Interleukin-4 ELISA BE C. Istruzioni per l Uso

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1 Istruzioni per l Uso Interleukin-4 ELISA Dosaggio immunoenzimatico per la determinazione quantitativa di interleuchina-4 (IL-4) umana nei supernatanti di colture cellulari, siero, plasma e urina umani. BE C I B L I N T E R N A T I O N A L G M B H Flughafenstrasse 52a Phone: +49 (0) IBL@IBL-International.com D Hamburg, Germany Fax: +49 (0)

2 1 TABLE OF CONTENTS 1 Uso previsto 2 2 Sommario 2 3 Principio del test 2 4 Reagenti Forniti 3 5 Istruzioni di Conservazione 4 6 Prelievo e conservazione die campioni 4 7 Materiali necessari ma non forniti 4 8 Precauzioni per l'uso 5 9 Preparazione dei Reagenti 6 10 Procedura del Test 8 11 Calcolo dei Risultati Limiti della Procedura Caratteristiche di Prestazione Informazioni per gli ordini Sommario di Preparazione dei Reagenti Sommario di Procedura del Test Riferimenti Bibliografici Sul Prodotto 17

3 2 1 Uso Previsto L IL-4 umana ELISA è un dosaggio immunoassorbente legato agli enzimi per il rilevamento quantitativo dell IL-4 umano. L IL-4 umana ELISA è per uso diagnostico in vitro. Non si usa per procedure terapeutiche. 2 Sommario L IL-4 umana esiste in forme di peso molecolare tra 15 e 19 kda, il che denota una variabilità delle glicosilazioni. Il gene dell IL-4 umana si trova sul braccio lungo del cromosoma 5, in stretta associazione con i geni dell IL-13, IL-5 GM-CSF ed IL-3. L IL-4 media la sua funzione legandosi ai recettori espressi sulle cellule-target. I recettori dell IL-4 presentano un affinità di circa M. I recettori esistono in linfociti e macrofagi B e T appena preparati oltre che in varie linee cellulari, comprese le linee cellulari linfoidi, le linee mastocitarie, una varietà di altre linee cellulari ematopoietiche, fibroblasti e di linee cellulari stromali. Nelle cellule T e B i recettori sono presenti in numero ridotto (ca. 400) e risultano essere up-regolati dall IL-2 e dall IL-4. L IL-4 è prodotto da un sottoinsieme particolare cellule effettrici T helper di tipo 2 (Th2). Queste cellule hanno la tendenza a creare un insieme specifico di linfochine che comprendono IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-3 e GM-CSF e non producono IL-2. IFN-gamma e la linfotossina (TNF-beta). A parte le cellule T si è dimostrato che i mastociti possono produrre IL-4). L IL-4 esercita vari effetti su più tipi di cellule ematopoietiche. Sulle cellule B l IL-4 promuove il class-switching immunologico negli isotopi IgE ed IgG1 ed esercita un up-regulation dell MHC di classe II e l espressione del CD23. Può promuovere la sopravvivenza, la crescita e la differenziazione dei linfociti T e B, dei mastociti e delle cellule endoteliali. L IL-4 può inoltre inibire la produzione di TNF, IL-1 ed IL-6 attivando macrofagi. 3 Principio del Test I micropozzetti vengono rivestiti con un anticorpo di rivestimento IL-4 anti-umana. Figura 1 Micropozzetto Rivestito Anticorpo di Rivestimento L IL-4 umana presente nel campione o nello standard si lega agli anticorpi assorbiti dai micropozzetti. Vi si aggiunge un anticorpo anti-umano IL-4 biotina coniugato, che si lega con l IL-4 umana catturata dal primo anticorpo. Figura 2 Prima Incubazione Standard o Campione Coniugato di Biotina

4 3 Dopo l incubazione l anticorpo IL-4 anti-umana biotina coniugato non legato viene rimosso durante una fase di lavaggio. Si aggiunge la streptavidina-hrp che si lega all anticorpo IL-4 anti-umana biotina coniugato. Figura 3 Seconda Incubazione Streptavidina-HRP - Dopo l incubazione la Streptavidina-HRP non legata viene rimossa con una fase di lavaggio e ai pozzetti viene aggiunta una soluzione dei substrato reattiva all HRP. Figura 4 Terza Incubazione In proporzione alla quantità di IL-4 umana presente nel campione o nello standard si forma un prodotto colorato. La reazione viene terminata aggiungendo l acido e l assorbanza si misura a 450 nm. Si prepara una curva standard sulla base di 7 diluizioni standard di IL-4 umana e si determina la concentrazione del campione di IL-4 umana. Figura 5 Substrato Substrato post-reazione 4 Reagenti Forniti 1 busta d alluminio con Piastra Micropozzetti rivestita con anticorpo monoclonale IL-4 umana 1 flaconcino (70 µl) di anticorpo Coniugato di Biotina (anticorpo monoclonale IL-4 umana) 1 flaconcino (150 µl) di Streptavidina-HRP 2 flaconcini human IL-4 Standard liofilizzato, 1000 pg/ml dopo ricostituzione 1 flaconcino (5 ml) con Tampone di Dosaggio concentrato 20x (PBS con 1 % Tween 20, 10 % BSA) 1 bottiglia (50 ml) con Tampone di Lavaggio concentrato 20x (PBS con 1 % Tween 20) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Substrato (tetrametilbenzidina) 1 flaconcino (15 ml) di Soluzione Bloccante (acido fosforico 1M) 4 Copripiastra adesivi

