SULLA PCR MUTAGENESI SITO-SPECIFICA BASATA SULLA PCR VANTAGGI: Alta resa nella produzione dei mutanti. Possibilità di usare DNA double strand. Riduzione della possibilità di formazione di strutture secondarie (uso di alte temperature). Disponibilità di kit commerciali. Velocità e semplicità. SVANTAGGI: Possibilità di errori nel prodotto di PCR. Introduzione di nucleotidi extra all estremità 3 del DNA amplificato. Necessità di ottimizzare le condizioni di PCR per ogni nuovo set di primers. Possibilità di una alta incidenza di cloni non mutati a causa della presenza del DNA wt nel prodotto di reazione. Inefficienza nell amplificazione di segmenti di DNA lunghi più di 2-3 kb. 9

10 Mutagenesi alle estremità di un prodotto di PCR tramite primers modificati al 5 Introduzione di una mutazione all interno di un prodotto di PCR (Metodo megaprimer ) PCR 1 A Long Primer B Dopo n cicli PCR 2 C Long Primer 10

11 Introduzione di una mutazione all interno di un prodotto di PCR (overlap extension) Mutagenesi sito-specifica tramite PCR su un frammento di DNA clonato in un plasmide PCR PCR PCR 11

12 Strategia di mutagenesi LP-USE (Long Primer Unique Site Elimination) Sito unico di restrizione BamHI Primer senso USE (Unique Site Elimination) Sito mutato KpnI MUTAGENESI RANDOM Sequenza target Primer antisenso Denaturazione del plasmide Annealing del prodotto di PCR Sintesi del secondo strand Trasformazione in E. coli mut S Estrazione del DNA plasmidico Digestione con BamHI e linearizzazione del plasmide non mutato Digestione con Esonucleasi III Trasformazione in E. coli JM109 PCR Prodotto di PCR Long Primer Tramite oligonucleotidi degenerati 1) Non è necessario conoscere in dettaglio il ruolo di particolari aa nella proteina 2) Possono essere creati mutanti inattesi, con proprietà nuove e interessanti Plasmide recante entrambe le mutazioni 12

13 Sintesi di oligonucleotidi degenerati Mutagenesi random tramite oligonucleotidi degeneri e PCR 13

14 Mutagenesi random di un gene clonato con analoghi dei nucleotidi Mutagenesi random di un gene clonato con analoghi dei nucleotidi 14

15 MUTAGENESI RANDOM Screening dei mutanti prodotti Determinazione della sequenza per accertare quale sito sia stato mutato 15

16 Miglioramento della termostabilità: aggiunta di legami disolfuro Proprietà del lisozima T4 e di 6 varianti manipolate geneticamente Aminoacido in posizione Enzima S-S- attività % Tm C wt Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys Miglioramento della termostabilità: aggiunta di legami disolfuro Xilanasi (Bacillus circulans) Xilanasi termostabili sono utilizzate nell industria della carta (pretrattamento di sbiancamento della carta) Determinano una significativa riduzione della quantità di cloro e diossido di cloro usato. Questa riduzione è di circa il 10-20% rispetto ad un processo privo di pretrattamento enzimatico. -S-S-: ponti disolfuro Tm: temperatura di fusione (misura la termostabilità) 16

17 Miglioramento della termostabilità: aggiunta di legami disolfuro 1. Realizzazione di un modello di struttura tridimensionale al computer 2. Individuazione dei siti potenziali in cui introdurre ponti disolfuro (Cys) Lett Appl Microbiol Sep 14; Production and partial characterization of cellulase free xylanase by Bacillus subtilis C 01 using agriresidues and its application in biobleaching of nonwoody plant pulps. Ayyachamy M, Vatsala TM. Shri AMM Murugappa Chettiar Research Centre, Taramani, Chennai, India. Aims: To optimize the solid-state cultivation conditions for xylanase production using agriresidues and testing the biobleaching efficiency of xylanase on nonwoody plant fibre materials. Methods and Results: An extracellular cellulase free xylanase was produced from Bacillus subtilis C 01 using various inexpensive substrates under solid-state cultivation. High level of xylanase production (135 IU gds(-1)) was observed when grown on wheat bran followed by maize powder (50 IU gds(-1)). The maximum xylanase (136 IU gds(-1)) production was occurred in wheat bran-to-moisture ratio of 1 : 1 at 72 h. The xylanase pretreated pulp samples of banana, silk cotton and cotton showed an increased brightness of 19.6, 11.6 and 7.9%, respectively. Conclusions: The enzyme-aided biobleaching results indicate that the xylanase has potential application in enhancing the brightness of nonwoody plant fibre pulp. Significance and Impact of the Study: This is the first report on biobleaching of banana fibres, silk cotton and cotton pulps using xylanase. The biobleaching results of secondary fibres are promising and can be transferred to paper mills, which utilize nonwoody plant fibres as a raw material for paper production. 3. Realizzazione di 8 mutanti più termostabili del wt Uno in particolare risultava 2 volte più attivo dell enzima wt a 60 17

18 Miglioramento della termostabilità: Cambiamento dell asparagina in altri aminoacidi Alte temperature Deaminazione Acido glutammico asparagina Acido aspartico 18

