SAPIENZA UNIVERSITA DI ROMA DOTTORATO DI RICERCA IN MEDICINA SPERIMENTALE XXVI CICLO

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1 SAPIENZA UNIVERSITA DI ROMA DOTTORATO DI RICERCA IN MEDICINA SPERIMENTALE XXVI CICLO Studio del ruolo dei polimorfismi a singolo nucleotide rs e rs dell IL28B in una coorte di pazienti italiani con infezione cronica da virus dell epatite C sottoposti a terapia interferonica DOTTORANDO Katia Monteleone DOCENTE GUIDA Prof. Guido Antonelli COORDINATORE DEL DOTTORATO Prof.ssa Maria Rosaria Torrisi ANNO ACCADEMICO 2012/2013

2 INTRODUZIONE... 4 Infezione da Virus dell epatite C... 5 Virus dell epatite C... 6 Classificazione e variabilità genetica... 6 Struttura del virione e organizzazione genomica... 7 Struttura e funzione delle proteine virali... 9 Ciclo di replicazione Epidemiologia e modalità di trasmissione Storia naturale dell infezione e meccanismi patogenetici Diagnosi di laboratorio Terapia Monitoraggio e valutazione della risposta alla terapia Fattori dell ospite e del virus associati alla non risposta alla terapia antivirale Interferon Interferone lambda Polimorfismi genetici dell IL28B Effetti dei polimorfismi dell IL28B SCOPO DELLA TESI MATERIALI E METODI Caratteristiche clinico-demografiche dei pazienti Estrazione del DNA Reazione a catena della polimerasi (PCR) per la determinazione degli SNP dell IL28B Analisi del prodotto di PCR degli SNP dell IL28B Metodo del pirosequenziamento Pirosequenziamento degli SNP dell IL28B Estrazione di RNA da PBMC Sintesi di cdna

3 Real-Time PCR Analisi statistica RISULTATI Pazienti Frequenza dello SNP rs dell IL28B Frequenza dello SNP rs dell IL28B Polimorfismi dell IL28B e risposta al trattamento con PEG-IFN e ribavirina SNP rs /rs dell IL28B e livelli di carica virale SNP rs /rs dell IL28B e grado di fibrosi epatica Valutazione dell espressione di geni IFN-indotti in funzione dei polimorfismi dell IL28B DISCUSSIONE BIBLIOGRAFIA

4 INTRODUZIONE 4

5 Infezione da Virus dell epatite C L infezione da Virus dell epatite C (HCV) costituisce un problema di sanità pubblica mondiale; ciò è dettato non soltanto dal fatto che l infezione è estremamente diffusa - si stima che le persone infette siano oltre 170 milioni - ma anche dal fatto che circa l 80% dei soggetti HCV-positivi manifesta una cronicizzazione dell infezione e nel 15-20% dei casi si osserva lo sviluppo di cirrosi e/o epatocarcinoma, dopo anni dall infezione. Per tale ragione l infezione cronica da HCV rappresenta la una delle principali cause di trapianto di fegato nei paesi industrializzati (Thomas, 2013). Il Virus dell epatite C fu identificato nel 1989 e riconosciuto come il principale agente eziologico dell epatite non-a non-b post-trasfusionale (Houghton, 2009). Questa scoperta ha portato rapidamente alla messa a punto di saggi sierologici e molecolari per lo screening delle trasfusioni ematiche. Tuttavia, l acquisizione di una conoscenza più approfondita del virus è stata rallentata dalla difficoltà incontrata per lungo tempo nel tentativo di mettere a punto modelli di studio in vitro efficaci e riproducibili e dalla scarsa disponibilità di modelli in vivo (Lohmann et al., 2013). La mancanza di informazioni dettagliate sul ciclo di replicazione virale ha sensibilmente contribuito a impedire lo sviluppo di farmaci antivirali diretti. Per decenni la terapia antivirale dell infezione cronica da HCV è stata basata sulla somministrazione di interferone (IFN), inizialmente in monoterapia e successivamente in combinazione con ribavirina. La messa a punto di modelli di replicazione in vitro avvenuta negli ultimi dieci anni ha quindi rappresentato una svolta fondamentale per la comprensione delle diverse tappe del ciclo di replicazione e ha rapidamente portato al disegno e all introduzione nella pratica clinica di agenti antivirali diretti (Scheel et al., 2013). Tuttavia, a causa dell enorme variabilità che caratterizza il virus, la somministrazione in monoterapia dei nuovi farmaci non è ancora possibile perché porterebbe rapidamente alla selezione di varianti virali farmaco-resistenti. Per questa ragione l IFN ha ancora un ruolo centrale nel trattamento dei pazienti con infezione cronica da HCV. Il principale limite della terapia interferonica è rappresentato dal fatto che una discreta percentuale di soggetti non risponde alla terapia o presenta una ripresa della malattia in seguito alla sospensione della terapia stessa (Asselah et al., 2010). I fattori del virus e/o dell ospite coinvolti nel meccanismo di resistenza al trattamento interferonico non sono ancora stati completamente compresi. Diventa così evidente l importanza dell identificazione di marcatori utili per predire le probabilità di risposta alla terapia e consentire una più accurata 5

6 selezione dei pazienti con infezione da HCV che trarranno realmente un beneficio dalla terapia stessa; lo scopo ultimo è, infatti, quello di avvicinarsi alla cosiddetta medicina personalizzata, un approccio che, attraverso test innovativi e una visione globale di ciascun individuo, crea percorsi terapeutici altamente personalizzati. Virus dell epatite C Classificazione e variabilità genetica Il virus dell epatite C è l agente eziologico dell epatite virale C. Appartiene alla famiglia Flaviviridae, i cui membri sono classificati in tre generi: Flavivirus, Pestivirus ed Hepacivirus. Sulla base di analisi di sequenza, HCV è classificato nel genere Hepacivirus, insieme al GB-virus B e ai virus recentemente identificati NPHV (non primate hepacivirus), RHV (rodent hepacivirus) e BHV (bat hepaciviruses) (Scheel et al., 2013). HCV è caratterizzato da un grado di variabilità estremamente elevato. Ciò è in parte dovuto al fatto che l infezione da HCV è un processo altamente dinamico: il virus possiede un emivita di poche ore e si stima che in un soggetto con infezione cronica si possano formare fino a nuovi virioni ogni giorno. A questo si aggiunge il fatto che l RNA polimerasi RNAdipendente virale non possiede un meccanismo di correzione delle bozze, cioè di attività esonucleasica 3-5, e non è quindi in grado di riparare gli errori di incorporazione nucleotidica durante la replicazione virale (Moradpour et al., 2007). La variabilità all interno del genoma di HCV non è uniformemente distribuita, ma segue una predisposizione determinata dalla maggior pressione immunologica da parte dell organismo ospite ed è strettamente associata alla funzione specifica della proteina che viene codificata. Se le mutazioni avvengono in regioni le cui funzioni sono determinanti per la replicazione del virus, si produrranno delle particelle virali difettive incapaci di dare infezioni produttive e, pertanto, destinate ad essere eliminate. Per tale motivo le sequenze più conservate nei vari isolati di HCV sono quelle delle regioni 5 UTR e 3 UTR non codificanti, della proteina core e di alcuni segmenti delle regioni NS3 (elicasi) e NS5B (polimerasi), essenziali per il ciclo replicativo del virus. Le regioni più variabili sono quelle coinvolte nella sintesi delle proteine dell involucro esterno, in particolare la regione aminoterminale della proteina E2, definita Hypervariable Region 1 o HVR1 (Sandres et al., 2000). 6

7 Conseguenza diretta di tali fenomeni è il fatto che HCV circola nel singolo individuo non come singola specie ma sotto forma di quasispecie, ovvero come popolazione eterogenea di virioni. L eterogeneità genetica di HCV conferisce al virus un vantaggio adattativo poichè la presenza simultanea di varianti genomiche multiple permette una rapida selezione di mutanti che si adattano meglio a cambiamenti ambientali (es. resistenza a farmaci o alla risposta immunitaria); proprio per questo l eterogeneità genetica del virus è alla base della cronicizzazione dell infezione, ed è probabilmente coinvolta nei fenomeni di evasione della risposta immunitaria, nella limitata efficacia della terapia ed nel mancato ottenimento di un vaccino efficace. Sulla base dell analisi di sequenza gli isolati di HCV possono essere classificati in 6 genotipi, indicati con i numeri arabi, i quali differiscono tra loro del 30-35%, e numerosi sottotipi, indicati con le lettere dell alfabeto, che differiscono del 20-25%. Struttura del virione e organizzazione genomica Il virione presenta una morfologia sferoidale con diametro di nm. È composto da un nucleocapside a simmetria icosaedrica, costituito dalla proteina core e dal genoma virale, e da un involucro pericapsidico, ovvero un doppio strato fosfolipidico di origine cellulare in cui sono inserite le glicoproteine virali E1 ed E2 (Fig.1). Fig.1 Struttura del virione. ( Il genoma di HCV è costituito da un singolo filamento di RNA a polarità positiva di 9.6 kb contenente un unico ORF (open reading frame) fiancheggiato da due regioni non codificanti (Fig. 2). L estremità 5 non codificante, nota come 5 UTR (untranslated region), è costituita 7

8 da una sequenza di circa 340 nucleotidi, altamente conservata nei diversi isolati clinici, organizzata in sei domini (I-VI) con struttura secondaria a stem-loop. Pur non essendo una regione codificante, il 5 UTR svolge un ruolo chiave nella regolazione del ciclo di replicazione virale poiché include una sequenza IRES (Internal Ribosome Entry Site) fondamentale per consentire la traduzione CAP-indipendente dell RNA virale; la sequenza IRES è costituita dai domini II, III e IV del 5 UTR e i primi nucleotidi della regione che codifica per la proteina core; la formazione di un complesso binario fra l IRES e la subunità 40S del ribosoma, infatti, induce un cambiamento conformazionale della subunità 40S stessa necessario per l assemblaggio del ribosoma 80S e il successivo inizio della traduzione (Spahn et al., 2001). La regione 5 UTR contiene anche due siti di legame per il microrna mir122, abbondantemente espresso nelle cellule epatiche; numerosi studi hanno ormai reso evidente come l interazione tra il mir122 e il genoma virale sia in grado di stimolare la replicazione virale (Fukuhara et al., 2013). L estremità 3 non codificante, nota come 3 UTR, è costituita da una corta sequenza di lunghezza variabile, una sequenza poly(u/uc) della lunghezza media di 80 nucleotidi e una regione altamente conservata di 98 nucleotidi, nota come X-tail, essenziale per la replicazione del genoma virale sia in vitro che in vivo. L ORF codifica per una poliproteina precursore di circa 3000 aminoacidi da cui originano, per scissione proteolitica, le proteine virali strutturali e non strutturali mature. Il processamento delle proteine strutturali C, E1 ed E2 e della proteina non strutturale p7, i cui geni sono localizzati all estremità 5 dell ORF, è catalizzato da enzimi cellulari, le peptidasi del segnale associate alle membrane del reticolo endoplasmatico (RE); tutte le altre proteine non strutturali, necessarie per la replicazione virale, sono invece processate esclusivamente dagli enzimi virali NS2/3 ed NS3/4A. 8

9 Fig.2 Struttura ed organizzazione del genoma del virus dell epatite C. In alto è rappresentato il genoma di 9.6 kb di RNA a singolo filamento positivo. La traduzione porta alla sintesi di una poliproteina in cui sono indicati i siti di taglio: i rombi indicano i siti riconosciuti dalle peptidasi del segnale, le frecce indicano i siti di scissione fra le proteine non strutturali. Nella parte più bassa della figura è rappresentato il prodotto dei tagli sulla poliproteina, i punti sulle proteine E1 ed E2 ne indicano la glicosilazione (Moradpour et al., 2007). Struttura e funzione delle proteine virali La prima proteina strutturale codificata dall ORF di HCV è la proteina core, che costituisce il nucleocapside. La presenza di una sequenza segnale localizzata tra i geni core ed E1 induce il trasporto della catena polipeptidica nascente verso il RE; un primo taglio proteolitico porta alla formazione di una proteina immatura di 191 amminoacidi e un taglio successivo al C- terminale porta alla formazione della proteina core matura: una proteina con struttura ad α- elica, costituita da amminoacidi e dal peso di 21 kda. Il dominio D1 situato all estremità N-terminale della proteina core è in grado di legarsi all RNA genomico grazie alla basicità conferitale dai residui di arginina e lisina che sono anche coinvolti nella oligomerizzazione necessaria per costituire il nucleocapside (Moradpour et al., 2007). E1 ed E2 sono proteine altamente glicosilate espresse sull involucro pericapsidico, dove si associano mediante interazioni non covalenti per costituire un complesso eterodimerico necessario per consentire l entrata del virus (Moradpour et al., 2007). 9

