SET RPLA Test semiquantitativo utilizzato per la ricerca delle enterotossine stafilococciche A,B,C,D mediante agglutinazione passiva inversa al lattice Si utilizzano degli antisieri ricavati per immunizzazione di conigli con enterotossine stafilococciche purificate A,B,C,D. Le relative immunoglobuline vengono purificate per affinità cromatografica e con queste sensibilizzate le particelle di lattice. Queste ultime agglutinano in presenza delle corrispondenti enterotossine SET RPLA SET RPLA : test di agglutinazione passiva inversa ( sensibilità del metodo : 0.5 1.0 ng/ml )
SET RPLA Test semiquantitativo utilizzato per la ricerca delle enterotossine stafilococciche A,B,C,D mediante agglutinazione passiva inversa al lattice 10 g di campione + 10 ml di Soluzione fisiologica omogeneizzazione Protocollo di estrazione Centrifugare a 900g per 30 a 4 C Filtrare il surnatante su membrana (0,2 0,45μm) a bassa capacità di legare le proteine Usare il filtrato come campione SET RPLA : test di agglutinazione passiva inversa ( sensibilità del metodo : 0.5 1.0 ng/ml )
VIDAS Staph enterotoxin II Test qualitativo automatizzato sul sistema Vidas per la rilevazione delle enterotossine con la tecnica ELFA ( Enzyme Linked Fluorescent Assay ) PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE PER PRODOTTI LATTIERO-CASEARI CON CONCENTRAZIONE ACIDO TRICLOROACETICO DIALISI Questo protocollo è raccomandato per aumentare la concentrazione delle tossine nei prodotti lattiero-caseari e per sopprimere le rare interferenze riscontrate per certi formaggi a base di latte crudo Esempio : Roquefort
Concentrazione tramite Dialisi contro una soluzione di polietilen glicol (PEG) 25 g di campione + 40 ml di Acqua distillata a 38 C Omogeneizzazione e dispersione delle enterotossine nella fase acquosa Il campione subisce acidificazione e alcalinizzazione per eliminare le interferenze che potrebbero dare dei falsi positivi Il surnatante finale è sottoposto a dialisi per una notte per permettere la concentrazione delle enterotossine eventualmente presenti L analisi viene eseguita sul dializzato, tramite VIDAS SET2 : test immunoenzimatico
Concentrazione tramite Dialisi contro una soluzione di polietilen glicol (PEG) Vidas Staph. Enterotoxin è un test immunoenzimatico Sulla superficie interna del cono sono fissati anticorpi monoclonali di topo e ratto; gli antigeni presenti nel campione si legano agli anticorpi monoclonali fissati sulle pareti interne del cono
Criterio di sicurezza: enterotossine stafilococciche 15,0% Formaggi di malga: % campioni positivi per enterotossine stafilococciche (isolamento da alimento) 14,7% 10,0% 5,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 4,8% 0,0% 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2006: introduzione di un nuovo metodo di ricerca delle enterotossine stafilococciche direttamente dall alimento.
Campioni di formaggio analizzati Criteri d igiened Criterio microbiologico 2002 2003 2004 2005 2006 Stafilococchi coag + 2007 (fino 30.11) 57 57 99 119 181 209 Non conformi DPR 54/97 (10 4 ufc/g ) 44 26 25 54 Non conformi Reg. 2073/05 (10 5 ufc/g ) 26 30 E.coli 57 57 99 120 145 146 Non conformi DPR 54/97 (10 5 ufc/g) 8 13 22 29 16 29 limite non previsto dal Reg.. 2073/05
Microrganismi indicatori di igiene del processo Stafilococchi coagulasi positivi Formaggi di malga: % campioni non conformi per stafilococchi coagulasi positivi 90,00% 80,00% 77,42% 85.63% 85.64% 11,60% 15,31% 70,00% 60,00% 50,00% 45,16% 54,62% 40,00% 30,00% 25,23% 74,03% 70,33% 20,00% 10,00% 0,00% 2002 2003 2004 2005 2006 2007 DPR 54/97 M= 10 4 ufc/g Reg. 2073/05 M= 10 5 ufc/g