19 Miglioramento della termostabilità: Cambiamento dell asparagina in altri aminoacidi Riduzione dei gruppi SH liberi Stabilità a 100 C dell enzima del lievito triosofosfato-isomerasi e dei suoi derivati manipolati geneticamente. Aminoacido in posizione Enzima Emivita (min) wt Asn Asn 13 A Asn Thr 17 B Asn Ile 16 C Thr Ile 25 D Asp Asn 11 IFNβ umano espresso in E. coli: => Formazione di dimeri e oligomeri => 10% di attività Analisi della sequenza La stabilità dell enzima è espressa dall emivita, ossia dal tasso di inattivazione dell enzima a 100 C. 19

20 Riduzione dei gruppi SH liberi Riduzione dei gruppi SH liberi Trasformare uno o più residui Cys in Ser potrebbe generare un IFNβ incapace di formare oligomeri? Quale residuo Cys scegliere? Ser 17 20

21 Incremento dell attività enzimatica (E Necessario conoscere la conformazione del sito attivo) Scopo: Migliorare l affinità dell enzima per l ATP Treonina (Thr)51 Ala / Pro Tirosil-tRNA-Sintetasi (B. stearothermophylus) 21

22 Modificazione del co-fattore enzimatico Subtilisine Serina-proteasi secrete da batteri Gram+ Utilizzate nei detersivi Ioni Ca ++ che conferiscono stabilità all enzima Sviluppo della subtilisina modificata 1. Determinazione della struttura ai raggi X 2. Clonaggio del gene BPN da B. amyloliquefaciens 3. Delezione aa (sito legante il Ca ++ ) 4. Mutagenesi random su 10 aa coinvolti nell interazione con il dominio legante il Ca ++, distribuiti in 4 regioni: 1) N-terminale (aa 2-5) 2) ansa omega (aa 36-44) 3) elica α (aa 63-85) 4) foglietto β (aa ) Scopo: stabilizzare l enzima 22

23 Modificazione della specificità dell enzima Come ottenere nuove endonucleasi di restrizione che tagliano raramente Da FokI Nuove endonucleasi sito- specificge pt7 FokI Sito di taglio per la Trombina (Gly 4 Ser) 3 Conferisce flessibilità 23

24 Aumento della stabilità e della specificità enzimatica Enzima attivatore tissutale del plasminogeno (tpa) Serina-proteasi utilizzata in campo clinico per sciogliere i coaguli viene rapidamente eliminato dal circolo => deve essere somministrato in concentrazioni elevate => può causare emorragie interne Esigenza di tpa stabile nel plasma e maggiormente specifico per la fibrina dei coaguli 24

25 Esempi di applicazione della mutagenesi sito-specifica nella ricerca 1. Identificazione del sito di coniugazione della proteina SUMO su PLZF (Promyelocytic leukemia zinc finger) Esempi di applicazione della mutagenesi sito-specifica nella ricerca 2. Identificazione dei siti di ubiquitinazione della α- spettrina eritrocitaria Repeat Mutations 17 K3,4,5R 17 K25R 17 K27R 17 K25,27R 17 K49R 17 K70,71,73R 17 K95,97,99R 18 K14,16R 18 K20R 18 K25R 125 I-Ub GSTα α16-17 ubiquitination % of WT WT 17K49R 17K25,27R 17K27R 17K25R 17K3,4,5R 18K14,16R 18K20R 18K25R 17K95,97,99R 17K70,71,73R Kang et al. (2003) J Biol Chem 278, Galluzzi et al (2001) FEBS Letters 489,

26 Esempi di applicazione della mutagenesi sito-specifica nella ricerca 3. Creazione di un sito di restrizione sulla sequenza carbossiterminale della α-spettrina eritrocitaria umana per verificare la presenza di una extra G A 7375 CCA CGG GTC GAA GCC ATC TCT CTG GCT ATG ACT ACG TTG GCT TCA CCA ATT CCT ACT 2397 P R V E A I S L A M T T L A S P I P T TTG GCA ACT AAT AAG CAG CTC CTC GTG GAT CGT AGA AAA TCT TAG 7476 L A T N K Q L L V D R R K S AGCAATATAT GGACCCACCG-3 (5 Primer) 5-AGCAATATAT GGACCCACGG GGTCGA...AATAAGCAGC TCCTCGTGGA-3 (100pb) 3-TTATTCGTCG AGGAGCACCT-5 Sito di taglio ScrFI: CCNGG (3 Primer) 1999 B 7375 CCA CGG GG T CGA AGC CAT CTC TCT GGC TAT GAC TAC GTT GGC TTC ACC AAT TCC TAC 2397 P R G R S H L S G Y D Y V G F T N S Y TTT GGC AAC TAA TAA GCA GCT CCT CGT GGA TCG TAG AAA ATC TTA G 7477 F G N Dopo Mutagenesi: Se 4 G la sequenza mutata è CCGGG: ScrFI può tagliare (2 frammenti di 81 e 19 pb) Questa inserzione provoca un cambiamento nella fase di lettura e la proteina risulta 11 aa più corta (2418 residui invece di 2429) e con sequenza diversa (aa ). Se 3 G la sequenza mutata è CCGGT: ScrFI non può tagliare (prodotto di PCR intero, 100 pb) 26

27 Source Website address L bp bp bp bp - 19 bp Clontech Stratagene Elettroforesi su gel d agaroso dei prodotti di PCR digeriti con ScrFI. Lane 1: controllo non digerito. Lanes dalla 2 alla 6: prodotti di PCR digeriti. Promega 27