10 La proteina p7 è un piccolo peptide di 63 amminoacidi costituito da due domini transmembrana legati da un corto loop citoplasmatico; numerose evidenze sperimentali suggeriscono che la proteina p7 possa appartenere alla famiglia delle viriporine, proteine integrali di membrana in grado di formare canali ionici, e che possa avere un ruolo nelle fasi di maturazione e rilascio del virione (Tang et al., 2009). La proteina NS2 è una proteina di membrana di kda. L estremità C-terminale della proteina NS2 contiene un dominio proteasico che, insieme all estremità N-terminale della proteina NS3, costituisce la proteasi NS2/3 responsabile del taglio proteolitico a livello della giunzione NS2/NS3. Per tale motivo l enzima NS2/3 è anche noto come autoproteasi. La proteina NS3 è una proteina di 69 kda che possiede più domini funzionali; è dotata di un dominio responsabile dell attività proteasica localizzato all N-terminale e di un dominio responsabile di attività RNA-elicasica e NTPasica localizzato all estremità C-terminale. In particolare, l interazione non covalente tra NS3 e il cofattore NS4A porta alla formazione della serinoproteasi NS3/4A, responsabile del processamento del precursore poliproteico. Il dominio elicasico di NS3 può agire sia su RNA doppio filamento che su RNA a singolo filamento ricco di strutture secondarie; tale attività richiede l idrolisi di ATP. Si ritiene che, oltre a risolvere strutture secondarie nel genoma che potrebbero formarsi durante la replicazione, l elicasi potrebbe essere coinvolta anche nella fase di assemblaggio dei nuovi virioni (Ma et al., 2008). La proteina NS4B è una proteina di 27 kda non ancora completamente caratterizzata; si ritiene che induca la formazione del cosiddetto membranous web, un compartimento di membrana specializzato che funge da scaffold per il complesso di replicazione di HCV. La proteina NS5A è una fosfoproteina che può essere presente in uno stato fosforilato (56 kda) o iperfosforilato (58 kda); numerose evidenze sperimentali indicano che NS5A potrebbe essere coinvolta in interazioni proteina-proteina essenziali per la formazione del complesso di replicazione. L ultima proteina che viene scissa dal precursore poliproteico è la proteina NS5B, una proteina di 68 kda che rappresenta l RNA polimerasi-rna dipendente del virus. La polimerasi virale NS5B è priva di capacità di correzione di bozze e ciò, insieme all elevata attività di replicazione, è alla base della notevole variabilità genetica di HCV. 10

11 Ciclo di replicazione Il virus circola nel sangue di pazienti infetti sottoforma di 3 forme: virioni associati a LDL/VLDL (low density lipoproteins/very low density lipoproteins), virioni associati a immunoglobuline e virioni liberi (Moradpour et al., 2007). Le principali cellule bersaglio del virus sono rappresentate dagli epatociti seppure sia possibile anche l infezione di altri tipi cellulari quali ad esempio cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC). Il primo evento necessario perché si realizzi l infezione è il contatto tra virus e cellula; successivamente, un legame specifico tra le glicoproteine di superficie e i recettori cellulari consente l ingresso del virus mediante endocitosi mediata da recettore. Secondo il modello attualmente più accreditato l ingresso di HCV nell epatocita richiederebbe una prima debole interazione con glicosamminoglicani e/o LDLR (low density lipoproteins receptor) e, in una fase successiva, il legame specifico con un recettore ad alta affinità come CD81 ed SR-B1. Il complesso virus-recettore traslocherebbe quindi alle giunzioni strette, dove corecettori identificati nelle proteine delle tight junction Claudina ed Occludina1 indurrebbero l endocitosi mediata da recettore (Fig. 3). Fig. 3 Ingresso di HCV nell epatocita. HCV si attacca alla superficie cellulare mediante interazioni deboli con glicosamminoglicani (GAG) e/o LDLR; successivamente stabilisce un legame ad alta affinità con un recettore specifico come CD81 ed SR-B1; infine il cmplesso virus-recettore trasloca alle giunzioni strette, dove Claudina ed Occludina1 inducono l endocitosi mediata da recettore. (Adapted from Tang et al, 2009) Il recettore meglio caratterizzato è probabilmente la molecola CD81, una proteina transmembrana della famiglia delle tetraspanine, espressa in molti tipi cellulari, inclusi gli epatociti. È stato proposto che la molecola CD81 possa essere un recettore per l entrata di HCV nelle cellule a causa della sua capacità di interazione con la glicoproteina dell envelope 11

12 E2 (Pileri et al., 1998) ed ulteriori prove sono state fornite dal fatto che la diminuita espressione di CD81 ad opera di saggi di RNA interference riduce la permissività delle cellule all infezione e dal fatto che l espressione di CD81 su cellule epatiche umane non permissive consente l entrata di HCV (Zhang et al., 2004). Tuttavia, il legame di anticorpi anti-cd81 non inibisce del tutto l infezione e per questa ragione è stato proposto che l interazione E2-CD81 sia necessaria ma non sufficiente per consentire l ingresso del virus e che sia quindi richiesta la partecipazione di altre molecole (Evans et al., 2007). I recettori scavenger sono proteine di membrana che legano lipoproteine modificate chimicamente, acetilate ed LDL ossidate. Il recettore SR-B1 è altamente espresso negli epatociti ed è coinvolto nel trasporto bidirezionale del colesterolo legando sia lipoproteine ad alta densità (HDL) che lipoproteine a bassa densità (LDL). È stato dimostrato che la proteina E2 di HCV è in grado di legarsi a cellule di linee derivanti da epatoma in maniera indipendente dal recettore CD81, e SR-B1 è stato identificato come il mediatore di questo legame (Scarselli et al., 2002). Il recettore per le LDL è il recettore adibito al trasporto delle lipoproteine all interno delle cellule, in particolare lipoproteine LDL ricche in colesterolo, tramite un processo di endocitosi mediata da recettore di vescicole rivestite di clatrina. È stato suggerito che HCV possa usare questo recettore per infettare la cellula e si è scoperto che LDL libere nel siero possono influenzare il tasso di infezione degli epatociti competendo con il virus per il recettore (Enjoji et al., 2000). Dopo il legame ai recettori, HCV entra nella cellula mediante un processo di endocitosi mediata da recettore e transita in un comparto endosomico a basso ph (Blanchard et al., 2006). L abbassamento di ph all interno delle vescicole promuove un cambiamento conformazionale delle glicoproteine E1 e E2, con conseguente esposizione di una regione idrofobica di E2 che rappresenta il peptide di fusione; questo peptide, entrando nella membrana della vescicola endocitica, promuove la fusione delle membrane cellulare e virale e l uscita del nucleocapside nel citoplasma. In seguito alla scapsidazione, che è ancora una delle fasi meno comprese del ciclo replicativo di HCV, ha inizio la traduzione del genoma virale. L RNA (+) genomico (HCV RNA) si comporta come un mrna policistronico e viene direttamente tradotto in una poliproteina che viene processata da proteasi cellulari e virali, con conseguente produzione di proteine strutturali e non strutturali. Le fasi successive della replicazione avvengono in prossimità di particolari alterazioni di membrana, originate probabilmente dal reticolo endoplasmatico, note come membranous web, la cui formazione sembra essere indotta dalla proteina virale NS4B. 12

13 L enzima chiave della replicazione è l RNA-polimerasi-RNA dipendente virus-specifica, che avvia la sintesi di un filamento di RNA antigenomico (minus strand), utilizzando come stampo il genoma virale, e in un secondo tempo sintetizza sull intermedio replicativo un filamento di RNA genomico (plus strand). La successiva produzione delle nuove particelle virali viene attivata dall interazione dei monomeri di proteina core con i genomi neosintetizzati e porta alla formazione dei nucleocapsidi; ciò avviene in regioni del reticolo endoplasmatico in cui è presente un elevata concentrazione di goccioline lipidiche. Le particelle virali di nuova sintesi acquisiscono l involucro esterno dal reticolo endoplasmatico della cellula ospite, dove vengono inserite le glicoproteine E1 ed E2; il passaggio nell apparato di Golgi consente la maturazione finale della particella virale con la glicosilazione di E1 e E2. Il virione esce poi dalla cellula per esocitosi (Fig.4). Fig. 4 Schema riassuntivo del ciclo vitale di HCV nella cellula ospite. a) legame ed ingresso; b) scapsidazione; c) traduzione e processamento della poliproteina in corrispondenza del reticolo endoplasmatico; d) replicazione dell RNA; e) assemblaggio; f) maturazione e rilascio (Moradpour et al., 2007). 13

14 Epidemiologia e modalità di trasmissione L Organizzazione Mondiale della Sanità ha stimato che circa 170 milioni di persone siano infette da HCV, ovvero circa il 3% della popolazione mondiale. La prevalenza e l incidenza da HCV differiscono, comunque, significativamente nelle diverse aree geografiche; la differente circolazione del virus è sicuramente associata alle condizioni igienico-sanitarie e socio-demografiche, che possono modificare l efficienza delle vie di trasmissione. I paesi con prevalenza maggiore si trovano in Africa e Asia. Un caso emblematico è quello dell Egitto, che ha il più alto valore di prevalenza nel mondo (superiore al 20%) ed il genotipo più presente è il 4A; ciò è dovuto all enorme diffusione nella popolazione della Schistosomiasi, una malattia parassitaria la cui cura nel passato era associata alla somministrazione parenterale di antimonio con siringhe di vetro non adeguatamente sterilizzate. In Italia la prevalenza dell infezione correla fortemente con l età e mostra un gradiente geografico dal Nord al Sud Italia, raggiungendo picchi particolarmente elevati in soggetti di età avanzata nel Meridione (oltre il 30% in soggetti di età superiore ai 60 anni). Anche i genotipi virali sono diversamente distribuiti nelle varie aree geografiche; il genotipo 1a è il più diffuso nel Nord America, il genotipo 1b è il più diffuso in Europa, il tipo 2 in estremo Oriente (Giappone,Taiwan), il tipo 3 in Asia centrale (soprattutto in India), il 4 in Medio Oriente e in Africa centrale e settentrionale, il 5 in Africa Meridionale ed il 6 in Asia sudorientale (in particolare è prevalente nei donatori di sangue di Hong Kong) (Kuiken et al., 2005). Il virus dell epatite C viene trasmesso prevalentemente tramite esposizione a sangue infetto. In passato la principale modalità di trasmissione era rappresentata dalle trasfusioni di sangue e dagli emoderivati provenienti da donatori infetti; oggi grazie allo screening sierologico e molecolare dei marcatori di HCV nei donatori, tale rischio si è notevolmente ridotto nei Paesi industrializzati mentre rimane ancora un problema in Africa e in Asia. Altra modalità di trasmissione è rappresentata dall assunzione di droghe per via parenterale con scambio di siringhe infette. La trasmissione sessuale è rara e non quantificabile sul piano epidemiologico. In generale l associazione tra comportamenti sessuali a rischio e HCV è molto più debole di quella con virus dell immunodeficienza acquisita o virus dell epatite B. Un peso considerevole nella trasmissione di HCV è comunque rappresentato dalla via parenterale inapparente come le procedure mediche e chirurgiche invasive (trapianto da 14

15 donatori infetti, interventi odontoiatrici, apparecchiature sanitarie contaminate, procedure diagnostiche invasive), agopuntura, punture accidentali con aghi e strumenti taglienti contaminati, trattamenti estetici (soprattutto piercing e tatuaggi tra i giovani). Inoltre, l alta incidenza di infezioni croniche asintomatiche promuove la diffusione del virus nella popolazione. Storia naturale dell infezione e meccanismi patogenetici L infezione primaria da HCV è del tutto asintomatica nel 60-70% dei casi mentre nel 20-30% dei pazienti in cui risulta clinicamente evidente causa un quadro di epatite acuta sovrapponibile a quello ascrivibile agli altri virus epatotropi; in circa l 80% dei casi, l infezione diventa cronica ed è caratterizzata dalla persistenza del genoma virale nel sangue per almeno sei mesi dall insorgenza dell infezione acuta. In una quota variabile di soggetti portatori del virus, soprattutto in presenza di spiccata necroinfiammazione e/o di cofattori di danno epatico, la malattia potrà evolvere dalla condizione di epatite cronica verso la cirrosi epatica e l epatocarcinoma (Asselah et al., 2008) (Fig. 5). Fig. 5 Storia naturale dell infezione (Adapted from Asselah et al., 2008) In seguito all esposizione accidentale al virus, si verifica un periodo di incubazione la cui durata varia da 2 a 26 settimane (mediamente 7 settimane). I livelli di alaninoaminotrasferasi sierici (ALT), marker di necrosi epatocitaria, raggiungono valori 10 volte superiori alla 15

16 norma, mediamente dopo 2-8 settimane. L HCV RNA è invece evidenziabile precocemente nel siero del paziente, da 1 a 2 settimane dopo il contatto con il virus. L epatite acuta è itterica solo in una piccola parte dei casi (20%) e non itterica con pochi o nessun sintomo nella maggior parte delle infezioni (80%). I sintomi sono generalmente aspecifici: malessere, nausea, dolore al fegato e urine scure. Nell epatite acuta seguita da guarigione si osserverà la normalizzazione delle ALT e la scomparsa dell HCV RNA entro 2-3 mesi dall inizio della sintomatologia. Tuttavia, come detto precedentemente, HCV ha un elevata capacità di indurre infezioni persistenti; dopo l infezione acuta circa l 80-85% dei soggetti va incontro ad epatite cronica mentre solo il 15% dei soggetti guarisce. Diversi sono i fattori che possono modificare il decorso, la gravità e la progressione della malattia. Tra questi, i più noti sono l età al momento dell infezione, la via di infezione e la carica virale infettante, le coinfezioni con altri virus epatici o con HIV, le alterazioni dello stato immunitario, l etnia, la coesistenza di altre cause epatolesive come il consumo di alcool o di altre patologie quali accumulo di ferro, obesità, diabete di tipo 2, resistenza all insulina. L epatite cronica nel 20% dei casi progredisce fino ad arrivare alla cirrosi epatica, caratterizzata da una continua deposizione di tessuto connettivo, che altera la normale architettura dell organo determinandone una progressiva perdita di funzionalità che può portare a morte il paziente, e nell 1-4% dei casi si assiste allo sviluppo di epatocarcinoma. Ad oggi, l infezione persistente da HCV è la causa principale di malattia epatica e di trapianto di fegato nel mondo. La risposta immunitaria sostenuta dai linfociti B e T, citotossici ed helper, ha un ruolo fondamentale nel controllo dell infezione ed è coinvolta sia nella patogenesi del danno epatico sia nella clearence del virus. La risposta umorale, mediata da linfociti B, è principalmente coinvolta nella neutralizzazione ed eliminazione del virus extracellulare circolante, ed è quindi fondamentale per prevenire la diffusione del virus da una cellula infettata ad un altra. Al contrario, le risposte cellulo-mediate sono necessarie per l eliminazione degli epatociti infetti e, quindi, del virus intracellulare. I linfociti citotossici CD8 + sono in grado di eliminare le cellule bersaglio, a causa della loro attività litica, mediata dalla produzione di perforine, e apoptotica, associata a meccanismi caspasi-dipendenti e caspasi-indipendenti. I linfociti helper CD4 + attivano sia i linfociti T CD8 + sia i linfociti B, potenziando la risposta immunitaria. 16

