Un estratto proteico può contenere acidi nucleici, nucleotidi Posso verificare la loro presenza mediante la misura di uno spettro di assorbimento. Gli acidi nucleici e i nucleotidi assorbono nell UV, grazie alla presenza di basi azotate (sistemi con doppi legami coniugati): il picco di massimo assorbimento per il DNA/RNA è 260 nm Tra 250-270 nm Nucleotidi mono-fosfato A 260 nm ------- > 1.6 soluzioni contaminate da DNA A 280 nm Gli acidi nucleici possono essere allontanati mediante precipitazione (protamina solfato) o mediante Dnasi e RNasi
Picco a λ 260 nm NAD+ NADH Contiene nella struttura una porzione nucleotidica (NAD = nicotinamide adenina dinucleotide) In base allo spettro di assorbimento possiamo distinguere le forme OSSIDATA E RIDOTTA del NAD La [NADH], che ricavo dalla misura dell A 340, è proporzionale alla [piruvato]. Posso misurare la variazione di [piruvato] nel tempo, la v 0 in funzione della concentrazione di substrato [lattato] e quindi misurare i parametri cinetici della lattato deidrogenasi. Posso sfruttare le diverse proprietà di assorbimento delle due forme ossidata e ridotta per seguire la cinetica di enzimi, DEIDROGENASI, che catalizzano reazioni di ossidoriduzione NAD(P)- dipendenti Reazione catalizzata dalla LATTATO DEIDROGENASI
2. Misurazione dell assorbanza a lunghezza d onda prefissata a) Conosco il coefficiente di estinzione molare dell analita Ho una soluzione di una proteina purificata Preparo un bianco con lo stesso tampone utilizzato per dissolvere la proteina Effettuo l azzeramento e una lettura del campione allo spettrofotometro alla lunghezza d onda di 280 nm (se la proteina contiene amminoacidi aromatici) a 214 nm (se la proteina non contiene amminoacidi aromatici). In ogni caso devo utilizzare la lunghezza d onda di riferimento del coefficiente di estinzione molare. ε 280 per il LISOZIMA = 38000 M -1 cm -1 Misuro un assorbanza = 0.2 0.2 Qual è la concentrazione? A = εlc c = A/εl c = 0.2/38000 M -1 cm -1 1 cm c = 0.000005 M = 5 um
2. Misurazione dell assorbanza a lunghezza d onda prefissata b) Non conosco il coefficiente di estinzione molare, oppure ho una miscela di proteine Non posso utilizzare la legge di Lambert-Beer. Effettuo un saggio colorimetrico: le proteine presenti nel campione sono fatte reagire con un reagente dando origine ad un prodotto colorato. L intensità del colore sviluppato si correla con la concentrazione di proteina. Viene preparata una retta standard di riferimento: si misura l assorbanza di varie soluzioni a concentrazione nota di BSA (albumina disiero bovina). Si misura l assorbanza della soluzione proteica a concentrazione incognita, in base alla retta di riferimento dall assorbanza si ricava la concentrazione.
Saggi colorimetrici per la determinazione della concentrazione proteica 1. Metodo del BIURETO 2. Metodo di LOWRY (FOLIN-CIOCALTEAU) 3. Metodo di BRADFORD 4. Metodo dell ACIDO BICINCONINICO METODO DI BRADFORD Si basa sull interazione fra le proteine e il colorante: COOMASSIE BRILLIANT BLUE G-250 Esiste in 3 forme: Cationica (rossa) Neutra (verde) Anionica (blu) Quando interagisce con una proteina (in ambiente acido) il coomassie BB G-250 si converte nella forma anionica (blu) che ha un massimo di assorbimento a 595 nm A ph acido, è prevalente la forma cationica (2 cariche +) è rosso e ha un massimo di assorbimento a 465 nm. Il complesso proteina/colorante è rivelato a 595 nm, la sua assorbanza è proporzionale alla concentrazione della proteina
Proteina Complesso Proteina/colorante Interazioni elettrostatiche con amminoacidi basici (arginina) e idrofobiche con i residui aromatici 595 nm Coomassie BB G-250 Coomassie BB G- 250 + proteine 1) Si preparano diverse soluzioni a concentrazioni scalari di BSA, nello stesso tampone in cui è contenuto il nostro campione. Range utilizzabile: da 1 a 10 μg/ml o da 50 a 1400 μg/ml per avere una linearità fra assorbanza e concentrazione. 2) Si prepara un bianco col campione per l azzeramento 3) Viene prelevato un certo volume del campione da utilizzare nel saggio 4) Si miscela il reattivo di Bradford con: il bianco, le soluzioni a titolo noto di albumina, il campione x. 5) Si incuba a T ambiente per 5 minuti e poi si effettuano le letture allo spettrofotometro a 595 nm.
I valori di A 595 nm delle soluzioni a conc. nota e della soluzione a conc. incognita vanno corretti con il valore di assorbanza del bianco. Su un grafico si riportano i valori di assorbanza delle soluzioni di albumina in funzione della loro concentrazione e si ottiene una retta. Si riporta, quindi il valore dell assorbanza della soluzione a concentrazione x e si individua graficamente il valore della concentrazione corrispondente.
La concentrazione del nostro campione (proteina o miscela di proteine) è determinabile se ricade nel range di linearità del saggio. Se la sua concentrazione è superiore, un piccolo volume andrà diluito e poi nuovamente testato (bisognerà considerare il fattore di diluizione) 595 nm
L assorbanza per una soluzione contenente una miscela di NAD + e NADH è stata misurata a 340 nm e a 260 nm A 340 = 0.207 e A 260 = 0.9 Conoscendo i coefficienti di estinzione: mm 340 NADH= 6.2 mm -1 cm -1 mm 260 NADH= 18 mm -1 cm -1 mm 260 NAD + = 18 mm -1 cm -1 Calcolare le concentrazioni millimolari della forma ossidata e ridotta A 340 0.207 [NADH] = ----------= --------------------------- = 0.0333mM 340 l 6.2mM -1 cm -1 x 1cm A 260 0.9 [NAD + ] +[NADH]= -------- = ------------------------ = 0.05mM 260 x l 18mM -1 cm-1 x 1cm [NAD + ] = 0.05 mm 0.0333 mm = 0.0167 mm