5 5 Istruzioni di Conservazione 4 Conservare i reagenti del kit a 2-8 C. Subito dopo l'uso riporre i reagenti nel luogo di conservazione a 2-8 C. La scadenza del kit e dei reagenti è indicata sulle etichette. La data di scadenza dei componenti del kit può essere garantita solo se questi sono conservati correttamente e, in caso di uso ripetuto di un componente, il reagente non è stato contaminato durante la prima manipolazione. 6 Prelievo e Conservazione dei Campioni Con questo dosaggio sono stati testati il supernatante delle colture cellulari, il siero, il plasma ed la urina. Altri materiali biologici potrebbero essere idonei all uso per questo dosaggio. Dopo la coagulazione, rimuovere il siero dal coagulo non appena possibile. I campioni contenenti un precipitato visibile devono essere chiarificati prima di essere usati nel dosaggio. Non usare campioni emolizzati in maniera grossolana, o lipemici. I campioni devono essere aliquotati e conservati sotto zero a -20 C, per evitare la perdita di IL-4 umana bioattiva. Se i campioni devono essere usati entro 24 ore, possono essere conservati a una temperatura tra 2 C ed 8 C (per la stabilità del campione fare riferimento al punto 13.5). Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Prima del dosaggio, il campione congelato dev essere portato a temperatura ambiente in modo graduale e mescolato con cautela. No scongelare i campioni in un bagnomaria a 37 C. Non vortice o agitare bruscamente i campioni. 7 Materiali necessari ma non forniti Pipette graduate da 5 ml e 1000 ml Micropipette adattabili da 5 µl a 1000 µl a canale singolo, con punte usa e getta Micropipette adattabili da 50 µl to 300 µl multicanale con punte usa e getta Micropipetta 8-Canali con contenitori per reagenti Becher, beute, cilindri necessari alla preparazione dei reagenti Spruzzetta per lavaggi, lavatore per micropiastre automatico o semi automatico. Lettore per micropiastre in grado di leggere ad assorbanza di 450 nm (lunghezza d onda di riferimento 620 nm) Acqua bidistillata o deionizzata Calcolatore statistico con programma che esegua l analisi di regressione

6 8 Precauzioni per l'uso 5 Tutti i prodotti chimici vanno considerati come potenzialmente pericolosi. Raccomandiamo, perciò, l'utilizzo di questo prodotto solo da personale addestrato alle tecniche di laboratorio e che siano avvezze alle comuni pratiche di laboratorio. Indossare abbigliamento idoneo come camici, guanti ed occhiali. Attenzione ad evitare contatto con la pelle e gli occhi. Nel caso di contatto con pelle o occhi, immediatamente lavare con acqua. Consultare la scheda di sicurezza del prodotto per specifici consigli. I reagenti sono per uso in vitro diagnostico e non sono per uso terapeutico. Non mischiare tra loro reagenti di diversi lotti o provenienza. Non usare i kit dopo la data di scadenza. Non esporre i reagenti del kit, durante la conservazione e incubazione a forti fonti di luce. Non pipettare utilizzando la bocca. Non mangiare o fumare nell'area dove sono utilizzati i reagenti dei kit o i campioni. Evitare il contatto dei reagenti o campioni con la pelle o le mucose. Guanti di gomma o lattice dovrebbero essere sempre indossati quando si usano reagenti e campioni. Evitare il contatto tra il substrato del kit e agenti ossidanti e metallo. Evitare schizzi o produzione di aereosol. Per evitare contaminazione microbica o cross-contaminazione dei reagenti o dei campioni che invaliderebbero il test, usare sempre pipette e puntali mono-uso. Usare vaschette pulite e dedicate per la dispensare il reagente substrato. L'esposizione agli acidi inattiva il coniugato. Acqua distillata o de-ionizzata deve essere utilizzata per la preparazione dei reagenti. La soluzione di substrato deve essere portata a temperatura ambiente prima dell'utilizzo. Decontaminare ed eliminare i campioni e tutto il materiale potenzialmente contaminante perchè potrebbero contenere agenti infettanti. Il metodo preferito per la decontaminazione è l'autoclavaggio per minimo 1 ora a C. Gli scarti liquidi, non contenenti acido e gli scarti neutralizzati possono essere mischiati con sodio ipoclorido in un volume finale di 1.0 %. Lasciare minimo 30 minuti per l'effettiva decontaminazione. Scarti liquidi contenenti acido devono essere neutralizzati prima dell'aggiunta di sodio ipoclorido.