17 Diagnosi di laboratorio Il primo approccio per lo screening e per la diagnosi di infezione da HCV è rappresentato dalla ricerca di anticorpi specifici nei confronti di antigeni dell HCV mediante saggi immunoenzimatici (ELISA). Il test per anticorpi (Ab) anti-hcv è in grado di evidenziare una positività da 5 a 8 settimane dopo l infezione primaria. La presenza di Ab anti-hcv può essere indicativa non solo di un infezione acuta in corso di risoluzione ma anche di un infezione cronica, in presenza o in assenza di attiva replicazione virale. Assume allora particolare significato la ricerca diretta del genoma virale (HCV RNA), mediante una reazione polimerasica a catena, preceduta da una reazione di retrotrascrizione (RT-PCR). È necessario confermare la positività per gli anticorpi anti-hcv mediante rilevazione dell HCV RNA nei soggetti a basso rischio d infezione, come i donatori di sangue, e nel neonato nato da madre con infezione da HCV, poiché, nel corso del primo anno di vita, la diagnosi di infezione materno-fetale può essere posta esclusivamente attraverso la ricerca del genoma virale, a causa della presenza in circolo degli anticorpi materni. La ricerca dell HCV RNA può fornire utili informazione per la gestione del paziente anti-hcv positivo, con ALT persistentemente normali, al fine di identificare un infezione cronica (HCV RNA-positivo) rispetto a una probabile infezione pregressa (HCV RNA-negativo). È inoltre di fondamentale importanza ricercare l HCV RNA in pazienti con epatite acuta, negativi per qualunque marcatore sierologico, in cui la presenza dell HCV RNA, in assenza di anticorpi rilevabili, permette di porre diagnosi nelle fasi precocissime dell infezione virale, e in pazienti con epatite cronica, in particolare gli immunocompromessi, come gli emodializzati e i soggetti con infezione da HIV, e i pazienti con crioglobulinemia mista, in cui la comparsa di anticorpi può essere ritardata o assente. Inoltre, è stato recentemente introdotto un test di nuova generazione (Architect HCV Antigen Assay, Abbott) per la determinazione quantitativa dell antigene core, il quale, in genere, è rilevabile entro 2-3 settimane dall infezione. Il test si effettua per mezzo di dosaggi in chemioluminescenza CMIA (chemiluminescent microparticle Immunoassay). 17

18 Terapia Nella malattia cronica da HCV l obiettivo della terapia è l eradicazione dell infezione con lo scopo di evitare la progressione dell epatite cronica in cirrosi e prevenire le complicanze della cirrosi epatica. La terapia dell epatite C ha subito un evoluzione significativa negli ultimi anni. L iniziale monoterapia con IFNα è stata prima sostituita dalla più efficace terapia di combinazione con IFNα e ribavirina (RBV) e più recentemente dall IFN peghilato (PEG-IFN), una forma coniugata con polietilenglicoli caratterizzata da lunga emivita, in combinazione con RBV. L IFNα naturale è costituito da una famiglia di citochine che comprende molecole diverse per sequenza aminoacidica e glicosidazione, la cui funzione è quella di modulare la risposta immunitaria e indurre la creazione di uno stato antivirale che impedisce la replicazione di vari virus, compreso HCV. Considerando la breve emivita degli IFNα dopo somministrazione parenterale sono state sviluppate nuove formulazioni di IFNα, a più lunga emivita. Queste formulazioni si basano sulla coniugazione dell IFN con polietilenglicole (PEG) mediante legame covalente, ottenendo composti che presentano più lento assorbimento ma soprattutto minor degradazione e rallentata clearance. Sono stati sino ad oggi sviluppati due diversi tipi di PEG-IFN, che differiscono per il sottotipo di IFN utilizzato, ma soprattutto per caratteristiche di pegilazione: il PEG-IFNα2b è IFNα2b legato ad una molecola lineare di PEG di 12kD, mentre il PEG-IFNα2a è IFNα2a legato ad una molecola ramificata di PEG di 40kD. La ribavirina è un analogo purinico di sintesi, dotato di un modesto effetto antivirale diretto. Diversi sono i meccanismi proposti per spiegare perché la somministrazione di RBV sia in grado di aumentare la probabilità di successo della terapia; tuttavia, il meccanismo d azione alla base del sinergismo non è ancora completamente compreso. I genotipi di HCV presentano una diversa sensibilità alla terapia combinata; il trattamento è, infatti, efficace in circa il 50% dei soggetti con infezione da genotipo 1b (il più diffuso) e genotipo 4 e nel 70-80% dei casi di infezione da HCV genotipo 2 e 3. Per tale ragione, la terapia di combinazione va attuata utilizzando schemi differenziati per i pazienti con infezione da genotipo 1 o 4 rispetto a soggetti con genotipo 2 o 3. Se si impiega PEG-IFN, il dosaggio, in unica somministrazione settimanale è identico per i diversi genotipi con dose calcolata sul peso corporeo per PEG-IFN a2b e fissa per PEG-IFN a2a. Questa dose iniziale può essere ridotta se insorgono effetti collaterali o eventi avversi che lo richiedano. Va considerato il fatto che una riduzione del dosaggio iniziale può determinare una significativa perdita di 18

19 efficacia. La dose iniziale di RBV consigliata è di mg al dì per i pazienti con genotipo virale 1 o 4 e di mg per quelli con genotipo 2 o 3. La durata della terapia è di 48 settimane per l infezione da genotipo 1 e 4 e di 24 settimane per l infezione da genotipo 2 e 3. La somministrazione di PEG-IFN e RBV ha rappresentato fino a pochi mesi fa il cosiddetto Standard Of Care (SOC). Tuttavia, recentemente sono stati introdotti nella pratica clinica due farmaci antivirali diretti, Boceprevir e Telaprevir, inibitori della proteasi NS3/4A. In entrambi i casi, gli studi registrativi hanno rilevato un significativo incremento della probabilità di eliminare il virus in pazienti con infezione da HCV genotipo 1. Entrambi i farmaci devono essere somministrati in triplice terapia, in combinazione con PEG-IFN e RBV. L aggiunta degli antivirali diretti al SOC comporta due notevoli vantaggi: un aumento della probabilità della risposta alla terapia e la possibilità di ridurre la durata del trattamento. Inoltre, la triplice terapia risulta essere più efficace nei pazienti difficili da trattare, cioè soggetti che non hanno risposto a un primo trattamento o che hanno avuto una ricaduta dopo una risposta iniziale (Asselah et al., 2011). Risultati estremamente promettenti sono quelli relativi alla sperimentazione di un altro farmaco, Sofosbuvir, un inibitore della polimerasi virale (Gane et al., 2013). La somministrazione del farmaco, che viene effettuata per via orale, in combinazione con la sola ribavirina, ha consentito di raggiungere l eliminazione del virus in percentuali simili a quelle ottenute con la combinazione di interferone peghilato e ribavirina, aprendo quindi il sipario verso nuovi scenari terapeutici interferon-free. Va ricordato, infine, che attualmente non è disponibile un vaccino in grado di prevenire l infezione da HCV nell uomo. L inoculazione nello scimpanzé di un vaccino costituito dalle glicoproteine E1 e E2 di HCV è in grado di indurre la produzione di anticorpi neutralizzanti specifici, nei confronti del ceppo virale impiegato nella preparazione vaccinale, ma la successiva inoculazione di un ceppo virale eterologo non è in grado di prevenire l infezione, a causa dell elevata variabilità genetica degli antigeni superficiali di HCV, pur impedendo la cronicizzazione dell infezione virale. 19

20 Monitoraggio e valutazione della risposta alla terapia L obiettivo della terapia è quello di ottenere una risposta virologica sostenuta (SVR), definita come HCV RNA non rilevabile nel siero dopo 24 settimane dalla sospensione del trattamento, che coincide in pratica con l eradicazione dell infezione. Durante l intero periodo di trattamento, i livelli di HCV RNA devono essere costantemente monitorati. Dal momento che le manifestazioni cliniche dell infezione da HCV si mostrano molto lentamente nel tempo, infatti, ciò che si utilizza per monitorare la risposta alla terapia è la cinetica virale, tramite la rilevazione dell HCV RNA a livello sierico a 4, 12, 24, ed eventualmente 48 settimane e infine sei mesi dopo il termine del trattamento. I pazienti che restano positivi per HCV RNA dovrebbero esser considerati non responsivi allo schema terapeutico utilizzato. In base ai valori di HCV RNA misurati le risposte possono essere classificate come segue (Fig. 6): - Risposta virologica rapida (RVR), definita come HCV RNA non rilevabile alla quarta settimana di trattamento. - Risposta virologica precoce (EVR), definita come una riduzione dei livelli di HCV RNA pari ad almeno 2 log rispetto ai valori misurati al baseline (ovvero prima dell inizio del trattamento) alla dodicesima settimana di trattamento. - Risposta virologica sostenuta (SVR), definita come HCV RNA non rilevabile nel siero dopo 24 settimane dalla sospensione del trattamento - Breakthrough, definito come la ricomparsa di HCV RNA nel siero durante il trattamento. - Relapse, definito come la ricomparsa di HCV RNA nel momento in cui viene sospesa la terapia. - Non Response, definita come HCV RNA rilevabile 24 settimane dalla sospensione del trattamento, - Null response, definita come riduzione di HCV RNA inferiore a 2 log dopo 24 settimane di trattamento - Partial response, definita come HCV RNA ancora rilevabile dopo la sospensione del trattamento nonostante il precedente ottenimento di EVR. 20

21 Fig. 6 Definizione di risposta al trattamento con PEG-IFN e ribavirina. Risposta virologica rapida (RVR): HCV RNA non rilevabile alla quarta settimana di trattamento. Early virological response (EVR): riduzione dei livelli di HCV RNA pari ad almeno 2 log rispetto ai valori misurati al baseline alla dodicesima settimana di trattamento. Risposta virologica sostenuta (SVR): HCV RNA non rilevabile nel siero dopo 24 settimane dalla sospensione del trattamento. I pazienti che non rispondono al trattamento possono essere decritti come non responder, se i valori di HCV RNA sono di nuovo rilevabili 24 settimane dalla sospensione del trattamento, null responder, se la riduzione di HCV RNA è inferiore a 2 log dopo 24 settimane di trattamento, o partial responder, se l HCV RNA è ancora rilevabile dopo la sospensione del trattamento nonostante avessero raggiunto l EVR. (Asselah et al., 2010) Fattori dell ospite e del virus associati alla non risposta alla terapia antivirale Nel corso degli anni sono stati identificati numerosi fattori responsabili, almeno in parte, della resistenza alla terapia antivirale a base di IFN. Alcuni sono fattori legati alle caratteristiche del virus, altri a quelle dell ospite. I principali fattori noti sono elencati di seguito. Genotipo virale Rappresenta il principale fattore in grado di influenzare il successo terapeutico. Come precedentemente detto, la probabilità di rispondere alla terapia varia dall 80% dopo 24 settimane nel caso dei genotipi 2 e 3 al 50% dopo 48 settimane nel caso del genotipo 1. Carica virale Pazienti con valori di carica virale elevati [superiori a Unità Internazionali (UI)/ml] hanno una minore probabilità di rispondere alla terapia rispetto a pazienti con bassa carica virale (inferiore a UI/ml). 21

22 Cinetica virale Di particolare interesse per il loro potere predittivo sono i valori della carica virale misurati a 4 e 12 settimane dall inizio del trattamento. Diversi studi hanno dimostrato che la presenza di RVR in pazienti con genotipo 1 è associata ad un tasso di SVR pari circa al 90% dopo sole 24 settimane di terapia. L assenza di EVR è invece altamente predittiva di fallimento terapeutico. Vari studi dimostrano come il % dei pazienti che non raggiungono questo risultato terapeutico non raggiungano neanche la SVR dopo trattamento standard. Meccanismi di evasione del sistema immunitario HCV ha sviluppato diversi meccanismi per evadere la risposta immune dell ospite. Un primo meccanismo è riconducibile all azione della proteasi NS3/4A. Come detto precedentemente, il recettore TLR3 ha la funzione di riconoscere il dsrna di HCV portando all attivazione di IRF-3 e NF-Kb mediante processi che richiedono la proteina TRIF (Toll-interleukin-1- receptor-domain-containing adaptor inducing IFNβ). La serin proteasi virale NS3/4A è in grado di tagliare questa proteina fra i residui 372 e 373, inibendo così tutta la cascata del segnale legata al TLR3 (Foy et al., 2003). Inoltre, in seguito al riconoscimento dell RNA virale, il recettore RIG-1 recluta IPS1 (IFNβ promoter simulator-1) che è localizzato a livello mitocondriale ed agisce da adattatore nell attivazione di IRF-3 e IRF-7; IPS1 è direttamente inattivato dalla proteasi NS3/4A e ciò ha notevoli conseguenze: innanzitutto in questo modo il virus riesce a bloccare le principali vie di produzione degli IFN negli epatociti e ne impedisce l amplificazione, inoltre le molecole MHC sono anch esse degli ISG e perciò una mancata stimolazione interferonica peggiora la presentazione antigenica con le ovvie implicazioni che questo ha sull efficienza dell immunità adattativa (Gale et al., 2005). La proteina core di HCV blocca la trasduzione del segnale legata alla via Jak/STAT mediante l interazione fisica diretta fra la sua estremità N-terminale e la regione SH2 di STAT1. In seguito al legame dell IFNβ sui recettori si ha l attivazione delle proteine Tyk2 e Jak1 che, insieme all IRF-9, inducono l attivazione di STAT1 e STAT2 che agiscono a livello nucleare legando le regioni ISRE e promuovendo l espressione di geni interferon-indotti quali PKR e OAS. La proteina core di HCV induce l espressione dei soppressori SOCS3 (suppressor of cytokine signalling 3) in grado di interferire con l attività enzimatica delle proteine Jak (Bode et al., 2003) (Fig. 7). 22