Microrganismi indicatori di igiene del processo E.coli Formaggi di malga: % campioni non conformi per E.coli 40% 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% 13,33% 23,26% 22,11% 36,96% 17,57% 28,92% 2002 2003 2004 2005 2006 2007 DPR 54/97 M= 10 5 ufc/g Reg. 2073/05 prevede la ricerca di E.coli nei formaggi prodotti con latte sottoposto a trattamento termico
Microrganismi indicatori di igiene del processo Stafilococchi coagulasi positivi ( Friuli ) FORMAGGI A BASE DI LATTE CRUDO E TERMIZZATO: RICERCA STAFILOCOCCHI CUT10 5 ufc/g- OFF % campioni positivi 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 2006 2007 14.29 14.29 14.29 2006: 50,00% 2007: 87.51% 50.00 42.86 50.00 <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 >10^5 2006: 50,00% 2007: 14.29% 14.29 CLASSI DI VALORI (ufc/g)
Aspetti microbiologici nei prodotti a base di latte degli alpeggi Burro di malga
Le normative a confronto D.P.R. n 54 / 97 (linee direttrici) (linee direttrici) - Reg.CE 2073/05.CE 2073/05(criterio (criterio di igiene di processo) Microrganismo Prodotti Valori Coliformi D.P.R. 54/97 E. coli Reg.. CE 2073/05 Burro Burro e panna a base di latte crudo o di latte sottoposto a trattamento termico a temperatura inferiore a quella della pastorizzazione m=0 M= 10 ufc/g n=5, c=2 m=10 ufc/g M=100 ufc/g n=5, c=2
La produzione del burro La produzione di burro con le panna di affioramento che non siano state preventivamente risanate termicamente non consente di ottenere un prodotto con i parametri microbiologici previsti dalla normativa ( coliformi 10ufc/g E.coli 100ufc/g ) Il burro è perciò un prodotto estremamente delicato igienicamente per la cui produzione è fatto obbligo di pastorizzare le panne a temperature superiori a 90 C per garantire il necessario risanamento microbico. La sua produzione in alpeggio è possibile solamente se si dispone di un impianto che consenta di praticare tale pastorizzazione
Campioni di burro analizzati criteri di sicurezza Criterio microbiologico 2002 2003 2004 2005 2006 2007 (fino 30.11) Salmonella spp presente/assente in 25 g L. Monocytogenes presente/assente in 25 g * Campylobacter termofili presente/assente in 25 g Enterotossine stafilococciche presente/assente 32 28 18 14 22 8 assente assente assente assente assente assente 32 28 18 14 36 24 assente assente assente assente assente 1 positivo --- --- --- 5 23 17 assente assente assente assente assente assente --- --- --- 2 5 18 --- --- --- assente assente assente * Indagine non obbligatoria 1 campione di burro riscontrato positivo per L.monocytogenes con una carica di 10 ufc/g
Campioni prelevati nella malghe del Friuli anni 2006-2007 2007 ANN O 2006 MATRICE LISTERIA MONOCYTOGENES ESITO E I N P BURRO 17 17 FORMAGGI 13 13 LATTE ACIDIFICATO YOGURT 1 1 LATTE CRUDO 1 51 52 LATTE DERIVATI 2 2 LATTE DERIVATI PANNA 11 11 LATTE DERIVATI RICOTTA 26 26 2006 Totale 1 121 122 2007 Totale complessivo BURRO 1 15 1 17 FORMAGGI 1 7 1 9 LATTE CRUDO AZIENDALE 1 1 LATTE DERIVATI 1 1 LATTE DERIVATI RICOTTA 20 1 21 MATERIA PRIMA ANIMALE -SIERO DI LATTE 1 1 TAMPONE AMBIENTALE ATTREZZATURA 9 9 2007 Totale 2 54 3 59 Totale complessivo 2 1 175 3 181