7 9 Preparazione dei Reagenti 6 Prima di cominciare con le procedure del test i Concentrati dei Tamponi devono essere portati a temperatura ambientale e diluiti alle concentrazioni adeguate. Se i Concentrati dei Tamponi presenta cristalli in sospensione, riscaldare lievemente i tamponi fino a ottenere la completa dissoluzione dei cristalli. 9.1 Tampone di Lavaggio (1x) Versare l'intero contenuto (50 ml) del Tampone di Lavaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 1000 ml. Portare il volume finale a 1000 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Trasferire il prodotto in una bottiglia pulita e conservare a temperature comprese fra 2 C e 25 C. Il Tampone di Lavaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Lavaggio (1x) secondo la tabella seguente: Numero di strisce Tampone di Lavaggio (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Tampone di Dosaggio (1x) Versare l'intero contenuto (5 ml) del Tampone di Dosaggio Concentrato (20x) in un cilindro graduato pulito da 100 ml. Portare il volume finale a 100 ml utilizzando acqua distillata o acqua deionizzata. Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma. Conservare a temperatura compresa fra 2 C e 8 C. Il Tampone di Dosaggio (1x) è stabile per 30 giorni. Se necessario, è possibile preparare il Tampone di Dosaggio (1x) secondo la tabella seguente: Numero di strisce Tampone di Dosaggio (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Coniugato di Biotina Il Coniugato Biotina deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. La Soluzione Coniugato Biotina concentrata deve essere diluito 1:100 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di strisce Coniugato di Biotina (ml) Tampone del Saggio (1x) (ml)

8 7 9.4 Streptavidina-HRP Il Streptavidina-HRP deve essere utilizzato entro 30 minuti dalla diluizione. Il Streptavidina-HRP concentrato deve essere diluito 1:200 con Tampone di Dosaggio (1x) in una provetta di plastica pulita secondo la tabella seguente: Numero di strisce Streptavidina-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard IL-4 Umana Ricostituire lo standard IL-4 umana aggiungendo con acqua distillata per essattamente 10 minuti. Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino. Girare o mescolare gentilmente per garantire la completa ed omogenea solubilizzazione (concentrazione dello standard ricostituito = 1000 pg/ml). Prima di fare le diluizione mescolare bene. Dopo l'uso, lo standard rimanente non può essere riutilizzato e deve essere buttato. La diluizione dello standard può essere fatto direttamente nella piastra (vedi 10.c.) oppure nei tubi (vedi 9.5.1) Diluizione degli Standard esterni Etichettare 7 tubi, uno per ogni punto dello standard. S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7 Preparare diluizione seriali 1:2 per lo standard nel seguente modo: Pipettare 225 ul di Tampone del Saggio (1x) nei tutti tubi. Pipettare 225 ul di ricostituito standard (concentrazione dello standard = 1000 pg/ml) nel primo tubo, etichettato S1, e mescolare (concentrazione dello standard 1 = pg/ml). Pipettare 225 ul di questa diluizione nel secondo tubo, etichettato S2, mischiare accuratamente prima del successivo trasferimento. Ripetere le 5 diluizioni seriali in modo da creare i punti della curva di calibrazione (vedere Figura 6) Tampone del Saggio (1x) serve come bianco. Figura 6 Transferire 225 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-4 Umana Standard Ricostituito Tampone di Dosaggio (1x) 225 µl Buttare 225 µl

9 10 Procedura del Test 8 a. Stabilire il numero di strip dei micropozzetti necessarie per analizzare la quantità desiderata di campioni più le strip per i bianchi e gli standard. Tutti i campioni, gli standardi, il bianco e il devono essere processati in duplicato. Rimuovere dal supporto le strip micropozzetti non utilizzate e conservarle nella bustina metallica contenente la polvere essiccante, mantenendole a 2-8 C e perfettamente sigillate. b. Lavare due volte le strip micropozzetti utilizzando circa 400 µl di Tampone di Lavaggio per pozzetto, aspirando accuratamente il contenuto dei micropozzetti tra un lavaggio e l'altro. Permettere al tampone di lavaggio di rimanere, nei pozzetti, circa secondi prima dell'aspirazione. Evitare di scalfire la superficie dei micropozzetti. Dopo l'ultimo lavaggio, asciugare le strip micropozzetti con un tampone o carta assorbente per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Utilizzare le strip subito dopo il lavaggio o sistemarle capovolte su carta assorbente umida per non più di 15 min. Non lasciar asciugare i pozzetti. c. Diluizione dello standard in micropozetti (alternativamente la diluizione dello standard può avvenire in tubi vedi 9.5.1) Aggiungere 100 µl di Tampone del Saggio (1x) in duplicato a tutti i pozzetti dello standard. Pipettare 100 µl standard preparato (vedi preparazione dello standard, concentrazione 1000 pg/ml) in duplicato nei pozzetti A1 e A2 (vedi Tavola 1). Mescolare il contenuto dei pozzetti A1 e A2 attraverso ripetute aspirazione ed iniezioni (concentrazione dello standard 1, S1 = pg/ml) e trasferire 100 µl, rispettivamente, ai pozzetti B1 e B2 (vedere Figura 7). Fare attenzione a non graffiare la parte interna dei pozzetti. Continuare questa procedura per 5 volte, creando due colonne di standard in diluizione con concentrazione da a 7.8 pg/ml. Buttare 100 µl del contenuto degli ultimi pozzetti (G1 e G2).