23 Fig. 7 HCV e risposta immune. L attivazione del TLR3 promuove il reclutamento delle chinasi IKK e TBK1, le quali catalizzano la fosforilazione dell IRF-3. L IRF-3 fosforilato forma un dimero che trasloca nel nucleo, lega il DNA e regola l espressione dell IFNβ. La serin-proteasi NS3/4A di HCV può bloccare la fosforilazione e l azione effettrice dell IRF-3. Dopo il riconoscimento dell RNA virale, RIG-1 e Mda5 reclutano l IPS-1 che agisce da adattatore per l attivazione di IRF-3 e IRF-7. L IPS-1 è inattivato dalla serinproteasi NS3/4A. La proteina Core di HCV induce l espressione di SOCS3 sopprimendo la via di trsduzione Jak/STAT (Asselah et al., 2010). Una particolare sequenza della proteina NS5A sembra associata alla non risposta al trattamento nei pazienti infettati con il genotipo 1b di HCV (Enomoto et al., 1996); in particolare una regione di 40 aminoacidi denominata Interferon Sensitivity Determining Region (ISDR) è conservata nei pazienti non responsivi alla terapia antivirale, mentre in quelli che rispondono al trattamento sono presenti più di 3 mutazioni (Chayama et al., 1997). La proteina NS5A è in grado di inibire la PKR impedendone la sua dimerizzazione legandosi mediante la sequenza ISDR alla chinasi; ciò risulta nell eliminazione del blocco della traduzione degli mrna permettendo così all HCV di resistere all effetto antivirale indotto dall interferone (Gale et al.,1998). La glicoproteina E2 contiene una sequenza di 12 aminoacidi che mostra notevole omologia con il sito di autofosforilazione della PKR. Questa regione è molto più simile ai siti di PKR nei genotipi più resistenti all interferone (1a e 1b) rispetto a quelli che lo sono di meno (2a, 2b, 3a); ciò sembra essere correlato alla maggiore resistenza alla terapia dei virus di genotipo 1 (Gale et al., 2005). 23

24 Fattori dell ospite Uno dei principali fattori di rischio di cronicizzazione dell infezione è rappresentato dall età avanzata; per quanto riguarda il sesso, è invece dimostrato che i maschi sono più colpiti rispetto alle femmine. È stato inoltre osservato che gli Afroamericani rispondono meno alla terapia antivirale, sottolineando come anche una predisposizione genetica possa influenzare il decorso della patologia. Inoltre un quadro clinico di fibrosi, steatosi e cirrosi, l insulinoresistenza, patologie concomitanti quali diabete e obesità, sono fattori correlati negativamente con la risposta al trattamento con PEG-IFN e RBV (Asselah et al., 2006; Moucari et al., 2008). Anche le coinfezioni con HIV e/o con HBV, l eccessivo consumo di alcol e l utilizzo di droghe sono generalmente associate con una bassa risposta alla terapia antivirale (Alberti 2009). Interferon L interferon venne descritto per la prima volta nel 1957 da Isaacs e Lindeman come fattore in grado di interferire sulla replicazione virale (Isaacs et al.,1957). Gli interferoni sono in realtà una famiglia di citochine pleiotropiche che hanno una notevole importanza nella risposta immunitaria innata diretta contro virus, batteri, parassiti; attivano i macrofagi e le cellule Natural Killer (NK) e potenziano l espressione di molecole di classe 1 e 2 del Complesso maggiore di Istocompatibilità (MHC); sono inoltre coinvolti nella regolazione della crescita e del differenziamento cellulare. Gli interferoni si possono classificare, in base al tipo di recettore al quale si legano, in IFN di tipo1, IFN di tipo2 e IFN di tipo3. Nella specie umana l IFN di tipo I è rappresentato principalmente dall IFNα (costituito da un gruppo di circa sottotipi) e dall IFNβ, cui vanno aggiunti gli IFNε, IFNκ, IFNω, che non sono stati ancora ben caratterizzati. Tutti gli IFN di tipo I sono codificati da geni localizzati in cluster presente sul cromosoma 9. La principale sorgente di IFNα è rappresentata dalle cellule dendritiche plasmacitoidi ed in minor misura da linfociti e macrofagi. L IFNβ è costituito da una singola proteina prodotta principalmente da fibroblasti. L IFN di tipo II comprende invece solamente un sottotipo, l IFN-γ codificato da un gene sul cromosoma 12 e rilasciato da linfociti T e cellule NK. 24

25 Gli IFN di tipo III sono rappresentati da quattro proteine codificate da tre geni presenti sul cromosoma 19: IFNλ1 o IL29, IFNλ2 o IL28A, IFNλ3 o IL28B e IFNλ4; quest ultimo è sintetizzato dallo stesso gene che codifica per l IL28B in seguito ad uno shift del modulo di lettura. Tutti gli IFN di tipo III sono prodotti da cellule epiteliali e da cellule della linea mieloide o linfoide. La risposta immunitaria innata nei confronti di un infezione virale viene attivata in seguito al riconoscimento di componenti del virus da parte di alcuni recettori specializzati espressi sulla membrana plasmatica o all interno delle cellule dell organismo. Tale attivazione comporta anche la produzione di IFN, il quale viene secreto e si lega al suo recettore sia sulla cellula infettata che sulle cellule vicine: si determina così una trasduzione del segnale che porta all espressione di specifici geni responsabili dell induzione di uno stato antivirale, ovvero una condizione di resistenza all infezione virale stessa. Il meccanismo molecolare di produzione di IFN di tipo I e III prevede il coinvolgimento di diversi recettori intracellulari o sensori, noti come PRR (Pattern Recognition Receptors), tra cui i principali appartengono alla famiglia dei toll like receptors (TLR); i TLR svolgono un ruolo chiave nelle risposte cellulari dirette contro alcuni componenti o molecole prodotte da patogeni denominati PAMPS (pathogen-associated microbial patterns). I TLR 2, 3, 4, 7, 8, 9 sono in grado di indurre la sintesi di IFN sia di tipo I che di tipo III. I TLR 3, 7, 8 e 9 si collocano sulle membrane dei compartimenti endosomiali (intracellulari) della cellula e riconoscono rispettivamente dsrna, ssrna (TLR 7 e 8), sequenze di DNA ricche di isole CpG ipometilate (Cook et al., 2004). RIG1 e MDA5 sono invece specifici per l RNA a doppio filamento (Takeuchi et al., 2008). Il riconoscimento dei PAMPS attiva una via di trasduzione del segnale che coinvolge IRF-7 (Interferon-responsive factor 7), un attivatore dell IFN. Nel caso di RIG-1 la trasduzione comporta la fosforilazione ed attivazione del fattore di trascrizione IRF-3, ad opera della protein-chinasi TBK o IKK-ε, con conseguente dimerizzazione e traslocazione nel nucleo, dove interagisce con coattivatori trascrizionali come CPB e p300 per attivare la trascrizione dei geni bersaglio tra cui IFNβ. La via di segnalazione che coinvolge IRF-7 si sovrappone a quella di IRF-3; IRF-7 si attiva, dimerizza ed interagisce con IRF-3 per poi traslocare a livello nucleare e legare il VRE (Virus Response Element) nel promotore del gene per l IFNα, inducendone la sintesi e la secrezione (Honda et al.,2005) (Fig. 8). 25

26 Fig. 8 Trasduzione del segnale che dal riconoscimento del virus porta all espressione degli ISG. a) Il PAMP virale si lega ai sensori RIG-1 o TLR3 causando la fosforilazione e attivazione di IRF-3 ad opera delle chinasi TBK1 o IKK-ε. Il dimero di IRF-3 fosforilato trasloca nel nucleo e interagisce con coattivatori trascrizionali quali CBP o p300, per poi legare la PRD (Positive Regulatory Domain) nel promotore dei geni bersaglio di IRF-3, fra cui l IFNβ. Una via di segnale sovrapposta comporta l attivazione di IRF-7, che dimerizza ed interagisce con IRF-3, traslocando poi nel nucleo per legare il VRE (cognate-virus Response Element) nel promotore del gene per l IFNα. b) Ciò risulta nella produzione e secrezione di interferone dalla cellula infettata. c) L interferone appena secreto lega il suo recettore (sia sulla cellula che lo ha prodotto che quelle vicine) portando alla trasduzione del segnale della via Jak/STAT che risulta nella formazione del complesso ISGF3 (STAT2-STAT1-IRF9) che d) nel nucleo lega gli ISRE e induce l espressione degli ISG (Gale et al., 2005). Tutti gli IFN di tipo I legano lo stesso recettore, membro della famiglia dei recettori per le citochine di tipo II, costituito da due proteine strutturalmente correlate (IFNAR1 e IFNAR2), associate, nel loro dominio citoplasmatico, rispettivamente alle proteine TYK2 e JAK1. Gli IFNλ si legano ad un recettore costituito da due subunità, denominate IL-28R o IFNLR1 e IL10R2; quest ultima è condivisa con altre interleuchine quali IL-10, IL-22 e IL-26 ed è espressa, come il recettore degli IFN di tipo I, in maniera ubiquitaria nelle cellule. Viceversa l espressione della subunità IFNLR1 appare limitata solo ad alcuni tipi di cellule tra le quali soprattutto quelle di natura epiteliale. Pur riconoscendo recettori diversi, gli IFN di tipo I e III sono in grado di attivare la stessa via di trasduzione del segnale (Fig. 9). 26

27 Fig. 9 Via di trasduzione del segnale attivata dagli IFN di tipo I e III (Afdhal et al., 2011) A seguito del legame dell IFN su cellule adiacenti a quella infettata, le due molecole recettoriali si aggregano e si attivano fosforilandosi reciprocamente e fosforilando anche i residui di tirosina nella porzione citoplasmatica del recettore. Ciò fornisce un sito di legame per particolari domini SH2 (Src Homology 2) presenti nelle proteine STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription) che si trovano in forma monomerica nel citoplasma. Queste ultime vengono così fosforilate dalle chinasi Jak, facendo sì che il fattore STAT attivato sia in grado di legare il dominio SH2 di un altra molecola STAT; si forma così un dimero che si stacca dal recettore e si associa ad una terza proteina IRF-9 costituendo un complesso che migra nel nucleo dove va a legare specifiche sequenze di DNA definite ISRE (IFN-Stimulated Response Elements) presenti in numerosi geni ISG (Interferon Stimulated Genes) attivandone la trascrizione (Sadler et al., 2008). Il legame degli IFN porta all induzione di centinaia di geni interferon-indotti alcuni dei quali sono direttamente implicati nel determinare lo stato antivirale. Tra questi sono inclusi i geni che codificano per le proteine Mxa (Mixovirus resistance protein A), PKR (Protein kinase R), 27

28 P56 e ADAR-1 (adenosine deaminases that act on double-stranded RNA) che sono state oggetto di questo studio. Di seguito è brevemente descritto il loro meccanismo d azione. La proteina MxA è una GTPasi, indotta sia dagli IFN di tipo I che di tipo III, implicata nel traffico vescicolare dal complesso di Golgi alla membrana plasmatica, in quanto è necessaria per la fusione delle membrane nel distacco delle vescicole rivestite da clatrina. MxA si aggrega e forma degli oligomeri in prossimità del reticolo endoplasmatico dove lega le proteine neosintetizzate e impedisce gli eventi di esocitosi delle particelle virali di nuovo assemblaggio,assicurando così uno dei meccanismi di protezione delle cellule adiacenti a quella infettata (Accola et al., 2002). La PKR è una serin-treonin chinasi che risponde a stress cellulare regolando la sintesi proteica della cellula; normalmente è presente all interno della cellula in uno stato inattivo. In seguito al legame con il dsrna, due molecole di PKR vanno incontro a cross-fosforilazione e la PKR diventa una chinasi attiva, in grado di fosforilare la subunità α del Fattore d Inizio di Traduzione Eucariotico 2 (eif-2α), impedendo così la formazione del complesso di inizio necessario per la traduzione degli RNA messaggeri e dunque inibendo la sintesi proteica cellulare; naturalmente l inibizione della sintesi proteica cellulare ha effetti limitanti sulla produzione di proteine virali. Inoltre la PKR, in presenza di dsrna, attiva il fattore di trascrizione NF-kB che è essenziale per mediare l induzione di IFNβ e promuove l apoptosi delle cellule già infette. La proteina P56 o IFIT1 inattiva il fattore eif-3 di inizio della sintesi proteica, impedendo la traduzione degli RNA virali. La proteina ADAR-1 è un adenosina deaminasi RNA-specifica che catalizza la conversione dell adenosina in inosina, alterando la sequenza nucleotidica e la funzione delle molecole di RNA. Interferone lambda Nel 2003 sono state scoperte, indipendentemente da 2 gruppi di ricerca, 3 citochine: IL-29, IL-28A e IL28B, designate rispettivamente come IFNλ1, IFNλ2, IFNλ3, e classificati nel complesso come interferoni di tipo III (Kotenko et al., 2003). Questi mediatori proteici fanno parte di una più ampia famiglia di citochine di classe II (IL-10 IFN Family) che include altre citochine quali IL-10, IL19, IL-20, IL-22, IL-24 e IL

