Ematopoiesi primitiva e definitiva

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1 Biochimica e Fisiologia dell Eritropoiesi Gian Cesare Guidi Dipartimento di Scienze Morfologico- Biomediche Università di Verona Ematopoiesi primitiva e definitiva Ematopoiesi primitiva: sx produzione di G.R. nucleati che esprimono i geni globinici embrionari (embrione di gg) Ematopoiesi definitiva: dx produzione di G.R. anucleati che esprimono il gene globinico AGM: aorta-gonad-mesonephros BM: bone marrow FL: fetal liver; ery p : primitive erythroid Nature Immunology 2002;3:323 1

2 EMATOPOIESI Cellule staminali ematopoietiche (stem cells) Caratteristiche: Generano altre stem cells (auto-rinnovamento infinito ) Si differenziano in varie cellule progenitrici (linee di produzione specifiche) Stem cells nel midollo osseo: Escluse (B cell) e (T cell), tutte le cellule al di sopra della linea rossa sono stem cells. Stem cells possono rinnovarsi (in alto) o differenziarsi (in basso) eritroide proeritroblasto Stem cell progenitore mieloide pluripotente promieloblasto progenitore linfoide mieloide monocita macrofago (B-cell) (T-cell) piastrinico megacarioblasto eritrocita granulociti piastrine 2

3 Differenziazione delle stem cells (compartimenti) Regolazione molecolare dell ematopoiesi Processo ad elevata complessità Regolato da fattori di trascrizione finemente accordati, specifici per stadio di maturazione dipendenti dal contesto 3

4 Regolazione molecolare dell ematopoiesi Un singolo fattore di trascrizione ha differenti effetti quando espresso a differenti stadi L espressione di uno specifico fattore a differenti stadi può: modulare l ingresso nella linea cellulare definitiva facilitare l interazione con differenti proteine partner Regolazione molecolare dell ematopoiesi Intra-cellulare (nucleare): Fattori ubiquitari e fattori di trascrizione ristretti a linea cellulare regolano un programma altamente organizzato di espressione genica Extra-cellulare: Citochine, fattori di crescita, molecole di adesione supportano la proliferazione delle cellule progenitrici e ne determinano la direzione di differenziazione 4

5 Regolazione molecolare dell emato/eritropoiesi embrionaria Eur J Biochem 2002;269;3607 Fattori ubiquitari Stem cell leukemia (SCL) gene, conferisce vantaggio proliferativo alla linea eritroide sulla mieloide LMO2, agisce da ponte fra i fattori di trascrizione come GATA-1 Proto-oncogene c-myb espresso nelle linee ematopoietiche indifferenziate, diminuisce con la differenziazione; richiesto per l espansione cellulare definitiva 5

6 Fattori di trascrizione famiglia dei fattori GATA Noti 6 componenti della famiglia, ma solo GATA-1,-2,-3 sono ematopoietici Agiscono legando un motivo di 6 nucleotidi T/AGATAG/A ad azione cis nella regolazione della trascrizione genica eritroide Identificato per primo il cdna di GATA-1, poi distintamente gli altri due Caratteristiche dei fattori GATA Proteine Zn finger, la più usata classe di fattori di trascrizione Il motivo classico è Cys 2 His 2 in cui Zn stabilizza 2 strutture molto conservate che funzionano da sequenze di riconoscimento Il C-finger si lega al DNA, il N-finger interagisce con altri fattori di trascrizione (es.: FOG) I siti di binding possono attivare o reprimere l espressione genica 6

7 Zinc finger proteins Fattore GATA-2 Fattore espresso nei precursori eritroidi ove promuove proliferazione ma blocca differenziazione Precede l espressione di GATA-1 e deve diminuire con l aumento di GATA-1 per favorire la differenziazione 7

8 Fattore GATA-1 Gene locato sul cromosoma X (Xp11,23) Fattore essenziale per tutti gli aspetti della trascrizione genica e lo sviluppo delle linee eritroide megacariociticica promieolocitica eosinofila Espresso anche nella eosinofilia periferica della s. ipereosinofila 8