10 Figura 7 9 Trasferire 100 µl S1 S2 S3 S4 - S7 IL-4 Umana Standard Ricostituito Tampone di Dosaggio (1x) 100 µl Buttare 100 µl In caso di diluizione esterna dello standard (vedi 9.5.1) pipettare 100 µl di queste diluizioni standard (S1 S7) nei pozzetti degli standard come da Tavola 1. Tavola 1 Tavola rappresenta un esempio dell'organizzazione dei bianchi, standardi e campioni nei pozzetti: A Standard 1 (500.0 pg/ml) B Standard 2 (250.0 pg/ml) C Standard 3 (125.0 pg/ml) D Standard 4 (62.5 pg/ml) E Standard 5 (31.3 pg/ml) F Standard 6 (15.6 pg/ml) G Standard 7 (7.8 pg/ml) Standard 1 (500.0 pg/ml) Standard 2 (250.0 pg/ml) Standard 3 (125.0 pg/ml) Standard 4 (62.5 pg/ml) Standard 5 (31.3 pg/ml) Standard 6 (15.6 pg/ml) Standard 7 (7.8 pg/ml) Campione 1 Campione 1 Campione 2 Campione 2 Campione 3 Campione 3 Campione 4 Campione 4 Campione 5 Campione 5 Campione 6 Campione 6 Campione 7 Campione 7 H Bianco Bianco Campione 8 Campione 8

11 d. Dispensare 100 µl di Tampone di Dosaggio (1x) in duplicato ai pozzetti de bianco. e. Dispensare 50 µl di Tampone di Dosaggio (1x) in duplicato ai pozzetti dei campioni. f. Dispensare 50 µl di campione in duplicato ai pozzetti dei campioni. 10 g. Preparare il Coniugato di Biotina (consultare la sezione Coniugato Biotina 9.3 sulla preparazione dei reagenti). h. Dispensare 50 µl di Coniugato di Biotina a ciascun pozzetto. i. Coprire con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 2 ore utilizzando, se disponibile, un vortex a 400 rpm. j. Preparare la Streptavidina-HRP (consultare la sezione Streptavidina-HRP 9.4 sulla preparazione dei reagenti). k. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strip della pozzeti 3 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. l. Dispensare 100 µl di Streptavidina-HRP a ciascun pozzetto. m. Coprire con un copripiastra e incubare a temperatura ambiente (18-25 C) per 1 ora utilizzando, se disponibile, un vortex a 400 rpm. n. Rimuovere il copripiastra e svuotare i pozzetti. Lavare le strip della pozzeti 3 volte come descritto in punto b. del protocollo. Procedere immediatamente al punto successivo. o. Pipettare 100 µl di Soluzione Substrato TMB in tutti i pozzetti, inclusi quelli del bianco. p. Incubare le strip a temperatura ambiente (18-25 C) per circa 10 minuti. Evitare l'esposizione diretta a luci intense. È necessario monitorare i valori D.O. a livello della piastra e interrompere la reazione del substrato (vedi il punto prossimo del protocollo) prima che i pozzetti positivi cessino di essere appropriatamente registrabili. La determinazione del tempo necessario per lo sviluppo del colore dev'essere fatto per ogni singolo parametro. Si raccomanda di aggiungere la soluzione di stop quando lo standard più elevato ha sviluppato un colore blu scuro. Alternativamente lo sviluppo del colore può essere monitorato con un lettore ELISA a 620 nm. La reazione del substrato deve essere bloccata non appena viene misurato un valore della DO di q. Interrompere la reazione enzimatica pipettando rapidamente 100 µl di Soluzione Bloccante in ciascun pozzetto, inclusi i pozzetti del bianco. È importante che la soluzione bloccante si diffonda rapidamente e uniformemente attraverso i micropozzetti per inattivare completamente l'enzima. I risultati devono essere letti immediatamente dopo l'aggiunta della soluzione bloccante o entro 1 ora se le strip sono conservate in un luogo buio a 2-8 C. r. Leggere l'assorbanza di ciascun micropozzetto su uno spettrofotometro che utilizza 450 nm come lunghezza d'onda primaria (620 nm come lunghezza d'onda di riferimento alternativa; valori da 610 nm a 650 nm sono accettabili). Azzerare il lettore della piastra secondo le istruzioni del produttore e utilizzando i pozzetti del bianco. Determinare l'assorbanza sia dei campioni, sia degli standard. Note: In caso di incubazione senza agitazione i valori di densità ottica (D.O.) potranno essere più bassi di quanto indicato sotto. Tuttavia i risultati saranno da ritenersi validi.