29 I geni per gli IFNλ sono localizzati sul cromosoma 19 nell uomo e nel cromosoma 7 nel ratto. L IFNλ2 ha nella sequenza amminoacidica una omologia di circa il 96% con l IFNλ3 mentre l IFNλ1 mostra una omologia di sequenza con l IFNλ2 pari all 81%. Il gene per l IFNλ3 è trascritto in direzione opposta ai geni per gli IFNλ1 e 2. Oltre alle sequenze codificanti nel cluster genico degli IFNλ sia dell uomo che del ratto si ha la presenza di pseudogeni (nell uomo IFN- λ4ψ) (Fig. 10). I recettori per gli IFNλ appartengono alla famiglia dei recettori per le citochine di classe II (CRF2) e sono costituiti da 2 subunità: IFNλ R1 (o IL-28R1) e IL-10R2; i rispettivi geni sono localizzati rispettivamente sul cromosoma 1 e 21. IFNλ R1 è una subunità unica del complesso recettoriale per IL-28A, IL28B ed IL-29 ed è espressa solo in alcuni tipi di cellule, principalmente quella di natura epiteliale e negli epatociti. Viceversa l IL-10R2 è anche un componente essenziale dei recettori per IL-10, IL- 22 ed IL-26 ed è costitutivamente espresso, come i recettori per gli IFN di tipo I, in maniera ubiquitaria nelle cellule (Donnelly et al., 2004). Fig.10 Organizzazione dei geni codificanti gli IFNλ e i loro recettori. A) regione codificante gli IFNλ nell uomo e nel topo. B) e C) geni per i recettori dell IFNλ nell uomo e nel topo (Donnelly e Kotenko, 2010). Il legame degli IFNλ al complesso recettoriale promuove la transfosforilazione delle Janus chinasi Jak1 e Tyk2 che sono associate a livello citoplasmatico rispettivamente all IFNλR1 e a IL-10R2; ciò permette il reclutamento e l attivazione dei fattori di trascrizione STAT1 e STAT2 ( Kotenko et al., 2003) e può anche indurre l attivazione di STAT3, STAT4 e STAT5. 29

30 Gli omo o eterodimeri dei fattori STAT migrano nel nucleo dove vanno a legare specifiche sequenze di DNA definite GAS (IFN-γ activated sequence) nei promotori dei geni responsivi all IFN. Alternativamente l eterodimero costituito da STAT1 e STAT2 recluta IRF9 formando un complesso di trascrizione trimerico noto come ISGF3 che regola la trascrizione genica legando ISRE (Interferon stimulated response elements) nei promotori di altri geni interferon-indotti (ISG). Tra questi geni vi sono quelli associati alla risposta antivirale come l OAS, IRF-7, PKR, MxA (Fig. 11). Come già riportato, questa seconda via di trasduzione del segnale è comune anche agli IFN di tipo I. Fig. 11 Modello del signaling pathway degli IFN. I tre diversi tipi di IFN legano complessi recettoriali distinti sulla membrana cellulare. La trasduzione del segnale dovuta agli IFN induce l espressione dei geni interferonindotti (ISG) (Donnelly e Kotenko, 2010). La principale attività biologica degli IFNλ è l azione antivirale esercitata nei confronti di diversi virus tra i quali il virus dell encefalomiocardite, il virus della stomatite vescicolare, l HBV e l HCV (Kotenko et al., 2003). Gli IFNλ sono anche in grado di stimolare l espressione di molecole MHC di classe I. Un attività antiproliferativa degli IFNλ è stata dimostrata in diversi tipi cellulari; la capacità di modulare lo stato proliferativo della cellula sembra dipendere dai livelli di espressione dell IFNλR1. A tal riguardo è stato osservato che gli IFNλ possono effettivamente inibire la proliferazione di cellule ingegnerizzate che esprimono alti livelli del recettore dell IFNλ (Meager et al., 2005). 30

31 Gli IFNλ mostrano inoltre un attività antitumorale, come gli IFN di tipo I, ed immunomodulante. Polimorfismi genetici dell IL28B Come descritto precedentemente, fattori virali, epidemiologici e comportamentali hanno un ruolo nell influenzare il decorso dell infezione e la risposta alla terapia; tuttavia, questi spiegano solo una parte della variabilità che li caratterizza. Da questo deriva il sempre crescente interesse verso i fattori genetici dell ospite come fattori in grado di spiegare la restante parte della variabilità che contraddistingue il decorso dell infezione da HCV. Recentemente alcuni polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) localizzati nella regione genica dell IFNλ3 (IL28B) sono stati associati alla clearance virale sia spontanea sia indotta dalla terapia nei pazienti con HCV. L associazione è stata scoperta mediante approcci GWAS (Genome-wide association study), che mirano ad esaminare le variazioni genetiche presenti nel genoma umano con l intento di stabilire una correlazione tra queste e vari tratti fenotipici; questo approccio si avvale di nuove tecniche di genotipizzazione che consentono di valutare centinaia di migliaia di polimorfismi a singolo nucleotide lungo l intero genoma e stabilire mediante analisi statistica se esiste una qualche associazione significativa tra i polimorfismi e il tratto fenotipico d interesse. In particolare, una forte associazione con la risposta alla terapia interferonica è emersa per gli SNP rs (C/T) e rs (T/G) (Fig. 12). Fig. 12 Polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) presenti nella regione genica dell IL28B (Afdhal et al., 2011). Il primo studio sugli SNP dell IL28B è stato condotto su un gruppo di 1671 pazienti con infezione da HCV genotipo 1 appartenenti a diverse etnie (europei, africani, ispanici). Dopo il trattamento di 48 settimane con Peg-IFNα e ribavirina una stretta associazione è stata riscontrata tra il raggiungimento di una risposta virologica sostenuta (SVR) in seguito al trattamento antivirale ed un cluster di 7 SNP associati al gene dell IL28B. In particolare è 31

32 stato osservato che lo SNP rs ha un alta significatività statistica per l SVR (p= negli europei, p=2, negli africani). I pazienti omozigoti per l allele protettivo (C/C) dello SNP rs mostrano infatti una probabilità di raggiungere una SVR tre volte più elevata rispetto agli omozigoti per l allele di rischio (T/T) (78% vs 28%) mentre gli eterozigoti presentano una SVR di circa 2 volte inferiore rispetto agli omozigoti per l allele C (38%) (Ge et al., 2009). Da ciò si evince come la presenza dell allele C sia positivamente associata con una risposta virologica sostenuta. Un secondo studio è stato condotto su pazienti australiani ed europei, infettati dal genotipo1 di HCV, che avevano ricevuto un trattamento con PEG-IFNα; diversi SNP sono stati associati alla clearence virale, ma l associazione più forte si è riscontrata con lo SNP rs Rispetto agli omozigoti per l allele T, negli eterozigoti per l allele minore G (G/T) è presente un aumento del rischio di non risposta alla terapia di 1,64 volte, mentre gli omozigoti G/G presentano un rischio 2,39 volte superiore (Suppiah et al., 2009). È stato inoltre riportato che la frequenza degli SNP dell IL28B a livello mondiale non ha una distribuzione omogenea. A tal proposito, genotipizzando lo SNP rs in più di 2000 persone appartenenti a 51 gruppi etnici diversi, è stato osservato che le popolazioni del sud-est asiatico hanno una più alta frequenza dell allele associato alla clearance dell HCV, mentre le popolazioni africane o europee hanno una frequenza dell allele C rispettivamente più bassa o intermedia (Thomas et al., 2009) (Fig. 13). Fig. 13 Frequenze alleliche dello SNP rs in diversi gruppi etnici. (Balagopal et al., 2010) 32

33 Per determinare i potenziali effetti dello SNP rs sulla risoluzione naturale (senza trattamento) dell infezione da HCV, Thomas e colleghi hanno genotipizzato questa variante in circa 1000 pazienti dei quali 388 avevano eliminato spontaneamente il virus mentre gli altri 620 erano andati incontro ad infezione persistente. È stato osservato che il genotipo C/C è fortemente associato alla risoluzione dell infezione da HCV, con una clearence simile nei pazienti europei ed africani. Inoltre i risultati di questo studio indicavano che la clearence negli omozigoti C/C è all incirca il doppio che nei soggetti T/T. Anche il genotipo T/T per l rs è stato associato con la risoluzione spontanea dell infezione da HCV (Rauch et al., 2010). Un altro importante aspetto dell infezione da HCV riguarda la presenza di coinfezioni con il virus dell immunodeficienza umana (HIV). Infatti si stima che circa un terzo delle persone infettate con HIV siano anche coinfettate da HCV. L infezione da HIV sembra complicare l infezione da HCV aumentandone la persistenza; ciononostante l infezione da HIV non influenza l associazione tra gli SNP dell IFNλ e la clearence di HCV. In uno studio su pazienti provenienti da 8 ospedali svizzeri, l allele minore (G) dello SNP rs è stato associato con la progressione cronica dell infezione da HCV nei pazienti con coinfezione da HCV/HIV (Rauch et al., 2010). Più recentemente studi di associazione dello SNP rs sono stati condotti su pazienti infettati con il genotipo 2 e 3 di HCV (Mangia et al., 2010). Il gruppo preso in esame consisteva di 298 pazienti di etnia caucasica (genotipo 2=213; genotipo 3=55) che sono stati randomizzati in 2 gruppi che ricevono la terapia standard (PEG-IFN per 24 settimane) o variabile (se presentano SVR per 12 settimane, altrimenti trattati per 24 settimane). I risultati ottenuti da questo studio indicano che i soggetti con genotipo C/C hanno una SVR dell 82% rispetto agli eterozigoti (75%) ed agli omozigoti T/T (58%). È stata trovata una forte associazione solo nei pazienti che non hanno una rapida risposta virologica e che hanno ricevuto il trattamento standard. Da uno studio di Rauch e coautori non è stata trovata un associazione tra i genotipi 2 e 3 di HCV e i polimorfismi dell IFNλ3 sebbene il fallimento della terapia sia molto basso (37/230 pazienti). Al contrario, 2 gruppi di ricerca hanno provato che lo stato dell IFNλ3 può essere predittivo dell SVR nell infezione da genotipi virali 2 e 3 (Mangia et al., 2010). In definitiva, l influenza degli SNP rs e rs dell IL28-B sull esito clinico della terapia interferonica sembra essere evidente per i genotipi 1 e 4 di HCV, mentre per gli altri genotipi di HCV (2 e 3) sono emersi dati discordanti. 33

34 Effetti dei polimorfismi dell IL28B Non è ancora chiaro come i polimorfismi dell IFNλ3 identificati influenzino la risposta immunitaria o esercitino degli specifici effetti antivirali nei pazienti HCV infetti. Gli SNP rs e rs , infatti, non sono localizzati all interno della regione codificante del gene, ma si trovano rispettivamente circa 3 kb a monte del gene dell IL28B nella regione intergenica tra IFNλ2 e IFNλ3 a 8.9 kb dal codone di inizio dell IL28B. E probabile quindi che essi siano localizzati all interno di sequenze di regolazione del gene IFNλ3 o che siano associati con polimorfismi funzionali coinvolti nella regolazione o nella funzione del gene. Ciò potrebbe essere dovuto alla presenza di una condizione di linkage disequilibrium con altri polimorfismi non ancora identificati che potrebbero essere i diretti responsabili degli effetti biologici osservati. La presenza dell allele protettivo è stata associata ad un incremento dei livelli di IFNλ3 misurati nei PBMC (Suppiah et al., 2009), mentre in altri studi la presenza di questa associazione non è stata confermata (Ge et al., 2009). Inoltre, l allele protettivo T per lo SNP rs non è stato correlato con una maggiore produzione intraepatica di IFNλ3, e bassi livelli di IFNλ3 sono stati associati con una maggiore espressione epatica di ISG (Honda et al., 2010). Ge e coautori hanno anche osservato che i pazienti con l allele protettivo dello SNP rs hanno una più alta carica virale rispetto ai portatori dell allele di rischio. Inoltre, è stato osservato come una scarsa risposta al trattamento con IFNα correli con una maggiore espressione di ISG intraepatica prima del trattamento (Honda et al., 2010). Una possibile spiegazione è che il pathway dell IFNα e l espressione di ISG sia massimamente stimolata nel fegato di pazienti con infezione cronica da HCV e dunque non più responsivo al trattamento con IFNα esogeno. Il modello proposto per spiegare come l IFNλ agisca durante l infezione cronica da HCV prevede che l IFNα induca l espressione dei geni interferon-indotti a livello epatico, ma non in maniera sufficiente da raggiungere la clearence virale; l IFNλ potrebbe quindi stimolare differenti ISG e promuovere l eliminazione del virus. In questo schema, i polimorfismi dell IFNλ potrebbero influenzare l espressione di alcuni ISG giusti direttamente nel fegato o mediante la stimolazione delle cellule effettrici che li sintetizzano e partecipare al raggiungimento della clearence virale (Kelly et al., 2011) (Fig. 14). 34