9 Finger N-terminale di GATA-1 GATA-1 interagisce con fattori di trascrizione della famiglia FOG usando questo zinc finger N-terminale. Tale interazione è cruciale per la capacità di GATA-1 di regolare la corretta espressione genica nelle cellule ematopoietiche Zn Cisteina U-shaped finger 1 di FOG-1 U-shaped è un membro della famiglia FOG (Friend Of GATA) Tramite il Finger 1 o 6 interagisce con GATA-1 per controllare l espressione genica Zn 1His 3Cys -hairpin 9

10 Complesso di trascrizione-attivazione eritroide SCL ed E47 legano un E box (CAGGTA), circa 10 bp a monte rispetto ad un motivo GATA; LMO2 e Lbd1 fanno da ponte fra SCL1 e GATA-1. Ma di solito GATA-1 lega DNA insieme con FOG Eur J Biochem 2002;269;3607 Interplay dei fattori GATA-2 vs. GATA -1 GATA-2, espresso nelle stem cells controlla le fasi precoci dell ematopoiesi GATA-2 attiva la trascrizione di GATA-1, prima dell autoregolazione di GATA-1 l espressione prolungata di GATA-2 nelle stem cells compromette la differenziazione e va regolata in modo stretto GATA-1 regola la differenziazione terminale e la funzione delle linee eritroide e megacariocitaria 10

11 Interplay dei fattori GATA-2 vs. GATA -1 GATA-2 attiva l espressione di GATA-1, mentre GATA- 1 reprime l espressione di GATA-2. Infine GATA-1 autoregola la propria espressione genica Acta Hematol 2002;108:237 Altri fattori di trascrizione EKLF - Erythroid Kruppellike factor BKLF - Basic KLF Neptune FKLF - Fetal KLF Fli-1 oncogene (famiglia ETS) Essenziale per esprimere - globina Regola espressione di proteina SHP-1, ridotta nel 60% delle policitemie vere Essenziale per esprimere - globina Nell espressione di e - globina Inibisce differenziazione eritroide - espressione repressa da EPO 11

12 Differenziazione dei precursori eritroidi Eur J Biochem 2002;269;3607 Eritropoietina (hepo) L ormone hepo è una glicoproteina acida di 34 kd. Regolatore primario della produzione di eritrociti Funzioni: promuove la differenziazione eritroide avvia la sintesi di emoglobina 12

13 Complesso EPO-recettore Attivazione/inattivazione di EPOr EPO legandosi cambia la conformazione del dimero EPOr cui segue transfosforilazione ed attivazione di JAK2: questa a sua volta fosforila residui tyr su EPOr con creazione di siti d attracco (P) per i domini SH2 di alcuni trasduttori come Stat5 e altre proteine di segnalazione che si attivano, si dissociano, poi dimerizzano e vanno al nucleo ove attivano geni fra cui quello che esprime proteina bcl-x antiapoptotica. La trasduzione sul recettore è inattivata da una fosfatasi, attivata dalla tirosin-fosfatasi SHP1che rimuove i P. PNAS 2001;98:

14 Attivazione/inattivazione di EPOr meccanismo completo Loop dell eritropoietina Il sensore renale dell ipossia avvia la produzione di EPO EPO segnala ai progenitori eritroidi midollari di iniziare a produrre eritrociti 4 gg di proliferazione e differenziazione nel midollo 3 giorni di maturazione. Perciò passa circa una settimana fra la segnalazione dell evento ipossico ed il rilascio di eritrociti in circolo 14

15 Loop dell eritropoietina Tipi di ipossia I. ipossiemica: da bassa po 2 - altitudine I. anemica: da riduzione di Hb per deficit Fe, Cu deficit B 12 altro (Hbpatie, emorragie, ecc.) I. stagnante: da ridotto flusso ematico tessutale I. citotossica: impedimento all uso di O 2 da parte delle cellule - avvelenamenti 15