12 11 11 Calcolo dei Risultati Calcolare i valori medi dell assorbanza per ogni set di standard e campioni duplicati. I duplicati devono rientrare nel 20 % del valore medio. Creare una curva standard segnando l assorbanza media di ogni concentrazione standard sull ordinata contro la concentrazione di IL-4 umana sull ascissa. Disegnare una curva di bestfit congiungendo i punti del grafico (si raccomanda una curva di best-fit basata su 5 parametri). Per determinare la concentrazione di IL-4 umana circolante per ogni campione, trovare prima il valore medio di assorbanza sull ordinata ed estendere una linea orizzontale sulla curva standard. Nel punto d intersezione estendere una linea verticale fino all ascissa e leggere il valore corrispondente della concentrazione di IL-4 umana. Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione di 1:2 (50 µl di campione + 50 µl Tampone di Dosaggio (1x)), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x 2). Il calcolo dei campioni con una concentrazione superiore allo Standard 1 può dare per risultato livelli scorretti e bassi di IL-4 umana. Questi campioni richiedono un ulteriore pre-diluizione esterna secondo i valori stimati dell IL-4 umana, con un Tampone di Dosaggio (1x) in modo da quantificare con precisione i livelli reali di IL-4 umana. Si suggerisce che ogni attrezzatura per test stabilisca un campione di controllo della concentrazione di IL-4 umana conosciuta e che con ogni dosaggio esegua questo controllo aggiuntivo. Se i valori ottenuti non rientrano nel range del controllo stimato, i risultati del dosaggio possono non essere validi. La Figura 8 mostra una curva standard rappresentativa. Questa curva non può essere usata per dedurne risultati di test. Ogni laboratorio deve preparare una curva standard per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. Figura 8 Curva standard rappresentativa per l IL-4 umana ELISA. L IL-4 umana è stato diluito in 2 fasi seriali nel Tampone di Dosaggio (1x). Non usare questa curva per dedurne risultati di test. Una curva standard dev essere eseguita per ogni gruppo di strip per micropozzetti su cui si fa il dosaggio. 10 Absorption 450 nm Concentration (pg/ml)

13 12 Dati tipici relativi all uso dell IL-4 umana ELISA Lunghezza d onda: 450 nm Lunghezza d onda di riferimento: 620 nm Tavola 2 Standard Concentrazione di IL-4 Umana (pg/ml) D. O.a 450 nm D.O. Media a 450 nm Bianco I valori DO della curva standard possono variare a seconda delle condizioni di prestazione del dosaggio (ad es.: operatore, tecnica di pipettaggio o effetti della temperatura). Inoltre, il periodo di validità del kit può influenzare l attività enzimatica e quindi l intensità del colore. I valori misurati sono ancora validi. 12 Limiti della Procedura C.V. (%) Poichè le condizioni precise possono variare di dosaggio in dosaggio, bisogna stabilire una curva standard per ogni esecuzione del test. La contaminazione da batteri o funghi dei campioni da testare o dei reagenti o la contaminazione crociata tra reagenti può casusare risultati erronei. Sono preferibili punte di pipette usa e getta, beute o contenitori in vetro; i contenitori in vetro riutilizzabili devono essere lavati ed accuratamente risciacquati da tutti i detergenti prima dell uso. Un lavaggio improprio o insufficiente in qualsiasi fase della procedura causerà risultati falsi positivi o falsi negativi. Svuotare completamente i pozzetti prima di versare la Soluzione di Lavaggio fresca, riempire con il Tampone di Lavaggio come indicato per ogni ciclo di lavaggio e non lasciare i pozzetti scoperti, o non permettere che si asciughino per periodi prolungati. L uso della radioimmunoterapia ha aumentato significativamente il numero di pazienti con anticorpi umani IgG anti-topo (HAMA). HAMA può interferire con dosaggi che utilizzano anticorpi monoclonali murini, portando sia a risultati falsi positivi, sia falsi negativi. I campioni di siero contenenti anticorpi delle immunoglobuline murine possono essere ancora analizzati in questi dosaggi quando le immunoglobuline murine (siero, liquido ascitico o anticorpi monoclonali di specificità irrilevante) vengono aggiunti al campione.

14 13 13 Caratteristiche di Prestazione 13.1 Sensibilità Il limite di rilevamento dell IL-4 umana definito come la concentrazione dell analita, risultante in un assorbanza significativamente più alta rispetto a quella del mezzo di diluizione (media più 2 deviazioni standard), è stato determinato di 1.3 pg/ml (media di 6 dosaggi indipendenti) Riproducibilità Intra-Saggio La riproducibilità nell ambito del dosaggio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 6 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-4 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-4 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione (vedi Tavola 3). Il coefficiente complessivo di variazione intra-dosaggio calcolato è 4.8 %. Tavola 3 La concentrazione media di IL-4 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione Campione Esperimento Concentrazione Media di IL-4 Umana (pg/ml) Coefficiente di Variazione (%)

