Come identificare i Cromosomi

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1 Come identificare i Cromosomi Fino al 1970, i cromosomi sono stati classificati in base alle dimensioni ed alla posizione del centromero. A I più grandi (metacentrici) B Grandi (submetacentrici) C Medi (submetacentrici, incluso il chr.x) D Grandi (acrocentrici) E Piccoli (submetacentrici) F Piccoli (metacentrici) G Piccoli (acrocentrici, incluso il chr. Y) 60

2 Bandeggio dei Cromosomi L introduzione di specifiche tecniche di colorazione (bandeggio) a permesso di: Identificare i diversi cromosomi Definire più accuratamente le alterazioni cromosomiche Le tecniche di bandeggio prevedono: Denaturazione o digestione enzimatica dei cromosomi L utilizzo di coloranti che si legano in maniera specifica al DNA Il cromosoma mostra la tipica alternanza di bande chiare e scure. 61

3 International System for human Cytogenetic Nomenclature (ISCN) 62

4 Tipi di bandeggio TECNICA PROCEDURA BANDING PATTERN Bandeggio G Bandeggio R (Reverse) Bandeggio Q Bandeggio C Colorazione NOR Proteolisi limitata (trattamento con tripsina) seguita dalla colorazione Giemsa Denaturazione al calore (regioni ricche in AT) seguita dalla colorazione Giemsa Proteolisi limitata (trattamento con tripsina) seguita dalla colorazione un colorante fluorescente (Quinacrina) Denaturazione con idrossido di bario e poi colorazione con Giemsa Colorazione con Nitrato di Argento Le bande scure sono regioni ricche in AT, le bande chiare sono ricche in GC Le bande scure sono regioni ricche in GC, le bande chiare sono ricche in AT (inverso del bandeggio G) Bandeggio analogo al bandeggio G (scure ricche in AT, chiare ricche in GC). Colora selettivamente anche il braccio lungo del chr. Y Colora selettivamente le regioni ricche in eterocromatina costitutiva (centromeri e regioni pericentromeriche) Colora selettivamente i satelliti dei chr. acrocentrici 13, 14, 15, 21 e 22 ed è esclusiva di queste regioni 63

5 Bandeggio G 64

6 Confronto tra bandeggi G and R-banding results show the addition of chromosomal material in the short arm of one chromosome 9(der(9)). C-banding results show the presence of heterochromatin into the der(9). 65

7 Bandeggio C 66

8 Colorazione NOR 67

9 Risoluzione del Cariotipo tradizionale Il limite di risoluzione di un analisi del cariotipo standard è di 4-6 Mb Il potere di risoluzione delle tecniche di bandeggio può essere aumentato analizzando i cromosomi in condizioni di minore condensazione (prometafase): Bassa (400 bande) Intermedia (550 bande) Alta (850 bande) 68

10 Cromosoma 4 (G-banding)

11 Cariotipo costituzionale: da quali cellule? Il cariotipo costituzionale può essere ottenuto da qualsiasi tipo di cellula somatica nucleata E fondamentale che la cellula sia in mitosi La fonte più semplice sono le cellule nucleate del sangue E sufficiente un prelievo di sangue venoso Il linfociti hanno un elevato indice mitotico se stimolati in coltura con fitoemoagglutinina (PHA) Fonti alternative di cellule: Fibroblasti (da biopsia cutanea) Una condizione di mosaicismo Cellule del midollo osseo (biopsia midollare) Sospetta leucemia (citogenetica oncologica) Amniociti (prelievo di liquido amniotico) Analisi in epoca prenatale 70

12 Cariotipo di routine Blocca in metafase (depolimerizza i microtubuli del fuso mitotico) 71

13 Cariotipo di routine 72

14 Cariotipo di routine 73

15 Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) dei Cromosomi L analisi dei cromosomi mediante FISH prevede l uso di sonde (molecole di DNA) di lunghezza variabile (2-500 Kb) marcate con un fluoroforo. Marcatura diretta Marcatura indiretta Nella FISH standard la sonda è omogena In alcune applicazioni è possibile utilizzare più sonde contemporaneamente e le immagini sono elaborate da sistemi di analisi computerizzati. E possibile analizzare i nuclei in interfase. Il chromosome painting è la forma più sofisticata di FISH Si utilizzano cocktail di sonde specifiche per i diversi cromosomi Le immagini rielaborate dal computer, in colori virtuali, consentono di distinguere i cromosomi e dettagliarne il bandeggio Il limite di risoluzione è di ~ 40 Kb 74

