A cosa serve la mutagenesi del DNA?

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1 MUTAGENESI DEL DNA

2 A cosa serve la mutagenesi del DNA? 1. Studio delle sequenze nucleotidiche, delle funzioni dei geni e di particolari aminoacidi nelle proteine. 2. Ingegnerizzazione di proteine in modo da renderle più adatte alle applicazioni industriali o terapeutiche.

3 Le proprietà fisico-chimiche delle proteine naturali possono non essere adatte ad applicazioni di tipo industriale Soluzioni: 1. Si cercano proteine più adatte in organismi che crescono in condizioni estreme (es: α-amilasi da Bacillus stearothermophilus) 2. Mutagenesi convenzionale e selezione (in vivo) 3. Mutagenesi mirata (in vitro)

4 ESEMPI: Migliorare il rendimento catalitico (V max / K m ) di un enzima K m (costante di Michaelis: rispecchia la forza di legame enzima-substrato) V max (velocità massima di trasformazione del substrato) Modificazione del sito di legame con il co-fattore Alterazione della regolazione allosterica di un enzima Cambiamento della tolleranza al calore o al ph Aumento della specificità di un enzima Aumento della resistenza a proteasi Alterazione della solubilità

5 Mutagenesi mirata (in vitro) SITO-SPECIFICA quando si hanno informazioni sulla struttura tridimensionale (cristallografia a raggi X) RANDOM quando non si sa quali specifici cambiamenti introdurre in un determinato sito

6 MUTAGENESI SITO-SPECIFICA Cosa è possibile fare? Sostituzioni di nucleotidi Inserzioni o delezioni Cambiare un aminoacido in maniera specifica Proteine di fusione Inattivare geni specifici ( knockouts )

7 Mutagenesi sito-specifica tramite oligonucleotidi con DNA di M13

8 Mutagenesi sito-specifica tramite oligonucleotidi con DNA di M13 Screening mediante ibridazione con una sonda di DNA in condizioni molto stringenti Resa teorica: 50% Resa reale: 1-5% Estrazione del gene mutato e clonaggio in un vettore di espressione plasmidico per E. coli

9 Arricchimento del DNA mutato mediante passaggio attraverso un ceppo (*)dut (**)ung di E. coli (1) ~1% (*)dut : dutpasi negativo (**)ung : Uracil-N-Glicosilasi negativo

10 Arricchimento del DNA mutato mediante passaggio attraverso un ceppo (*)dut (**)ung di E. coli (2)

11 Mutagenesi sito-specifica tramite oligonucleotidi con DNA plasmidico SCHEMA GENERALE 1. Annealing di un oligonucleotide sintetico (contenente la mutazione desiderata) alla regione target del DNA stampo. 2. Estensione tramite una DNA polimerasi e successiva reazione di ligasi. 3. Trasformazione in E. coli del plasmide recante la mutazione. 4. Selezione dei mutanti, estrazione del DNA e sequenziamento

12 Selezione dei plasmidi mutati tramite resistenza agli antibiotici

13 CONSIDERAZIONI PER LA SCELTA DEGLI OLIGO Il/i mismatch/es devono trovarsi vicino al centro del primer per permettere un buon appaiamento alle estremità 5 e 3 : 1 mismatch: lunghezza nucleotidi 2 mismatches: lunghezza 25 nucleotidi basi complementari alle estremità 5 e 3 Delezioni: basi complementari alle estremità 5 e 3 Alto grado di specificità e purificazione; Evitare oligonucleotidi che formano strutture secondarie; Utilizzare oligonucleotidi fosforilati all estremità 5 ;

14 CONSIDERAZIONI PER IL DNA STAMPO (plasmide) Il DNA deve essere purificato e integro. La purificazione deve avvenire da un ceppo batterico compatibile con il ceppo usato per la procedura di mutagenesi.

15 Resa teorica: 50% 50%

16 Il meccanismo di riparazione in E. coli agisce di preferenza su sequenze non metilate (tipicamente quelle del filamento polimerizzato in vitro) Utilizzo di ceppi che recano le mutazioni mutl, muts, muth che bloccano il sistema di correzione degli errori basato sulla metilazione

17 MUTAGENESI SITO-SPECIFICA BASATA SULLA PCR VANTAGGI: Alta resa nella produzione dei mutanti. Possibilità di usare DNA double strand. Riduzione della possibilità di formazione di strutture secondarie (uso di alte temperature). Disponibilità di kit commerciali. Velocità e semplicità.