15 Inter-Saggio La riproducibilità da dosaggio a dosaggio nell ambito di un laboratorio è stata valutata in 3 esperimenti indipendenti. Ogni dosaggio è stato eseguito con 6 replicati di 6 campioni di siero contenenti diverse concentrazioni di IL-4 umana. Per ogni micropiastra sono state create 2 curve standard. I dati qui di seguito illustrano la concentrazione media di IL-4 umana ed il coefficiente di variazione calcolato su 18 determinazioni di ogni campione (vedi Tavola 4). Il coefficiente di variazione inter-dosaggio complessivo calcolato era del 5.6 %. Tavola 4 La concentrazione media di IL-4 umana ed il coefficiente di variazione per ogni campione. Campione Concentrazione Media di IL-4 Umana (pg/ml) Coeffiziente di Variazione (%) Test di Recupero Il test di recupero è stato valutato addizionando 4 livelli di IL-4 umana al siero. I recuperi sono stati determinati nel corso di 3 esperimenti indipendenti, ognuno con 8 replicati. Il siero non addizionato è stato usato come bianco nel corso di questi esperimenti. l recupero rientrava in un range dal 75 % al 111 % con un recupero medio complessivo dell 94 % Parallelismo della Diluizione 3 campioni di siero con diversi livelli di IL-4 umana sono stati analizzati in diluizioni seriali multiple di 2 e con 4 replicati l uno. Il recupero rientrava in un range dal 104 % al 120 % con un recupero medio complessivo del 113 % 13.5 Stabilità del Campione Stabilità a Congelamento-Scongelamento Aliquote di campioni di siero (non addizionato o addizionati) sono state conservate a -20 C e scongelate 5 volte e sono stati determinati i livelli di IL-4 umana. Con il congelamento e lo scongelamento non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività della IL-4 umana Stabilità della Conservazione Aliquote di campioni di siero e di supernatanti di colture cellulari (addizionate o non addizionate) sono state conservate a -20 C, 2-8 C, a temperatura ambiente (TA) ed a 37 C e il livello di IL-4 umana ne è stato determinato dopo 24 ore. Durante la conservazione alle condizioni sopraindicate non si è rilevata una perdita significativa di immunoreattività dello IL-4 umana Specificità L interferenza dei fattori circolanti del sistema immune è stata valutata aggiungendo queste proteine in concentrazioni fisiologicamentre rilevanti ad un siero IL-4 umana positivo. Non è stata rilevata alcuna cross-reattività.

16 Valori Attesi Per la IL-4 umana è stato testato un pannello di 22 campioni di siero di donatori apparentemente sani (maschi e femmine) selezionati casualmente (random). No c erano livelli rilevabili di IL-4 umana trovati. I livelli di IL-4 umana elevati dipendono del tipo di disturbi immunologici. 14 Informazioni per gli Ordini Per gli ordini contattare: Vedi ultima pagina. Per informazioni tecniche contattare: IBL@IBL-International.com 15 Sommario di Preparazione dei Reagenti 15.1 Tampone di Lavaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Lavaggio 20x (50 ml) a 950 ml di acqua distillata. Numero di strisce Tampone di Lavaggio (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Tampone di Dosaggio (1x) Aggiungere Concentrato di Tampone di Saggio 20x (5 ml) a 95 ml di acqua distillata. Numero di strisce Tampone di Dosaggio (20x) (ml) Acqua Distillata (ml) Coniugato Biotina Fare una diluizione 1:100 di Coniugato di Biotina nel Tampone di Dosaggio (1x) Numero di strisce Coniugato Biotina (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Streptavidina-HRP Fare una diluizione 1:200 di Streptavidina-HRP nella Soluzione Tampone di Dosaggio (1x): Numero di strisce Streptavidina-HRP (ml) Tampone di Dosaggio (1x) (ml) Standard IL-4 Umana Ricostituire lo standard IL-4 umana aggiungendo con acqua distillata per essattamente 10 minuti. (Il volume di ricostituzione è indicato sull'etichetta della flaconcino).

17 16 16 Sommario di Procedura del Test 1. Determinare il numero di strisce di micropozzetti richiesto. 2. Lavare le strisce di micropozzetti due volte con il Tampone di Lavaggio. 3. Diluizione standard sulla piastra di micropozzetti: Aggiungere 100 µl di Tampone di Dosaggio (1x), in duplicato, a tutti i pozzetti standard. Pipettare 100 µl di standard preparato nei primi pozzetti e creare diluizioni di standard trasferendo 100 µl da pozzetto a pozzetto. Scartare 100 µl dagli ultimi pozzetti. Alternativamente diluizione esterna dello standard in tubi (vedi ): Pipettare 100 µl di queste diluizioni dello standard nei micropozzetti. 4. Aggiungere 100 µl di Tamponi di Dosaggio(1x), in duplicato, ai pozzetti del bianco. 5. Aggiungere 50 µl Tampone di Dosaggio (1x) ai pozzetti dei campioni. 6. Aggiungere 50 µl di campione in duplicato ai pozzetti per i campioni designati. 7. Preparare il Coniugato di Biotina. 8. Aggiungere 50 µl di Conjugato di Biotina a tutti i pozzetti. 9. Coprire le strip dei micropozzetti ed incubare per due ore (18-25 C). 10. Preparare la Streptavidina-HRP. 11. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con il Tampone di Lavaggio. 12. Aggiungere 100 µl di Streptavidina-HRP diluita a tutti i pozzetti. 13. Coprire le strisce di micropozzetti ed incubare per 1 ora a temperatura ambiente (18-25 C). 14. Svuotare e lavare le strisce dei micropozzetti 3 volte con il Tampone di Lavaggio. 15. Aggiungere 100 µl di Soluzione di Substrato TMB a tutti i pozzetti. 16. Incubare le strisce di micropozzetti per circa 10 minuti a temperatura ambiente (18-25 C). 17. Aggiungere 100 µl di Soluzione Bloccante a tutti i pozzetti. 18. Azzerare il lettore di micropozzetti e misurare l intensità del colore a 450 nm. Nota bene: Se le istruzioni di questo protocollo sono state seguite, i campioni sono stati diluiti in proporzione 1:2 (50 µl di campione + 50 µl Soluzione Tampone di Dosaggio (1x)), la concentrazione letta dalla curva standard dev essere moltiplicata per il fattore di diluizione (x2).