35 Fig. 14 Modello dell attività dell IFNλ nell epatite cronica da HCV. IFNα up-regola nel fegato l espressione di geni IFN-indotti (primo cerchio). IFNλ stimola differenti ISG (secondo cerchio). Il polimorfismo dell IFNλ può influenzare l espressione di ISGdirettamente o tramite le cellule effettrici (Kelly et al., 2011). 35

36 SCOPO DELLA TESI 36

37 Stime recenti dell Organizzazione Mondiale della Sanità indicano che oltre 170 milioni di persone sono infettate da HCV. L infezione primaria cronicizza nell 80-85% dei casi e può rimanere asintomatica, da un punto di vista clinico, anche per decenni. In una quota variabile di soggetti portatori del virus, l epatite cronica C può poi evolvere verso la cirrosi epatica e l epatocarcinoma. Fino a pochi mesi fa il gold standard della terapia antivirale era rappresentato dalla somministrazione di PEG-IFNα in combinazione con ribavirina. La terapia interferonica porta alla normalizzazione delle transaminasi, l abbattimento della carica virale plasmatica ed un miglioramento del quadro istologico a livello epatico. Tuttavia una discreta percentuale di soggetti non raggiunge una risposta virologica sostenuta dopo il trattamento interferonico o presenta una ripresa della malattia in seguito alla sospensione della terapia; inoltre il trattamento prolungato con interferone è associato con pesanti effetti collaterali. Recentemente, sono stati introdotti nella pratica clinica alcuni antivirali diretti, che agiscono contro la proteasi virale NS3/4A. Tuttavia, a causa della enorme variabilità che caratterizza il virus, la somministrazione in monoterapia dei nuovi farmaci non è ancora possibile perché porterebbe rapidamente alla selezione di varianti virali farmacoresistenti. Per questa ragione l IFN ha ancora un ruolo centrale nel trattamento dei pazienti con infezione cronica da HCV. Nel 2009 alcuni SNP localizzati nella regione genica dell IL28B (IFNλ3) sono stati associati alla clearance virale sia spontanea che indotta dalla terapia antivirale nei pazienti infettati da HCV (Ge et al., 2209; Suppiah et al., 2009; Thomas et al., 2009). Tutto ciò sembra sottolineare il ruolo dei fattori genetici dell ospite che, in aggiunta ad altri parametri virali e dell ospite stesso, possono influenzare la storia naturale dell infezione da HCV e l esito della terapia con IFN (Asselah et al., 2010). L IL28B è anche nota come IFNλ3 e appartiene alla classe degli IFN di tipo III; queste citochine, pur riconoscendo un recettore diverso, sono in grado di attivare lo stesso pathway attivato dagli IFN di tipo I, ovvero l IFN alfa. In particolare, gli SNP rs (C/T) e rs (T/G) sono stati indicati come possibili marcatori di risposta alla terapia antivirale nell infezione da HCV genotipo 1 (Ge et al., 2009; Suppiah et al., 2009; Thomas et al., 2009). 37

38 Alla luce di queste considerazioni, lo scopo della tesi sarà valutare il ruolo dei polimorfismi rs e rs nella risposta alla terapia interferonica nell infezione da HCV; in particolare saranno perseguiti i seguenti obiettivi: valutare l influenza degli SNP rs e rs dell IL28B sulla risposta alla terapia con Peg-IFN e ribavirina in pazienti con infezione cronica da diversi genotipi di HCV; valutare la presenza di un eventuale correlazione tra il genotipo dei polimorfismi dell IL28B e alcuni fattori associati alla probabilità di rispondere alla terapia, quali la carica virale misurata prima dell inizio del trattamento e lo stadio di fibrosi; caratterizzare il significato biologico dei polimorfismi rs e rs dell IL28B mediante l analisi dell espressione di alcuni geni interferon-indotti. L analisi sarà eseguita su campioni di DNA estratto da cellule mononucleate di sangue periferico (PBMC) prelevate da 170 pazienti con infezione cronica da HCV trattati con PEG- IFN e ribavirina. I genotipi degli SNP rs e rs saranno analizzati mediante la metodica del pirosequenziamento. Inoltre, al fine di caratterizzare il significato biologico dei polimorfismi oggetto dello studio, sarà valutata l espressione dei geni IFN-indotti MxA, PKR, P56, e ADAR-1 mediante RT- Real Time PCR (Fig.15). 38

39 Fluorescenza Pazienti HCV positivi Prelievi ematici PBMC Estrazione DNA: QIAampBlood kit TT CC TT rs C 5 min 55 C 30 s 72 C 15 s per 35 cicli TT CC CC 72 C 5 min GG GG TT TT TT SNPs rs e rs dell IL28B Valutazione espressione geni IFN-indotti rs C 5 min 50 C 30 s 72 C 30 s per 35 cicli 72 C 5 min Elettroforesi Pirosequenziamento PyroMark TM Q96 ID instrument (QIAGEN) Fig. 15 Disegno dello studio: dopo aver raccolto i PBMC dai pazienti HCV positivi sottoposti ad un ciclo di terapia con IFN e ribavirina è stato estratto il DNA totale. Successivamente viene amplificata la regione contenente gli SNP rs e rs e sequenziata con l utilizzo del PyroMark Q96 ID. I pazienti aventi genotipo CC dello SNP rs e TT per lo SNP rs dell IL28B (verdi) rispondono positivamente alla terapia eradicando l HCV; i pazienti con genotipo TT e GG (rossi) sono invece i non responder (NR). 39

40 MATERIALI E METODI 40

41 Caratteristiche clinico-demografiche dei pazienti Nello studio sono stati inclusi 170 pazienti affetti da epatite cronica di tipo C i quali aveveno completato un ciclo di terapia con Peg-IFN alpha 2a o 2b in combinazione con ribavirina. Tutti i pazienti erano positivi per gli anticorpi anti-hcv e presentavano livelli di HCV RNA nel plasma rilevabili da oltre 6 mesi prima dell inizio della terapia. Sono stati esclusi dallo studio pazienti HCV-positivi precedentemente sottoposti ad altre terapie antivirali o immunomodulatorie, pazienti HBsAg-positivi e pazienti con altre patologie epatiche quali epatiti autoimmuni o alcoliche. I campioni di sangue sono stati raccolti dal 2006 al 2010 presso tre centri clinici italiani ('Università degli Studi "Gabriele d'annunzio", Università degli Studi di Bari, Università Campus Biomedico di Roma) e conservati a -80 C. Tutti i campioni analizzati in questo studio sono stati ottenuti previo rilascio del consenso informato scritto dei pazienti. Estrazione del DNA L estrazione del DNA cellulare totale è stata eseguita utilizzando un saggio disponibile in commercio, il DNeasy blood and tissue kit (Qiagen, Milano, Italia). Qui di seguito viene descritta brevemente la proceduta di estrazione del DNA. I pellet cellulari, derivanti dai campioni biologici, sono stati risospesi in PBS; ad un volume di campione di 200 μl sono stati aggiunti 20 μl di proteinasi K (20 mg/ml) e 200 μl di buffer AL per effettuare la lisi cellulare. Al fine di ottenere un efficiente azione litica è essenziale agitare vigorosamente la miscela per produrre una soluzione omogenea e incubare poi per 10 minuti a 56 C. Successivamente il lisato è stato trasferito in apposite colonnine fornite dal kit (QIAamp spin columns) contenenti filtri di gel di silice con elevata affinità per gli acidi nucleici. Le condizioni saline e del ph nel lisato assicurano che proteine e altri contaminanti che potrebbero inibire la successiva reazione di PCR non siano assorbite dal filtro. Il legame degli acidi nucleici alla membrana contenuta nelle colonnine è garantito da una centrifugata di un minuto a 8000 rpm, che lascia fluire nella provetta di scarico i componenti della miscela non assorbiti dal filtro. Successivamente sono stati eseguiti lavaggi con due diversi tamponi per incrementare la purezza del DNA estratto e per assicurare una completa 41

42 rimozione di eventuali contaminanti. Con il primo lavaggio si aggiungono alla colonnina 500 μl di buffer AW1 (20 mm di NaCl, 2 mm di Tris-HCl, ph 7.5 e etanolo al 57%), si centrifuga a 8000 rpm per un minuto e si getta poi il filtrato ottenuto; il secondo lavaggio prevede l aggiunta di 500 μl di buffer AW2, che differisce dal precedente solo nel contenuto di alcool (etanolo al 70%), una centrifugata alla massima velocità per tre minuti e la rimozione del filtrato. Per eliminare ogni possibile residuo di tampone è stata eseguita un altra centrifugata di un minuto alla massima velocità. Il DNA genomico purificato è stato infine eluito con 200 μl di un apposito tampone AE (10 mm Tris-HCl, 0.5 mm EDTA, ph 9) che, oltre a consentire il rilascio del DNA dalla membrana, ne previene anche la degradazione. Dopo aver incubato per circa un minuto a temperatura ambiente, si centrifuga a 8000 rpm per un minuto affinché l eluato possa filtrare attraverso la membrana delle colonnine. Il DNA è stato quindi contato allo spettrofotometro. Reazione a catena della polimerasi (PCR) per la determinazione degli SNP dell IL28B La PCR è una reazione di amplificazione in vitro di uno specifico segmento di DNA ad opera di una DNA polimerasi. Il segmento di DNA d interesse, riconosciuto da specifici primer, viene amplificato da reazioni a catena della DNA-polimerasi in numerosi cicli successivi. La PCR avviene in una serie di cicli composti da tre fasi: - Denaturazione del DNA a temperature elevate (90-95 C). - Annealing (appaiamento) in cui i primer si appaiano ai filamenti di DNA a temperature comprese tra i C. - Estensione da parte della DNA polimerasi termoresistente a partire dai primer a temperature comprese tra i C. Tali fasi si ripetono per un elevato numero di volte (35-45 cicli) determinando l accumulo di un alto numero di copie della regione d interesse. In particolare, gli SNP rs e rs dell IL28B sono stati amplificati mediante PCR eseguita su DNA estratto da PBMC raccolti da pazienti con infezione da HCV. Il DNA estratto dalle cellule è stato sottoposto ad una reazione di PCR specifica per le regioni contenenti gli SNP rs e rs dell IL28B utilizzando le seguenti coppie di primer. 42

43 IL28B rs primer forward primer reverse CTT-ATC-GCA-TAC-GGC-TAG-GC 5 bio-gcg-gag-tgc-aat-tca-acc IL28B rs primer forward primer reverse 5 biocct-ttt-gtt-ttc-ctt-tct-gtg-ag AAA-AAG-CCA-GCT-ACC-AAA-CTG-T La procedura di PCR utilizzata viene qui di seguito riportata: 5 l di DNA sono stati aggiunti a 45 l di una miscela per PCR contenente un tampone (Tris-HCl10 mm, MgCl21,5 mm, KCl 50 mm), dntp 500 M, primer 20 l e 2,5 U/ l di Taq Polimerasi. La biotinilazione di uno dei due primer è necessaria per consentire il legame del neofilamento amplificato alla superficie di biglie rivestite di streptavidina, fondamentali per il realizzarsi delle successive fasi di pirosequenziamento. I primer sono stati disegnati con il software PyroMark PSQ Assay Design (Qiagen) in modo tale da amplificare un frammento di 160 bp per rs e un frammento di 76 bp per rs Il DNA estratto da PBMC è stato sottoposto ad una reazione di PCR secondo i seguenti profili termici: rs denaturazione 95 C per 5 minuti - annealing 55 C per 30 secondi - polimerizzazione 72 C per 15 secondi per 35 cicli - estensione 72 C per 5 minuti rs denaturazione 95 C per 5 minuti - annealing 50 C per 30 secondi - polimerizzazione 72 C per 30 secondi per 35 cicli - estensione 72 C per 5 minuti 43

44 In tutte le reazioni di PCR, in parallelo ai nostri campioni, sono stati amplificati anche degli idonei controlli positivi e negativi al fine di valutare l esito dell amplificazione ed escludere la presenza di falsi positivi. Analisi del prodotto di PCR degli SNP dell IL28B Per verificare l avvenuta reazione di amplificazione ed escludere la presenza di eventuali contaminazioni dei controlli negativi, i prodotti di PCR sono stati analizzati mediante elettroforesi su gel di agarosio in presenza di 0,1 μl/ml di intercalante GelRed (Biotium). Il gel di agarosio è stato preparato ad una concentrazione del 3% (peso/volume) in un tampone TAE 1X (Tris base, acido acetico glaciale ed EDTA a ph 8,0). Metodo del pirosequenziamento I prodotti di PCR degli SNP rs e rs dell IL28B sono stati sottoposti a pirosequenziamento. Qui di seguito vengono descritti il principio e la metodica di pirosequenziamento utilizzata per lo studio dei polimorfismi dell IL28B. Il pyrosequencing è una tecnica di sequenziamento basata sulla sintesi del DNA a temperatura ambiente in tempo reale. L incorporazione di ogni nucleotide è monitorata grazie ad una cascata enzimatica altamente sincronizzata che porta alla produzione di un segnale di bioluminescenza a seguito del rilascio di pirofosfato, da cui il nome. La cascata enzimatica del pyrosequencing si compone di 4 enzimi: il frammento di Klenow della DNA polimerasi I, l adenosina trifosfato (ATP) solforilasi, la luciferasi e l apirasi. La miscela di reazione contiene anche i substrati degli enzimi, l adenosina fosfosolfato (APS), la D-luciferina e il campione da sequenziare associato ad un primer. I quattro nucleotidi sono aggiunti uno alla volta alternativamente in maniera ciclica e una camera CCD (Charged Coupled Device) rileva costantemente la luce prodotta. 44