16 Effetti dell ipossia J Appl Phys 2004;96:1187 HIF-1 Hypoxia inducible factor 1 Proteina eterodimerica specificamente coinvolta nel mantenere l omeostasi di O 2 Regola l attivazione di geni inducibili dall ipossia fra i quali il gene per EPO Nell ipossia il dimero si lega alla sequenza (A)CGTG presente nell elemento responsivo all ipossia di geni target controllati da po 2 come ad esempio l angiogenetico VEGF (vascular endothelial growth factor), EPO, ed alcuni della via glicolitica (MPGM, DPGM) 16

17 HIF-1 Hypoxia inducible factor 1 2 subunità, sempre presente e (labile, 14q21-24) presente nell ipossia nell ipossia coopera con per attivare la trascrizione di geni target fra cui EPO sub viene sempre prodotta ma in condizioni di normale po 2 subisce rapida proteolisi e non interagisce con nella figura si osserva l interazione di HIF-1 con il DNA su specifiche sequenze dette HRE (Hypoxia Response Elements) locate sui promotori di geni sensibili all ipossia Regolazione genica da po 2 HIF-1 è strettamente regolata da po 2 e si accumula rapidamente nelle cellule in ipossia (alto) In condizioni non ipossiche HIF-1 è prodotta ma subito degradata da proteasi (ubiquitina e legame con VHL basso) J Appl Phys 2004;96:

18 Eritropoiesi e bilancio del Ferro Regolazione basata sul controllo meticoloso dell assorbimento intestinale Non esiste regolazione escretoria Perdite: sangue mestruale desquamazione epiteliale di cute e mucose tratto G.I. tratto biliare vie urinarie Eritropoiesi e bilancio del Ferro Deficit di Fe tessutale ed accelerata eritropoiesi aumentano di alcune volte l assorbimento Lo stimolo eritropoietico ha più potenza nell aumentare l assorbimento di Fe rispetto al deficit tessutale 18

19 Eritropoiesi e bilancio del Ferro In gravidanza una parte del Fe totale è destinata al feto in sviluppo Nel deficit di Fe i precursori eritroidi hanno priorità a spese degli altri tessuti Nel sovraccarico l eritropoiesi procede normalmente, ma il Fe in eccesso si deposita nei tessuti (fegato, cuore, pancreas, ecc.) in quanto la capacità di aumentare l eliminazione di Fe è molto limitata Distribuzione corporea del Ferro Fe totale 3-5 g 65-75% in Hb 0,5-2,0 mg assorbiti/gg perdite/gg analoghe eritropoiesi rifornita da SRE per riciclo 0,1% in transito riserve epatocitarie 1 g distribuzione alterata in gravidanza, deficit e sovraccarico Nature Rew Genetics 2000;1:208 19

20 Assorbimento di Fe - Molecole DMT1 Dcytb Ferroportina (IREG1) Efestina HFE+ 2 -microglobulina TfR1 TfR2 Trasportatore di mucosa Fe-reduttasi (Fe 3+ Fe 2+ ) Trasportatore basolaterale Fe-ossidasi (Fe 2+ Fe 3+ ) modula uptake/rilascio di Fe plasmatico nelle cripte duodenali Recettore 1 per Tf Recettore 2 per Tf (+) Assorbimento del Fe-Epcidina Piccolo peptide circolante di sintesi epatica recentemente scoperto che regola l assorbimento intestinale di Fe (store regulator) Quando sideremia aumenta troppo (1), epcidina è rilasciata (2) e riduce assorbimento tramite ritenzione di Fe nei macrofagi e differenziazione di enterociti a ridotta espressione di proteine di trasporto (3) Quando sideremia diminuisce troppo l espressione di epcidina è ridotta per favorire l assorbimento di Fe 20

21 Epcidina, EPO ed omeostasi del Fe JCI 2002;110:1037 Trasporto del Fe-Transferrina TF lega Fe +++, lo rende solubile, ne attenua la reattività, lo rilascia alle cellule TF rilascia Fe alle cellule dopo legame con TFR In circolo vi sono 4 forme di TF: ApoTF Tf monoferrica (unico Fe +++ legato a C-t) Tf monoferrica (unico Fe +++ legato a N-t) OloTf (2 Fe +++ ) 21