Campioni di burro analizzati criteri d igiened Criterio microbiologico 2002 2003 2004 2005 2006 Stafilococchi coag + 2007 (fino 30.11) 32 28 18 25 44 26 non conformi DPR 54/97 (10 4 ufc/g) E.coli non conformi Reg 2073/05 (10 2 ufc/g) 16 16 8 10 11 13 21 --- --- --- --- 9 --- --- --- --- 5 11
Campioni di burro analizzati criteri d igiene Criterio microbiologico 2002 2003 2004 2005 2006 2007 (fino 30.11) Stafilococchi coag + 32 28 18 25 44 26 non conformi DPR 54/97 (10 4 ufc/g) E.coli non conformi Reg 2073/05 (10 2 ufc/g) 16 16 8 10 11 13 32 28 18 25 21 9 --- --- --- 19 5 11
Burro: microrganismi indicatori di igiene del processo Burro: Stafilococchi coagulasi positivi 35,00 30,00 2002: 48,15% 2003: 42,11% 2004: 56,25% CUT-OFF 2002: 51,85% 2003: 57,89% 2004: 43,75% % campioni positivi 25,00 20,00 15,00 10,00 5,00 0,00 <=10^2 >10^2 & <=10^3>10^3 & <=10^4>10^4 & <=10^5 >10^5 2002 2003 2004 CLASSI DI VALORI (ufc/g)
Burro : Microrganismi indicatori di igiene del processo Burro : Stafilococchi coagulasi positivi 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% Burro: % campioni per livello di contaminazione da Stafilococchi coagulasi positivi 2005: 60.0% 2006:82.9% 2007:50.0% 10 4 ufc/g 2005: 40.0% 2006:17.7% 2007:50.0% 0,0% <10 >10 >=100 >100 >=1000 >1000 >=10000 >10000 >=100000 2005 2006 2007 >10000000
Microrganismi indicatori di igiene del processo Stafilococchi coagulasi positivi ( Friuli ) BURRO: RICERCA STAFILOCOCCHI 10 5 ufc/g 100.00 90.00 2006: 88,46% 2007: 82,5% 2006: 11,57% 2007: 17,50% % campioni positivi 80.00 70.0 0 60.00 50.0 0 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 11.54 0.00 15.38 10.00 34.62 25.00 26.92 47.50 11.54 17.50 <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 >10^5 2006 2007 CLASSI DI VALORI (ufc/g)
Burro : germi indicatori coliformi 40,00 % campioni positivi 30,00 20,00 10,00 10 ufc/g 0,00 <=10^2 >10^2 & >=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 >10^5 & <=10^6 >10^6 2002 2003 2004 CLASSI DI VALORI (ufc/g)
Burro : Microrganismi indicatori di igiene del processo Burro : E.coli Burro: % campioni per livello di contaminazione da E.coli 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% 2006:47.6% 2007:44.4% 10 2 ufc/g <10 >10 >=100 >100 >=1000 >1000 >=10000 2006 2007 2006:52.4% 2007:55.6% 10 >10 e 10 2 >10 2 e 10 3 >10 3 e 10 4 ufc/ml
Microrganismi indicatori di igiene del processo E.coli 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% Burro: % campioni per livello di contaminazione da E.coli 2005: 24.0% 2006:47.6% 2007:44.4% 10 2 ufc/g <10 >10 >=100 >100 >=1000 >1000 >=10000 2005 2006 2007 2005: 76.0% 2006:52.4% 2007:55.6%
Criterio di sicurezza: enterotossine stafilococciche Burro: % campioni positivi per enterotossine stafilococciche 100,00% 80,00% 60,00% 40,00% 20,00% 0,00% 0,00% 0,00% 2006 2007 2006: introduzione di un nuovo metodo di ricerca delle enterotossine stafilococciche direttamente dall alimento alimento.
Aspetti microbiologici nei prodotti a base di latte degli alpeggi Ricotta di malga
Prodotti lattiero caseari di malga : la Ricotta La ricotta è un prodotto a base di latte ottenuta dalla lavorazione del siero e quindi non può essere definita un formaggio.si deve considerare genericamente un latticino Non contiene i batteri lattici vivi presenti nel latte che contrastano la contaminazione di microrganismi patogeni e inoltre non va incontro ad un processo di acidificazione come avviene nel formaggio, perciò è un prodotto molto delicato da un punto di vista igienico- sanitario.