45 La prima reazione, la polimerizzazione del DNA, avviene se si aggiungono nucleotidi che sono complementari alla sequenza del campione e che quindi portano all incorporazione di questi ultimi nella catena di DNA in crescita. (DNA) n + dntp (DNA) n+1 + PP i Questa reazione è catalizzata dalla Klenow DNA polimerasi che, oltre all attività polimerasica, possiede anche un attività esonucleasica 3-5 per rimuovere gli appaiamenti delle basi non corretti ed aumentare la fedeltà di incorporazione dei nucleotidi nella catena di DNA crescente. Il fosfato inorganico, PPi, rilasciato dalla DNA Polimerasi serve da substrato per l ATP solforilasi la quale produce ATP attraverso questa reazione: PP i + APS ATP + SO 2-4 (ATP solforilasi) Attraverso la terza e la quarta reazione l ATP è convertito in luce ad opera della luciferasi e solo se viene aggiunto il corretto nucleotide alla reazione si produce un segnale luminoso. luciferasi + D-luciferina + ATP luciferasi-luciferina-amp + PPi luciferasi-luciferina-amp + O 2 luciferasi + ossiluciferina + AMP + CO 2 + luce La luciferasi utilizzata per la tecnologia del pirosequenziamento deriva da una variante enzimatica dalla libellula nord-americana Photinus pyralis. Questa luciferasi produce una luce nella regione del verde-giallo ( nm) con un emissione massima a 562 nm a ph fisiologico. Inizialmente la luciferasi subisce un cambio conformazionale quando lega la luciferina e l ATP in presenza di magnesio, successivamente la produzione della luce avviene mediante un processo di carbossilazione ossidativa del complesso luciferina-amp. L apirasi rimuove i nucleotidi non incorporati e l ATP in eccesso tra un aggiunta di nucleotidi e l altra; questa degradazione nucleotidica è essenziale per assicurare che l intensità di luce rilevata in corrispondenza della somministrazione di un nucleotide provenga soltanto dall incorporazione di quel nucleotide (Fig. 16). L attività dell apirasi dipende da cationi bivalenti come il Ca 2+ e il Mg 2+ e la sola apirasi attualmente in commercio è quella estratta dalla patata (Solanum tuberosum). 45

46 Fig. 16 Reazioni enzimatiche a cascata coinvolte nel pirosequenziamento. (Immagine Biotage ) Pirosequenziamento degli SNP dell IL28B I prodotti di PCR sono stati sequenziati utilizzando lo strumento PyroMark Q96 ID (Qiagen, Milano, Italia). La preparazione dei campioni è stata ottenuta mediante l utilizzo dello strumento VPW (Vacuum Prep Workstation), costituito da una spazzola (Vacuum Prep Tool) a 96 aghi filtranti collegata ad una pompa a vuoto, per la purificazione contemporanea di 96 prodotti di PCR a partire da una micropiastra a 96 pozzetti; tale processo richiede solo 15 minuti. Rispetto alle tecniche di sequenziamento ad oggi disponibili il sistema utlizzato presenta i seguenti vantaggi: - sequenziamento di un ampio numero di campioni (si possono sequenziare fino a 96 campioni contemporaneamente); - lettura della sequenza in tempo reale durante la reazione; - ridotto tempo di analisi. Il sistema di pirosequenziamento PyroMark Q96 ID richiede l utilizzo di un primer di PCR biotinilato per consentire il legame del filamento di DNA stampo biotinilato a delle sfere di sefarosio rivestite di streptavidina. Una volta applicato il vuoto al Vacuum Prep Tool, esso aspira completamente, attraverso gli aghi filtranti, l intera soluzione di PCR l intera soluzione 46

47 di PCR, eccetto il templato legato alle sfere di sefarosio, il quale viene trattenuto sul filtro. Ciò consente di svolgere rapidamente anche le successive fasi di purificazione e denaturazione dei prodotti di PCR. In particolare il pettine, a cui sono adese le biglie con gli amplificati, viene immerso inizialmente in una soluzione di etanolo 70% per la purificazione del DNA, poi in una soluzione denaturante e infine in una soluzione di lavaggio. In questo modo il filamento di DNA non biotinilato viene rimosso poiché non risulta più essere legato alle biglie dopo la fase di denaturazione (Fig. 17 ). Fig. 17 Legame del neofilamento di DNA biotinilato alle biglie di sefarosio rivestite di streptavidina utilizzate nella metodica del pirosequenziamento. Successivamente, dopo aver tolto il vuoto, il pettine, con legato il neofilamento di DNA biotinilato, viene immerso nella piastra di annealing contenente il primer per il sequenziamento e l annealig buffer. In seguito si inserisce la piastra così preparata nel sequenziatore e si procede alla lettura della sequenza analizzata che viene rivelata sul pirogramma: i picchi rappresentano l emissione di luce e l avvenuta incorporazione dei nucleotidi (Fig.18). 47

48 Di seguito viene brevemente descritto il protocollo utilizzato. In una piastra da 96 pozzetti è stata dispensata la miscela di binding costituita da: - 37 μl Binding buffer - 20 μl H 2 0 DEPC - 3 μl biglie di sefarosio rivestite di streptavidina - 20 μl prodotto di PCR La piastra, dopo essere stata posta in agitazione per 15 min a 1400 rpm, è stata incubata per 10 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo è stata preparata e dispensata nella piastra di annealing da 96 pozzetti una miscela costituita da: - 38 μl di annealing buffer - 2 μl di primer di sequenziamento (AGC-TCC-CCG-AAG-GCG) per rs (TTC-CAA-TTT-GGG-TGA) per rs Successivamente il Vacuum Prep Tool viene inserito nella piastra degli amplificati e per aspirarne tutto il contenuto e quindi immerso in una soluzione di ETOH 70% per 5 secondi, in soluzione di denaturazione per 5 secondi e infine in un tampone di lavaggio per 5 secondi. Dopo aver spento la pompa a vuoto, il Vacuum Prep Tool è stato posto nella piastra di annealing: agitando delicatamente il Vacuum Prep Tool nel buffer, è stato consentito il rilascio delle biglie. La piastra contenente gli amplificati è stata quindi incuata a 80 C per 2 minuti per favorire la denaturazione dei filamenti di DNA biotinilati e lasciata raffreddare a temperatura ambiente per permettere l annealing dei primer alla sequenza di DNA bersaglio. La piastra è così pronta per essere inserita nello strumento PyroMark Q96 ID per eseguire la reazione di pirosequenziamento. Fig. 18 Esempio di pirogramma: i picchi rappresentano nucleotidi l emissione di luce e l avvenuta incorporazione dei 48

49 Estrazione di RNA da PBMC L estrazione dell RNA cellulare totale è stata ottenuta mediante utilizzo di TRIzol (Life technologies), una soluzione monofasica di fenolo e guanidina isotiocianato in grado di inibire irreversibilmente le ribonucleasi e di lisare le cellule. La procedura di estrazione utilizzata è descritta di seguito. Il pellet ottenuto dal campione biologico è stato risospeso mediante 1 ml di Trizol e successivamente incubato per 5 minuti a temperatura ambiente per consentire la completa lisi del campione. Dopo aver aggiunto alla sospensione 200 μl di cloroformio, la miscela è stata vortexata per 30 secondi e centrifugata a rpm per 20 minuti a 4 C. Il campione si separa in tre fasi: una fase inferiore di colore rosso-pallido (fenol-cloroformio), un interfase e una fase superiore acquosa incolore, contenente l RNA. Alla fase contenete l RNA sono stati aggiunti 500 μl di isopropanolo; dopo aver incubato il campione per 10 minuti a temperatura ambiente e averlo centrifugato a rpm per 15 minuti a 4 C, è possibile osservare che l RNA precipitato forma un pellet sul fondo della provetta. Dopo aver eliminato il supernatante, il pellet ottenuto è stato sottoposto a due lavaggi, ciascuno dei quali consiste nel risospendere il pellet stesso in 1 ml di etanolo al 75% e centrifugare a rpm per 5 minuti. Dopo aver eliminato il supernatante, il pellet è stato asciugato con un concentratore centrifugo (Vacuum-Dry) per 5 minuti e infine risospeso in 50 μl di acqua sterile RNasi-free e incubato a 60 C per 10 minuti in modo da eliminare le strutture secondarie. Sintesi di cdna La retrotrascrizione permette la sintesi di cdna sulla base di uno stampo di RNA a singolo filamento ad opera dell enzima DNA polimerasi-rna dipendente o trascrittasi inversa, originariamente estratto dai Retrovirus. Il cdna sintetizzato può essere utilizzato direttamente nell amplificazione successiva. La sintesi del cdna è stata ottenuta utilizzando il kit High Capacity cdna Archive Kit (Applied Biosystems, Monza, Italia). La reazione di retrotrascrizione è stata eseguita in un volume finale di 100 μl di cui 50 μl di RNA genomico e 50 μl costituiti dalla miscela di seguito descritta: 49

50 - 4 μl deossiribonucleotidi trifosfato (dntp) 2mM - 10 μl di Buffer 10x - 10 μl di esameri random 10x - 5 μl di enzima - 21 μl di acqua sterile Il profilo termico della reazione di retrotrascrizione è il seguente: - 10 minuti a 25 C - 2 ore a 37 C. Real-Time PCR Il monitoraggio degli amplificati si basa essenzialmente sulla marcatura di primers o sonde con molecole fluorescenti e sfrutta la FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) tra due fluoruri o meccanismi non propriamente FRET, ma che comportano comunque l emissione di fluorescenza e che coinvolgono un fluoruro ed un quencher non fluorescente. Un oligonucleotide, chiamato sonda TaqMan, è designato in maniera tale da potersi appaiare ad una specifica sequenza di templato tra i primer senso e antisenso. La sonda TaqMan presenta un fluoroforo ad alta energia, il Reporter all estremità 5 e una molecola a bassa energia, il Quencher, all estremità 3. Se la sonda è intatta e viene sottoposta ad una fonte di luce, l emissione del Reporter viene assorbita dal Quencher e non si ha alcun segnale di emissione. Durante l amplificazione tuttavia, l attività 5 esonucleasica della DNA polimerasi taglia la sonda appaiata con il target causando un aumento della distanza tra Quencher e Reporter. L incremento di fluorescenza da parte del Reporter viene rilevato ed elaborato da un software specifico sotto forma di Amplification Plot. La linea soglia, il Threshold, rappresenta il punto in cui partono intensità di fluorescenza maggiori rispetto a quelle che rappresentano un rumore di fondo. Il ciclo a cui ciascun campione raggiunge questo livello è chiamato ciclo soglia. Con la Real Time PCR sono possibili determinazioni quantitative sia assolute, utilizzando una curva standard di riferimento, sia relative che evidenziano variazioni del target in rapporto ad un gene housekeeping. 50

51 Le reazioni sono state eseguite in apposite piastre di reazione ottica da 96 pozzetti (Applied Biosystem; Monza, Italia); la miscela di amplificazione era così preparata: - 25 μl di Master Mix Universale 2X (Applied Biosystem, Foster City, CA) - 20 μl di cdna μl di primers senso 300nM μl antisenso 300nM μl 200 nm di sonda - Il volume finale di 50 μl viene raggiunto con l aggiunta di acqua distillata. Le sequenze dei primer e delle sonde utilizzate per l amplificazione di ciascun gene sono riportate in Tabella 1. Lo strumento ABI Prism 7000 (Applied Biosystems, Monza, Italia) è stato impostato per eseguire i seguenti cicli: - 50 C per 2 minuti; - 95 Cper 10 minuti, seguiti da 45 cicli a 95 C per 15 secondi, e 60 C per 1 minuto. La valutazione della quantità di mrna di ciascuna proteina analizzata è stata fatta mediante quantificazione relativa, usando come termine di normalizzazione i livelli di espressione del dell housekeeping gene GAPDH (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase). La quantità dell mrna del gene d interesse, normalizzata al gene di riferimento, è data dalla seguente formula: 2 -ΔC, dove ΔC è la differenza, in cicli soglia, tra il gene considerato e quello di riferimento. 51

52 Tabella 1. Sequenza nucleotidica dei primer e delle sonde utilizzate nella metodica TaqMan per l amplificazione dei geni IFN-indotti (ADAR, MxA, PKR, ISG56). Gene Oligonucleotidi Sequenza PKR SENSO 5 -TGCTACTACGTGTGAGTCCCAAA-3 ANTISENSO 5 -TGATGTATCTGCTGAGAAGTCACCT-3 SONDA 3 TAMRA ISG56 SENSO 5 -TGAAGAAGCTCTAGCCAACAACATGTC-3 ANTISENSO 5 -GAGCTTTATCCACAGAGCCTTTTC-3 SONDA 3 TAMRA ADAR-1 SENSO 5 -CCGGCAGGATGACACAGAC-3 ANTISENSO 5 - GCTTGGCAATATTCCAAGCG -3 SONDA 5 FAM-CACTTCCCAGGGAGCACGGGCA-3 TAMRA MxA SENSO 5 -CTGCCTGGCAGAAAAACTTACC-3 ANTISENSO 5 -CTCTGTTATTCTCTGGTGAGTCTCCTT-3 SONDA 5 FAM-CAACTCTTTAGTGACCAGCACACTCGCTTCT- 5 FAM-ATGTCTTTCGATATGCAGCCAAGTTTTACCG- 5 FAM-CATCACACATATCTGTAAATCTCTGCCCCTGTT- 3 TAMRA GAPDH SENSO 5 -CGACCGTCAAGGCTGAGAAC -3 ANTISENSO 5 -GAGGGATCTCGCTCCTGGA-3 SONDA 5 FAM-CTTGTCATCAATGGAAATCCCATCACCATC-3 TAMRA 52