22 Trasporto del Fe-Transferrina HOLO-Tf si lega a TFR Endocitosi del complesso Azione di pompa a protoni su endosoma e rilascio di Fe DMT1 cattura e trasporta Fe ++ fuori dall endosoma Fe viene utilizzato o depositato (cellule non eritropoietiche) APO-TF e TFR vanno sulla membrana e si dissociano a ph neutro - il ciclo riprende Nature Rew Genetics 2000;1:208 Destino del Fe in differenti cellule Nature Rew Genetics 2000;1:208 22

23 Geni del metabolismo del Fe esiti di possibili mutazioni Ceruloplasmina DMT1 Epcidina Ferroportina Frataxina (triplicazione genica) HFE Efestina Transferrina stfr2 Fe in SNC, fegato; diabete; anemia grave anemia, ridotto assorbimento emocromatosi grave anemia, sovraccarico di Fe atassia, mocardiopatia emocromatosi ridotto assorbimento grave anemia; sovraccarico di Fe in parenchimi aumento assorbimento; sovraccarico di Fe Regolazione del Ferro L espressione dei sistemi di captazione è sovraregolata nel deficit e sottoregolata nel carico di Fe FER IRP LIP Tf TfR DCT1 (NRAMP2) L espressione delle molecole di ferritina è sovraregolata nel carico e sottoregolata nel deficit di Fe Le cellule regolano il loro contenuto in Fe controllando l espressione dei sistemi di captazione e delle proteine di deposito di Fe LIP = Labile Iron Pool 23

24 Regolazione del Ferro Le proteine che consentono l'auto-regolazione del Fe intracellulare sono le IRP-1 e IRP-2 (Iron Regulatory Proteins). Sono proteine citoplasmatiche che si legano a RNA e funzionano in modo trans sul mrna che contiene gli IRE (Elementi Responsivi al Fe) strutture ad azione cis. Gli IRE, siti di legame per IRP sono strutture a forma di forcina a 28 nucleotidi. Sono presenti nelle regioni non traslate che codificano per TfR, Ferritina, ALA sintasi ed altre stutture correlate. IRP IRP 3 5 coding UTR An IRP X UTR coding An IRP-1 Variazioni nel Fe intracellulare alterano la conformazione di IRP1 da forma enzimatica attiva (aconitasi) a bassa affinità per RNA, a forma senza attività aconitasi ma ad alta affinità per RNA. Tali conversioni consentono a IRP1 di monitorare le variazioni nella disponibilità di Fe intracellulare. Se aumenta Fe, aumenta la forma IRP1 a bassa affinità per RNA e diminuisce il legame di IRP1 a IRE. Se Fe diminuisce, IRP1 aumenta la sua affinità per RNA e si lega maggiormente a IRE. 24

25 Differenze fra IRP-1 & IRP-2 IRP-2 non ha attività aconitasi IRP-2 si lega a IRE come IRP-1 e funziona come repressore traslazionale Una diminuzione di Fe intracellulare aumenta il legame a mrna di entrambi gli IRP (1 & 2) ma in modi differenti: Il controllo di IRP1 è soprattutto post-traslazionale con switch da forma non legante (aconitasi) a forma legante (no-aconitasi) che avviene con piccole variazioni della quantità di proteina IRP-1 Invece l'aumento di legame di IRP-2 è il risultato di sintesi de-novo Le conseguenze delle differenti distribuzioni tessutali di IRP (1 & 2) non sono ancora note, ma le due proteine sembrano avere identico comportamento quali sensori di Fe intracellulare Regolazione del Ferro L espressione dei sistemi di captazione è sovraregolata nel deficit e sottoregolata nel carico di Fe FER IRP LIP Tf TfR DCT1 (NRAMP2) FT L espressione delle molecole di ferritina è sovraregolata nel carico e sottoregolata nel deficit di Fe Le IRP (1 e 2) sentono i livelli di Fe(II) nel LIP e controllano per traslazione l espressione dei geni che trasportano gli IRE, cioè: TfR, DCT1, Ferritina (FT), FER (Fe Reduttasi) e ALA sintasi 25