Prodotti lattiero caseari di malga : la Ricotta Riscaldamento del siero 60 70 C Aggiunta di ingredienti (panna, latte) Acidificazione Riscaldamento a 90 C Coagulazione delle sieroproteine Raccolta della ricotta in stampi Drenaggio Raffreddamento Affumicatura ( eventuale )
Campioni di ricotta analizzati Criterio microbiologico 2005 2006 2007 (fino 30.11) Salmonella spp. 2 4 1 presente/assente in 25 g assente assente assente L. Monocytogenes 2 29 21 presente/assente in 25 g assente assente 1 positivo Stafilococchi coag + 5 30 21 E.coli 2 3 1 1 campione di ricotta riscontrato positivo per L.monocytogenes con una carica batterica <10 ufc/g
Campioni prelevati nella malghe del Friuli anni 2006-2007 2007 ANN O 2006 MATRICE LISTERIA MONOCYTOGENES ESITO E I N P BURRO 17 17 FORMAGGI 13 13 LATTE ACIDIFICATO YOGURT 1 1 LATTE CRUDO 1 51 52 LATTE DERIVATI 2 2 LATTE DERIVATI PANNA 11 11 LATTE DERIVATI RICOTTA 26 26 2006 Totale 1 121 122 2007 Totale complessivo BURRO 1 15 1 17 FORMAGGI 1 7 1 9 LATTE CRUDO AZIENDALE 1 1 LATTE DERIVATI 1 1 LATTE DERIVATI RICOTTA 20 1 21 MATERIA PRIMA ANIMALE -SIERO DI LATTE 1 1 TAMPONE AMBIENTALE ATTREZZATURA 9 9 2007 Totale 2 54 3 59 Totale complessivo 2 1 175 3 181
Microrganismi indicatori di igiene del processo Stafilococchi coagulasi positivi Ricotta : % campioni per livello di contaminazione da Stafilococchi coagulasi positivi 90,0% 80,0% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 10,0% 0,0% <10 >10 >=100 >100 >=1000 >1000 >=10000 2005 2006 2007
Microrganismi indicatori di igiene del processo Stafilococchi coagulasi positivi ( Friuli ) RICOTTA: ANALISI STAFILOCOCCHI % campioni positivi 100.00 90.00 80.00 70.00 60.00 50.00 40.00 30.00 20.00 10.00 0.00 2006 2007 42.86 28.57 28.57 14.2 9 14.2 9 14.2 9 14.2 9 0.00 <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 CLASSI DI VALORI (UFC/g)
RICOTTA : piano malghe 2000-2004 CARICA MESOFILA TOTALE 59,26 60,00 % campioni positivi 50,00 40,00 30,00 20,00 11,11 29,63 10,00 0,00 <=10^7 >10^7 & <=10^8 >10^8 CLASSI DI VALORI (UFC/g)
RICOTTA : piano malghe 2000-2004 50,00 COLIFORMI TOTALI 45,16 % campioni positivi 40,00 30,00 20,00 9,68 9,68 9,68 22,58 10,00 3,23 0,00 <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 >10^5 & <=10^6 >10^6 CLASSI DI VALORI (UFC/g)
RICOTTA : piano malghe 2000-2004 30,00 28,13 25,00 ESCHERICHIA COLI % campioni positivi 20,00 10,00 6,25 18,75 18,75 3,13 0,00 <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 & <=10^4 >10^4 & <=10^5 >10^5 & <=10^6 >10^6 CLASSI DI VALORI (UFC/g)
RICOTTA : piano malghe 2000-2004 40,00 31,25 37,5 STAFILOCOCCHI COAG + 31,25 % campioni positivi 30,00 20,00 10,00 0,00 <=10^2 >10^2 & <=10^3 >10^3 CLASSI DI VALORI (UFC/g)
Biotipizzazione dello Stafilococco aureo coagulasi + mediante prove biochimiche Prove per la biotipizzazione Produzione di stafilochinasi Produzione di emolisina Capacità di coagulare il plasma bovino in 6 h Crescita e aspetto su agar Cristal Violetto Test per la proteina A
Tabella di lettura dei Biotipi di S. aureus Biotipo K βh BC CV pa UMANI + + - A/C BOVINO - + + A OVINO - + + C AVIARE - - - A - POULTY LIKE - - - A + NHS - + - C NHS - + - A NHS - - - C K= Stafilochinasi CV= tipo di crescita su agar violetto H= beta emolisi PA= proteina A BC= Coagulazione plasma bovino NHS= non ospite specifico
Biotipizzazione ceppi di Stafilococco coag.+ ( Friuli ) Matrice Positivi Umani Animale Latte crudo 9 5 3 Burro 4 3 1 Ricotta 2 2 0 TOTALI 15 10 3
Biotipizzazione ceppi di Stafilococco coag.+ ( Trentino ) Matrice Positivi Umani Animale NHS Latte crudo 42 10 9 23 Formaggi 25 1 16 8 Burro 16 2 7 7 TOTALI 83 13 32 38
Biotipizzazione ceppi di Stafilococco coag.+ ( Ricerca corrente ) Matrice Positivi Umani Animale NHS Formaggi 58 36 3 19 Ricotta 3 1 / 1 Burro 2 1 / 1 TOTALI 63 38 3 21
In conclusione : Proposta per il miglioramento igienico-sanitario dei prodotti lattiero-caseari di malga Controllo dello stato sanitario della mammella degli animali destinati alla monticazione Verifica analitica della presenza di stafilococchi coag.+ nel latte Miglioramento delle condizioni igieniche di mungitura Lavaggio e disinfezione sistematica delle attrezzature Educazione igienico-sanitaria permanente al personale ( malghesi ) sulle B.P.L. nella filiera produttiva della produzione in malga antagonismo batterico con flora lattica?
Grazie per l attenzione