53 Analisi statistica L analisi statistica è stata eseguita attraverso l uso del software SSPS 17.0 per Windows. Le differenti distribuzioni dei polimorfismi tra i vari gruppi sono state valutate mediante il test del Chi-quadro. Le differenze nell espressione genica dei geni interferon-indotti in funzione dei polimorfismi rs e rs dell IL28B sono state valutate mediante il test di Mann-Whitney. Valori di p inferiori a 0.05 sono stati considerati statisticamente significativi. 53

54 RISULTATI 54

55 Pazienti L analisi degli SNP rs e rs dell IL28B è stata eseguita, mediante una metodica di pirosequenziamento, su campioni di DNA estratto da PBMC raccolti da 170 pazienti con infezione da HCV trattati con PEG-IFN e ribavirina. Le caratteristiche cliniche e demografiche dei pazienti con infezione da HCV sono descritte in tabella 2. Tabella 2. Caratteristiche clinico-demografiche dei pazienti con infezione cronica da virus dell epatite C (HCV). Totale HCVGT*1 HCVGT* 2 HCVGT*3 HCVGT*4 Pazienti (53%) 52 (31%) 12 (7%) 15 (9%) Età: media (range) 54 (20-71) Maschi 92 Femmine 78 Fibrosi - stadio stadio 3-4 N pazienti con carica di HCV RNA > UI**/ml *genotipo di HCV (59%) 31 (41%) 71 (41%) 44 (48%) 22 (41%) 1 (8%) 4 (27%) ** Unità internazionale La popolazione dello studio era costituita da 92 maschi e 78 femmine con un età media di 54 anni. Tutti i pazienti erano di etnia caucasica e presentavano un infezione con diversi genotipi di HCV: 91 pazienti (53%) erano infetti dal genotipo 1, 52 (31%) dal genotipo 2, 12 (7%) con genotipo 3 ed infine 15 (9%) dal genotipo 4. 55

56 Il 41% dei pazienti presentava valori di carica virale plasmatica misurati prima dell inizio della terapia superiori a UI/ml. Tra questi la maggior parte aveva un infezione da HCV genotipo 1. In particolare, 44 pazienti (48%) erano infettati con il genotipo 1 di HCV, 22 (41%) con il genotipo 2, 1 (8%) con il genotipo 3 e 4 (27%) con il genotipo 4. Biopsie epatiche erano disponibili per 76 pazienti di cui 34 sono NR e 42 presentavano una SVR. Uno stadio di fibrosi grave (stadio 3-4) si è riscontrato in 31 pazienti (41%) mentre i restanti 45 soggetti non avevano un quadro clinico di fibrosi o la presentavano con uno grado minore (stadio 0-2). Per quanto riguarda la risposta al trattamento, in accordo con le terapie convenzionali, i pazienti sono stati suddivisi in 2 sottogruppi: un gruppo di 106 pazienti infetti da genotipo1/4 ed un gruppo di 64 pazienti infetti da genotipo2/3. In entrambi i sottogruppi è stata analizzata la rapida risposta virologica (RVR), la risposta virologica sostenuta (SVR) e la percentuale dei non responders (NR). Tabella 3. Frequenza dei genotipi di HCV in relazione alla risposta al trattamento con interferon e ribavirina Totale HCVGT*1/4 HCVGT*2/3 NR (non responder) 70 (41%) 58 (83%) 12 (17%) RVR (Rapid Virological Response) 74 (43%) 28 (38%) 46 (62%) SVR (Sustained Virological 100 (59%) 48(45%) 52 (81%) Response) SVR con CV RNA > UI** al 35 (35%) baseline NR con CV RNA > UI** al 36 (51%) baseline *genotipo di HCV **unità internazionale Su un totale di 74 pazienti (43%) che presentavano una RVR, ossia una risposta rapida al trattamento con PEG-IFN e ribavirina con livelli di HCV RNA non rilevabile dopo la quarta settimana di terapia, 28 soggetti (38%) avevano un infezione da HCV con genotipo1/4 mentre i rimanenti 46 (62%) erano infetti da HCV genotipo2/3. 56

57 La risposta virologica sostenuta (SVR) è stata raggiunta complessivamente in 100 pazienti (59%): 48 (45%) tra i pazienti infettati con il genotipo di HCV 1 o 4 e 52 (80%) tra i pazienti infettati con il genotipo di HCV 2 o 3. I pazienti con livelli di HCV RNA > UI/mL prima dell inizio della terapia antivirale risultavano essere ugualmente rappresentati tra i soggetti che presentavano SVR e i nonresponders. Frequenza dello SNP rs dell IL28B L analisi dello SNP rs dell IL28B è stata eseguita su campioni di DNA estratti da PBMC raccolti da 170 pazienti con infezione da HCV trattati con PEG-IFN e ribavirina. Nella popolazione inclusa nello studio, i genotipi del polimorfismo rs presentano la seguente distribuzione: il 17% (28/170) dei pazienti presenta il genotipo CC, il 69% presenta il genotipo CT (118/170), il 14% (24/170) presenta il genotipo TT, con una frequenza totale dell allele T pari a I risultati indicano che la frequenza di omozigosi per l allele C è maggiore nei pazienti con infezione da genotipo virale 1/4 rispetto a quelli con genotipo virale 2/3 (21% vs 10%, p < 0.05; Test Chi-quadro). Al contrario il genotipo TT dello SNP è maggiormente rappresentato tra i pazienti con genotipo virale 2-3 (21% vs 9%, p < 0.05; Test Chi-quadro) (Fig. 19). 57

58 Frequenza dei genotipi (%) Overall HCVGT1/4 HCVGT2/3 Fig. 19 Frequenza dei genotipi del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) rs dell interleuchina 28B (IL28B) in relazione al genotipo di HCV (HCVGT1/4= genotipo 1 o 4 di HCV; HCVGT2/3= genotipo 2 o 3 di HCV). CC genotipo HCVGT1/4 vs HCVGT2/3; p<0.05 Test Chi-quadro TT genotipo HCVGT2/3 vs HCVGT1/4; p<0.05 Test Chi-quadro Frequenza dello SNP rs dell IL28B I genotipi del polimorfismo rs risultano invece distribuiti come segue: l 8% (14/170) della popolazione ha un genotipo GG, il 44% (75/170) ha genotipo GT, il 48 % (81/170) ha genotipo TT; questi dati confermano quanto descritto in letteratura, ovvero che il genotipo GG è quello meno rappresentato. Nei soggetti con infezione da HCV genotipo 1/4 il genotipo GG aveva frequenza del 6% (6/106), mentre il 44% dei pazienti (47/106) aveva genotipo GT ed il 50% (53/106) genotipo TT. Nel sottogruppo di pazienti con infezione da genotipo 2/3 di HCV le frequenze dei genotipi per l rs dell IL28B erano le seguenti: 12% (8/64) con genotipo GG, 44% (28/64) genotipo GT e 44% ( 28/64) genotipo TT. In questo caso, al contrario di quanto osservato dall analisi dello SNP rs , le differenze osservate nelle frequenze genotipiche per l rs tra i pazienti infettati dal genotipo 1/4 di HCV e i soggetti con HCV 2/3 non sono significative da un punto di vista statistico (Fig. 20). 58

59 Frequenza dei genotipi (%) Overall HCVGT1/4 HCVGT2/3 Fig. 20 Frequenza dei genotipi del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) rs dell interleuchina 28B (IL28B) in relazione al genotipo di HCV (HCVGT1/4= genotipo 1 o 4 di HCV; HCVGT2/3= genotipo 2 o 3 di HCV ). Polimorfismi dell IL28B e risposta al trattamento con PEG-IFN e ribavirina. Successivamente è stata analizzata la relazione tra lo SNP rs dell IL28B e il tipo di risposta al trattamento con PEG-IFN e ribavirina (Fig. 21). Dai risultati si evince che la distribuzione dei genotipi dello SNP rs dell IL28B nei pazienti RVR è del tutto paragonabile a quella osservata per i pazienti con SVR [CC 26% (19/74), CT 62%(46/74) e TT 12% (9/74)]. La frequenza dei genotipi CC, CT e TT per lo SNP rs era rispettivamente il 28% (28/100), 59% (59/100) e 13% (13/100) nei pazienti con SVR. Nei soggetti che non presentavano risposta al trattamento (NR) la distribuzione dei genotipi CC, CT e TT era rispettivamente dello 0%, 85% (59/70) e 15% (11/70). 59

60 Frequenza dei genotipi (%) Genotype proportion (%) Dall analisi della frequenza dei genotipi dell IL28B SNP rs nei pazienti che presentano una SVR o una NR si evince che il doppio allele CC SNP rs è presente esclusivamente nei soggetti che hanno ottenuto una risposta al trattamento antivirale, il che suggerisce che i pazienti HCV-positivi con genotipo CC per lo SNP rs hanno una maggiore probabilità di raggiungere una risposta virologica sostenuta rispetto ai pazienti con genotipo CT o TT (p< con Test Chi-quadro). Parte dello studio è stata dedicata anche all analisi dell associazione tra lo SNP rs e la risposta alla terapia antivirale in relazione al genotipo virale. Da tale analisi è emerso che la frequenza di omozigosi per l allele C dell IL28B SNP rs è maggiore nei pazienti SVR che presentano un infezione da genotipo virale 1/4 rispetto a quelli con infezione da genotipo virale 2/3 (44% vs 12%, p< con Test Chi-quadro). Inoltre il genotipo TT sembra avere una frequenza paragonabile tra i pazienti NR e i soggetti che presentano SVR. In particolare, i pazienti con infezione da HCV genotipo 1/4 avevano una più bassa frequenza (8%) rispetto a quelli con genotipo virale 2/3 (21%) che tuttavia non è significativa da un punto di vista statistico. rs TT CT CC Fig. 21 Frequenza dei genotipi del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) rs dell interleuchina 28B (IL28B) in relazione alla risposta al trattamento. CC genotipo SVR vs NR; p< CC genotipo HCVGT1/4 SVR vs HCVGT2/3 SVR; p< Test Chi-quadro 60

61 Frequenza dei genotipi (%) Genotype proportion (%) Per quanto riguarda la relazione tra il genotipo dello SNP rs e la risposta al trattamento, è stato osservato che i pazienti che rispondono al trattamento e coloro che non rispondono mostrano una diversa distribuzione dei genotipi: in particolare il genotipo TT è significativamente più rappresentato nei pazienti con SVR (30% vs 60% p<0.0005) che nei soggetti NR. Il genotipo TT era anche significativamente più rappresentato nei soggetti con SVR infetti dal genotipo virale 1-4 (70%) rispetto ai soggetti NR infetti dallo stesso genotipo (35%) [ 35% vs 70%, p< ). Lo stesso risultato è emerso dal confronto tra i pazienti con SVR infetti dal genotipo 2/3 (52%) e i NR infettati dallo stesso genotipo virale (8%) [ p<0.005]. Al contrario, il genotipo sfavorevole GG era significativamente meno rappresentato nei pazienti con SVR (4%) se paragonati con pazienti NR (14%) [ p<0.05]. Inoltre si può osservare che il genotipo GG è del tutto assente nei pazienti con SVR con genotipo di HCV 1/4 (Fig. 22 ). rs RVR SVR NR HCVGT1/4 NR HCVGT1/4 SVR HCVGT2/3 NR HCVGT2/3 SVR TT GT GG Fig. 22 Frequenza dei genotipi del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) rs dell interleuchina 28B (IL28B) in relazione alla risposta al trattamento. TT genotipo SVR vs NR; p< TT genotipo HCVGT1/4 SVR vs HCVGT1/4 NR; p< TT genotipo vs HCVGT2/3 SVR vs HCVGT2/3 NR; p<0.005 GG genotipo NR vs SVR; p<0.05 GG genotipo GT2-3NR vs GT2-3SVR; p<0.05 Test Chi-quadro 61

62 Livelli di HCV-RNA Livelli di HCV-RNA I risultati complessivi sono stati confermati anche attraverso l analisi combinata dei genotipi. La combinazione dei genotipi favorevoli CC/TT per gli SNP rs /rs (aplotipo C/T) è rappresentata nel 28% dei pazienti con SVR ed è significativamente più rappresentata nei soggetti con SVR infetti da genotipo 1 o 4 di HCV (44%) rispetto ai pazienti con SVR con genotipo 2 o 3 di HCV (11%). Viceversa, il genotipo sfavorevole rs /rs TT/GG è maggiormente rappresentato nei pazienti NR che in quelli che raggiungono la SVR (16% vs 4%; P < 0.005). SNP rs /rs dell IL28B e livelli di carica virale Successivamente è stata analizzata l influenza dello SNP rs dell IL28B sui livelli di carica di HCV misurati prima dell inizio della terapia antivirale. In questo caso non è stata trovata nessuna associazione tra i livelli di carica virale ed il genotipo degli SNP. Infatti si possono osservare valori paragonabili di carica virale sia negli overall che nei sottogruppi distinti in base al genotipo virale (Fig. 23a, b). In particolare, per lo SNP rs i livelli di carica maggiore sono stati osservati nei pazienti con genotipo CC con genotipo 1 e 4 di HCV. Al contrario valori di carica di HCV paragonabili o inferiori si riscontrano nei pazienti HCV positivi con genotipo CT o TT. Inoltre nei soggetti con HCV genotipo 2/3 si osservano valori di carica paragonabile tra i pazienti con genotipo TT o CT. Per quanto riguarda lo SNP valori di carica superiore si evidenziano negli eterozigoti GT indipendentemente dal genotipo virale. Fig. 23a frequenza del genotipo rs in rapporto ai livelli di carica virale Fig. 23b frequenza del genotipo rs in rapporto ai livelli di carica virale 62