18 17 17 Riferimenti Bibliografici Sul Prodotto 1. Sun, Yong Jiang; Lim, T.K.; Ong, Adrian Kheng Yeow; Ho, Benjamin Choon Heng; Seah, Geok Teng; Paton, Nicholas I.. Tuberculosis associated with Mycobacterium tuberculosis Beijing and non-beijing genotypes: a clinical and immunological comparison. BMC Infectious Diseases 2006; 6: Drabko, Katarzyna; Bojarska-Junak, Agnieszka; Kowalczyk, Jerzy R.. Oxidative Status and Its Contribution to Extracellular Cytokine Secretion in Children with Acute Lymphoblastic Leukemia. Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) 2006; 108: Sanchez Perez, M.J.; Gonzalez-Reimers, E.M.I.L.; Santolaria-Fernandez, F.R.A.N.; de la Vega-Prieto, Maria Jose; Martinez-Riera, A.N.T.O.; Gonzalez, Pedro, de Abreu; Rodriguez Rodriguez, E.V.A.; Duran-Castellon, M.Carmen. Lipid Peroxidation and serum cytokines in acute alcoholic hepatitis. Alcohol and Alcoholism 2006; 41: Lacomba, Manuel Santos; Martin, Carmen Marcos; Chamond, Rafael Ramirez; Galera, Jose Maria Gallardo; Omar, Mohamed; Estevez, Eduardo Collantes. Aqueous and Serum Interferon {gamma}, Interleukin (IL) 2, IL-4, and IL-10 in Patients With Uveitis. Archives of Ophthalmology 2000; 118: Bocsi, J zsef; Hambsch, Jörg; Osmancik, Pavel; Schneider, Peter; Valet, Günter; T rnok, Attila. Preoperative prediction of pediatric patients with effusions and edema following cardiopulmonary bypass surgery by serological and routine laboratory data. Critical Care 2002; 6: Costa, M.; Saiz, A.; Casamitjana, R.; Castaner, M.Fernandez; Sanmarti, A.; Graus, F.; Jaraquedada, D.. T-cell reactivity to glutamic acid decarboxylase in stiff-man syndrome and cerebellar ataxia associated with polyendocrine autoimmunity. Clinical and Experimental Immunology 2002; 129: Castellano-Higuera, Ana; Gonzalez-Reimers, Emilio; Aleman-Valls, M. Remedios; Abreu- Gonzalez, Pedro; Santolaria-Fernandez, Francisco; Vega-Prieto, Maria Jose, de La; Gomez- Sirvent, Juan Luis; Pelazas-Gonzalez, Ricardo. Cytokines and lipid peroxidation in alcoholics with chronic hepatitis C virus infection. Alcohol and Alcoholism 2008; 43: Donalisio, Manuela; Cornaglia, Maura; Landolfo, Santo; Lembo, David. TGF-[beta]1 and IL-4 downregulate human papillomavirus-16 oncogene expression but have differential effects on the malignant phenotype of cervical carcinoma cells. Virus Research 2008; 132: Kikutani, H.; Inui, S.; Sato, R.; Barsumian, E.L.; Owaki, H.; Yamasaki, K.; Kaisho, T.; Uchibayashi, N.; Hardy, R. R.; Hirano, T.. Molecular structure of human lymphocyte receptor for immunoglobulin E. Cell 1986; 47: Hamaguchi, Y.; Kanakura, Y.; Fujita, J.; Takeda, S.; Nakano, T.; Tarui, S.; Honjo, T.; Kitamura, Y.. Interleukin 4 as an essential factor for in vitro clonal growth of murine connective tissue-type mast cells. J. Exp. Med. 1987; 165: Lee, J.D.; Swisher, S.G.; Minehart, E.H.; McBride, W.H.; Economou, J. S.. Interleukin-4 downregulates interleukin-6 production in human peripheral blood mononuclear cells. J. Leukoc. Biol. 1990; 47: Plaut, M.; Pierce, J. H.; Watson, C. J.; Hanley-Hyde, J.; Nordan, R. P.; Paul, W. E.. Mast cell lines produce lymphokines in response to cross-linkage of Fc epsilon RI or to calcium ionophores. Nature 1989; 339: Puri, R. K.; Finbloom, D. S.; Leland, P.; Mostowski, H.; Siegel, J. P.. Expression of high-affinity IL-4 receptors on murine tumour infiltrating lymphocytes and their upregulation by IL-2. Immunology 1990; 70: Sideras, P.; Bergstedt-Lindqvist, S.; MacDonald, H. R.; Severinson, E.. Secretion of IgG1 induction factor by T cell clones and hybridomas. Eur. J. Immunol. 1985; 15:

19 Lowenthal, J. W.; Castle, B. E.; Christiansen, J.; Schreurs, J.; Rennick, D.; Arai, N.; Hoy, P.; Takebe, Y.; Howard, M.. Expression of high affinity receptors for murine interleukin 4 (BSF-1) on hemopoietic and nonhemopoietic cells. J. Immunol. 1988; 140: Park, L. S.; Friend, D.; Grabstein, K.; Urdal, D. L.. Characterization of the high-affinity cellsurface receptor for murine B-cell-stimulating factor 1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1987; 84: Brown, M.; Hu-Li, J.; Paul, W. E.. IL-4/B cell stimulatory factor 1 stimulates T cell growth by an IL-2-independent mechanism. J.Immunol. 1988; 141: Foxwell, B. M.; Woerly, G.; Ryffel, B.. Identification of interleukin 4 receptor-associated proteins and expression of both high- and low-affinity binding on human lymphoid cells. Eur. J. Immunol. 1989; 19: Spits, H.; Yssel, H.; Paliard, X.; Kastelein, R.; Figdor, C.; de Vries, J. E.. IL-4 inhibits IL-2- mediated induction of human lymphokine-activated killer cells, but not the generation of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in mixed leukocyte cultures. J. Immunol. 1988; 141: Toi, M.; Harris, A.L.; Bicknell, R.. Interleukin-4 is a potent mitogen for capillary endothelium. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991; 174: Hart, P.H.; Vitti, G.F.; Burgess, D.R.; Whitty, G.A.; Piccoli, D.S.; Hamilton, J. A.. Potential antiinflammatory effects of interleukin 4: suppression of human monocyte tumor necrosis factor alpha, interleukin 1, and prostaglandin E2. Proc. Natl. Acad. Sci.U S A 1989; 86: Coffman, R. L.; Ohara, J.; Bond, M. W.; Carty, J.; Zlotnik, A.; Paul, W. E.. B cell stimulatory factor-1 enhances the IgE response of lipopolysaccharide-activated B cells. J. Immunol. 1986; 136: Grabstein, K. H.; Park, L. S.; Morrissey, P. J.; Sassenfeld, H.; Price, V.; Urdal, D. L.; Widmer, M. B.. Regulation of murine T cell proliferation by B cell stimulatory factor-1. J. Immunol. 1987; 139: Roehm, N. W.; Leibson, H. J.; Zlotnik, A.; Kappler, J.; Marrack, P.; Cambier, J. C.. Interleukininduced increase in Ia expression by normal mouse B cells. J. Exp. Med. 1984; 160: Mosmann, T. R.; Bond, M. W.; Coffman, R. L.; Ohara, J.; Paul, W. E.. T-cell and mast cell lines respond to B-cell stimulatory factor 1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 1986; 83:

20 Symbols / Symbole / Symbôles / Símbolos / Símbolos / Σύµβολα REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N.º Cat.: / N. Cat.: / Αριθµός-Κατ.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.º: / Lotto n.: / Αριθµός -Παραγωγή: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser à: / Usado por: / Usar até: / Da utilizzare entro: / Χρησιµοποιείται από: No. of Tests: / Kitgröße: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N.º de Testes: / Quantità dei tests: / Αριθµός εξετάσεων: CONC Concentrate / Konzentrat / Concentré / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Συµπύκνωµα LYO IVD Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilisé / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / Λυοφιλιασµένο In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Médical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Médico para Diagnóstico In Vitro. / Equipamento Médico de Diagnóstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / Ιατρική συσκευή για In-Vitro ιάγνωση. Evaluation kit. / Nur für Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour évaluation. / Juego de Reactivos para Evaluació. / Kit de avaliação. / Kit di evaluazione. / Κιτ Αξιολόγησης. Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instruções antes de usar. / Leggere le istruzioni prima dell uso. / ιαβάστε τις οδηγίες πριν την χρήση. Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schützen. / Garder à l abri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Manténgase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / Να φυλάσσεται µακριά από θερµότητα και άµεση επαφή µε το φως του ηλίου. Store at: / Lagern bei: / Stocker à: / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / Αποθήκευση στους: Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / Παραγωγός: Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaución! / Cuidado! / Attenzione! / Προσοχή! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbôles des composants du kit. Símbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para símbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. Για τα σύµβολα των συστατικών του κιτ συµβουλευτείτε το ΠΑΡΕΧΟΜΕΝΑ ΥΛΙΚΑ. IBL AFFILIATES WORLDWIDE IBL International GmbH Flughafenstr. 52A, Hamburg, Germany IBL International Corp. 194 Wildcat Road, Toronto, Ontario M3J 2N5, Canada Tel.: + 49 (0) Fax: IBL@IBL-International.com WEB: Tel.: +1 (416) Fax: Sales@IBL-International.com WEB: LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturer s liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer Symbols Version 3.5 /