26 Controllo traslazionale coordinato di captazione di Fe e sintesi di Ferritina Ferritina IRP X 5 coding An Tf R, DCT1, FePortina IRP Basso Fe IRP 5 coding An TfR, FeP IRP IRP DCT1 FRasi IRP 5 s43 s40 coding An s60 5 coding Alto Fe IRP LIP IRP FT X RNAasi A basso Fe intracellulare la traslazione di mrna per Ferritina è bloccata da IRP su IRE, quella per TFr, DCT1, FEP è favorita dal binding di IRP ad alta affinità. Ciò rende stabile mrna traslato A Fe alto la traslazione di mrna per Ferritina è possibile, quella per TFr, DCT1, FEP è rallentata dal mancato binding di IRP a bassa affinità con IRE. Ciò rende instabile mrna traslato (RNAasi) Binding di IRP-1 e -2 proteine regolatrici di Fe 26

27 Recettore per la transferrina - TFr YTRF TFr è un omodimero transmembrana connesso da legami S-S. Segnale di internalizzazione Recettore di Transferrina TFr Un gruppo acile attaccato al termine citoplasmatico della molecola ancora il tutto alla membrana plasmatica TFr è la sola via fisiologica di ingresso cellulare di Fe TFr sono presenti su tutte le cellule nucleate in funzione delle esigenze La scorta di Fe cellulare è determinata dal numero dei TFr; più alto in midollo, fegato, placenta Recettore solubile per la transferrina - stfr Monomero troncato del recettore cellulare Circola complessato con TF Il maggior rilascio di stfr plasmatico avviene ad opera degli eritroblasti, in secondo luogo dai reticolociti I livelli di stfr sono determinati dall'attività eritropoietica midollare che può causare variazioni da meno otto volte a più venti volte i valori normali 27

28 Deposito di Ferro - Ferritina HRI - Heme Regulated Inhibitor Inibisce, tramite fosforilazione di eif2 (fattore di iniziazione), la sintesi di Hb nei reticolociti L inibizione feed-back si osserva quando la concentrazione intracellulare di eme declina NO influenza l azione di HRI Il meccanismo previene la sintesi di catene globiniche in eccesso rispetto all eme (meglio anemia microcitica che emolitica) Controlla la traslazione di Hb dopo la perdita del nucleo (25% del totale) Agisce come sensore ed effettore a protezione degli stress 28

29 HRI - Heme Regulated Inhibitor A. Regolazione della sintesi di e globine ad opera di HRI ed eme B. Risposta alterata dell eritropoiesi nel deficit di Fe in HRI -/- Stress EMBO J 2001;20:6909 Gene della -globina - attivazione della trascrizione Cluster di alcuni geni -like su cromosoma 11 Livello di espressione dipendente da regione di controllo del locus (LCR) LCR consiste di 5 siti ipersensibili alla DNAasi (HSs) estesi su kb e kb a monte dei geni HSs appaiono dapprima nelle CFU-E in conseguenza del binding di fattori specifici ed ubiquitari di trascrizione (motivi CACC, E box, GATA-1, MARE) 29

30 Gene della -globina - attivazione della trascrizione Nature Genetics 2003;35:190 Clusters dei geni per le globine 30

31 Metabolismo dell eme -aminolevulinato sintetasi 2 (ALAS2) è rate limiting sulla via metabolica. ALAS2 è l isoenzima eritroide La mutazione del gene per ALAS2 (Xp11.21) causa anemia sideroblastica X- linked La mutazione è spesso associata ad allele mutante per il gene HFE Catabolismo dell eme 31

32 Conclusioni La tradizionale visione morfologica è stata integrata/sostituita dai risultati delle indagini genetiche e di biologia molecolare I vari meccanismi molecolari, attivi a partire da BFU-E, operano secondo un programma finemente sintonizzato cui contribuiscono espressione di geni ed azione di regolatori L intervento coordinato di geni e regolatori è sensibile a sottili variazioni che avvengono nell ambiente esterno e si adegua ad esse tramite meccanismi epigenetici 32