18 MUTAGENESI SITO-SPECIFICA BASATA SULLA PCR SVANTAGGI: Possibilità di errori nel prodotto di PCR. Introduzione di nucleotidi extra all estremità 3 del DNA amplificato. Necessità di ottimizzare le condizioni di PCR per ogni nuovo set di primers. Possibilità di una alta incidenza di cloni non mutati a causa della presenza del DNA selvaggio nel prodotto di reazione. Inefficienza nell amplificazione di segmenti di DNA lunghi più di 2-3 kb.

19 Mutagenesi alle estremità di un prodotto di PCR tramite primers modificati al Dopo n cicli

20 Introduzione di una mutazione all interno di un prodotto di PCR (Metodo megaprimer ) PCR 1 A B Long Primer PCR 2 C Long Primer

21 Introduzione di una mutazione all interno di un prodotto di PCR (overlap extension) PCR PCR PCR

22 Mutagenesi sito-specifica tramite PCR su un frammento di DNA clonato in un plasmide

23 Strategia di mutagenesi LP-USE (Long Primer Unique Site Elimination) Sito unico di restrizione BamHI Primer senso USE (Unique Site Elimination) Sito mutato KpnI PCR Sequenza target Primer antisenso Prodotto di PCR Denaturazione del plasmide Annealing del prodotto di PCR Sintesi del secondo strand Trasformazione in E. coli mut S Estrazione del DNA plasmidico Digestione con BamHI e linearizzazione del plasmide non mutato Digestione con Esonucleasi III Trasformazione in E. coli JM109 Long Primer Plasmide recante entrambe le mutazioni

24 MUTAGENESI RANDOM Tramite oligonucleotidi degenerati 1) Non è necessario conoscere in dettaglio il ruolo di particolari aa nella proteina 2) Possono essere creati mutanti inattesi, con proprietà nuove e interessanti

25 Sintesi di oligonucleotidi degenerati

26 Mutagenesi random tramite oligonucleotidi degeneri e PCR

27 Mutagenesi random di un gene clonato con analoghi dei nucleotidi

28 Mutagenesi random di un gene clonato con analoghi dei nucleotidi

29 MUTAGENESI RANDOM Screening dei mutanti prodotti Determinazione della sequenza per accertare quale sito sia stato mutato

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31 Miglioramento della termostabilità: aggiunta di legami disolfuro Proprietà del lisozima T4 e di 6 varianti manipolate geneticamente Aminoacido in posizione Enzima S-S- attività % Tm C wt Ile Ile Thr Cys Cys Thr Leu pwt Ile Ile Thr Thr Ala Thr Leu A Cys Ile Thr Thr Cys Thr Leu B Ile Cys Thr Thr Ala Thr Cys C Ile Ile Cys Thr Ala Cys Leu D Cys Cys Thr Thr Cys Thr Cys E Ile Cys Cys Thr Ala Cys Cys F Cys Cys Cys Thr Cys Cys Cys S-S-: ponti disolfuro Tm: temperatura di fusione (misura la termostabilità)

32 Miglioramento della termostabilità: aggiunta di legami disolfuro Xilanasi (Bacillus circulans) 1. Realizzazione di un modello di struttura tridimensionale al computer 2. Individuazione dei siti potenziali in cui introdurre ponti disolfuro 3. Realizzazione di 8 mutanti più termostabili del wt Uno in particolare risultava 2 volte più attivo dell enzima wt a 60

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34 Cambiamento dell asparagina in altri aminoacidi Stabilità a 100 C dell enzima del lievito triosofosfato-isomerasi e dei suoi derivati manipolati geneticamente. Aminoacido in posizione Enzima Emivita (min) wt Asn Asn 13 A Asn Thr 17 B Asn Ile 16 C Thr Ile 25 D Asp Asn 11 La stabilità dell enzima è espressa dall emivita, ossia dal tasso di inattivazione dell enzima a 100 C.