16 Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) dei cromosomi 75

17 Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) dei cromosomi 76

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20 Parziale trisomia del Chr 2 A. Cariotipo con tecnica classica B. M-FISH C. Rx-FISH

21 Rx-FISH (Rainbow Colors X Species) I cromosomi umani sono ibridate con sonde colorate da cromosomi di un primate (Gibbone). Il genoma di questa specie (2n=52) ha omologia del 98% con il genoma umano 80

22 Comparative Genomic Hybridization (CGH) Consente di evidenziare alterazioni quantitative (delezioni/duplicazioni) nei cromosomi metafasici. Il DNA estratto da due sorgenti cellulari diverse (Campione e Controllo) è marcato con due differenti fluorofori Entrambi i pool di sonde sono ibridati con cromosomi matafasici fissati su un vetrino I segnali di fluorescenza lungo i cromosomi sono dosati e sovrapposti (merge) evidenziando in colori virtuali il differente dosaggio Trova applicazione in citogenetica oncologica dove spesso si osservano cariotipi fortemente alterati. 81

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24 Array-CGH E l ulteriore evoluzione del CGH su cromosomi metafasici, ma con risoluzione molto elevata che consente di evidenziare alterazioni del numero di copie (Copy Number Variation, CNV) anche di 3.5 Kb. Il DNA estratto da due sorgenti cellulari diverse (Campione e Controllo) è marcato con due differenti fluorofori Entrambi i pool di sonde sono ibridati su un vetrino (microarray) su cui sono state fissate specifiche sequenze oligonucleotidiche rappresentative dell intero genoma I segnali di fluorescenza sono dosati e sovrapposti (merge) evidenziando in colori virtuali il differente dosaggio Consente di ricondurre immediatamente l alterazione osservata ad una precisa regione/sequenza del genoma. 83

25 Array-CGH 84

26 Array-CGH 85

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28 Polimorfismi cromosomici I cromosomi umani possono presentare variazioni morfologiche (polimorfismi) in diversi individui. Spesso interessano regioni costituite da DNA ripetitivo, funzionalmente inattivo e quindi non hanno alcun effetto patologico. Rientrano nella variabilità individuale che, a diversi livelli, si osserva nel nostro genoma. 87

29 Satelliti dei cromosomi acrocentrici Polimorfismi cromosomici più frequenti: Assenza dei satelliti di un cromosoma acrocentrico Espansione del DNA satellite Espansione delle regioni NOR Evidenziabili con il bandeggio C o colorazione NOR. 88

30 Variazioni dell eterocromatina pericentromerica Sono in genere espansioni, ma anche delezioni o inversioni. Tutti i cromosomi, più frequente in chr. 1, 9 e 16 L espansione dell eterocromatina pericentromerica del chr. 9 è presente nell 8% degli individui L inversione della stessa regione del chr. 9 è presente nell 1.5% degli individui Evidenziata con bandeggio C 89

31 Polimorfismi dell eucromatina Sono denominati HSR (Homogeneously Staining Regions). Bene caratterizzata la variante 9p+ (amplificazione di un segmento della banda 9p12) Altre varianti polimorfiche descritte a 15q11.2, 16p11.2 e 8p

32 Copy Number Variations (CNV) Sono una classe di varianti polimorfiche dell eucromatina normalmente presenti nella popolazione generale. Sono evidenziabili mediante array-cgh (per l elevata risoluzione della tecnica) Sono delezioni o amplificazioni di segmenti genici, in genere di piccole dimensioni ( Kb fino a 3Mb) Sono presenti in più del 1% della popolazione. 91

33 DGV 92

34 DECIPHER 93

35 3 anni, figlio unico di genitori non consanguinei Gravidanza normo decorsa (parto cesareo a termine) Tratti dismorfici Impianto basso delle orecchie Strabismo occhio dx Ipertelorismo Fronte alta e prominente Capelli sottili con attaccatura alta Labbro pendente Linguaggio assente Comportamenti ripetitivi RITARDO PSICOMOTORIO 94

36 acgh ISCAv2 8x60K (International Standard Cytogenetic Array) Delezione in eterozigosi (de novo) di circa 4.4Mb (chr1: ) a 1q24.2-q24.3, rilevata con 65 sonde. 95

37 UCSC genome browser chr1: La delezione coinvolge circa 40 geni. L aploinsufficienza della regione 1q24-q25 è stata associata a difetti cognitivi, bassa statura, microcefalia, mani e piedi piccoli, dita corte, più una variabilità di altri segni e sintomi. 96

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