35 Riduzione dei gruppi SH liberi IFNβ umano espresso in E. coli: => Formazione di dimeri e oligomeri => 10% di attività Analisi della sequenza

36 Riduzione dei gruppi SH liberi

37 Riduzione dei gruppi SH liberi Ser 17

38 Incremento dell attività enzimatica [Necessità di conoscere la conformazione del sito attivo] Tirosil-tRNA-Sintetasi (B. stearothermophylus)

39 Tyrosyl-tRNA-Sinthetase Ala51 Treonina (Thr)51 Pro51

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41 Modificazione del co-fattore enzimatico Subtilisine Serina-proteasi secrete da batteri Gram+ Ioni Ca ++ che conferiscono stabilità all enzima

42 Sviluppo della subtilisina modificata 1. Determinazione della struttura ai raggi X 2. Clonaggio del gene BPN da B. amyloliquefaciens 3. Delezione aa (sito legante il Ca ++ ) 4. Mutagenesi random su 10 aa coinvolti nell interazione con il dominio legante il Ca ++, distribuiti in 4 regioni: 1) N-terminale (aa 2-5) 2) ansa omega (aa 36-44) 3) elica α (aa 63-85) 4) foglietto β (aa ) Scopo: stabilizzare l enzima

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44 Modificazione della specificità dell enzima Come ottenere nuove endonucleasi di restrizione che tagliano raramente FokI Nuove endonucleasi sito-specificge pt7 FokI Sito di taglio per la Trombina (Gly 4 Ser) 3 Conferisce flessibilità

45 Aumento della stabilità e della specificità enzimatica Enzima attivatore tissutale del plasminogeno (tpa) Serina-proteasi utilizzata in campo clinico per sciogliere i coaguli viene rapidamente eliminato dal circolo => deve essere somministrato in concentrazioni elevate => può causare emorragie interne Esigenza di tpa stabile nel plasma e maggiormente specifico per la fibrina dei coaguli

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47 Identificazione del sito di coniugazione della proteina SUMO su PLZF (Promyelocytic leukemia zinc finger) Kang et al. (2003) J Biol Chem 278, 51479

48 Identificazione dei siti di ubiquitinazione della α-spettrina eritrocitaria Repeat Mutations 17 K3,4,5R 17 K25R 17 K27R 17 K25,27R 17 K49R 17 K70,71,73R 17 K95,97,99R 18 K14,16R 18 K20R 18 K25R 125 I-Ub GSTα α16-17 ubiquitination % of WT W T 17K49R 17K25,27R 17K27R 17K25R 17K3,4,5R 18K14,16R 18K20R 18K25R 17K95,97,99R 17K70,71,73R Galluzzi et al (2001) FEBS Letters 489, 254

49 Sequenza carbossiterminale della α-spettrina eritrocitaria umana. A CCA CGG GTC GAA GCC ATC TCT CTG GCT ATG ACT ACG TTG GCT TCA CCA ATT CCT ACT 2397 P R V E A I S L A M T T L A S P I P T TTG GCA ACT AAT AAG CAG CTC CTC GTG GAT CGT AGA AAA TCT TAG 7476 L A T N K Q L L V D R R K S B CCA CGG GG T CGA AGC CAT CTC TCT GGC TAT GAC TAC GTT GGC TTC ACC AAT TCC TAC 2397 P R G R S H L S G Y D Y V G F T N S Y TTT GGC AAC TAA TAA GCA GCT CCT CGT GGA TCG TAG AAA ATC TTA G 7477 F G N Questa inserzione provoca un cambiamento nella fase di lettura e la proteina risulta 11 aa più corta (2418 residui invece di 2429) e con sequenza diversa (aa ).

50 5-AGCAATATAT GGACCCACCG-3 (5 Primer) 5-AGCAATATAT GGACCCACGG GGTCGA...AATAAGCAGC TCCTCGTGGA-3 (100pb) 3-TTATTCGTCG AGGAGCACCT-5 (3 Primer) Sito di taglio ScrFI: CCNGG Dopo Mutagenesi: Se 4 G la sequenza mutata è CCGGG: ScrFI può tagliare (2 frammenti di 81 e 19 pb) Se 3 G la sequenza mutata è CCGGT: ScrFI non può tagliare (prodotto di PCR intero, 100 pb)

51 L bp bp bp bp - 19 bp Elettroforesi su gel d agaroso dei prodotti di PCR digeriti con ScrFI. Lane 1: controllo non digerito. Lanes dalla 2 alla 6: prodotti di PCR digeriti.

52 Source Website address US Dept. Of Commerce Amersham Biosciences trix/upp01077.nsf/content/na_homepage Clontech Stratagene Promega