Autoanticorpi specifici e profili autoanticorpali nelle dermatiti bollose

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1 Autoanticorpi specifici e profili autoanticorpali nelle dermatiti bollose Marilina Tampoia Paestum, 8 giugno 2011

2 Dermatiti bollose autoimmuni Gruppo di patologie autoimmuni organo-specifiche, caratterizzate dalla presenza di autoanticorpi tessutali e circolanti. Antigeni target Meccanismo patogenetico comune anticorpi + antigeni target

3 Classificazione clinica sede del danno e target molecolare Gruppo Pemfigo (bolla intraepidermica) Autoanticorpi sono diretti contro proteine di adesione tra i cheratinociti epidermici e/o delle mucose Lesioni acantolitiche sono intraepidermiche Pemfigo Volgare (PV), Pemfigo Foliaceo (PF), Pemfigo Paraneoplastico (PPN), Pemfigo IgA. Gruppo Pemfigoide (bolla subepidermica) Autoanticorpi contro proteine di adesione a livello della giunzione dermo- epidermica Lesione è subepidermica giunzionale Pemfigoide Bolloso (BP), Pemfigoide gestazionis (PG), Pemfigoide cicatriziale (PC), Epidermolisi Bollosa (EB), Dermatite Erpetiforme During (DH).

4 Autoimmun Rev Aug 14 l immunofluorescenza diretta rappresenta il gold standard metodi diagnostici sensibili e specifici permettono la diagnosi sierologica in circa il 90% dei pazienti. Schmidt E, Zillikens D

5 Pemphigus diseases DESMOSOMA unità funzionale che garantisce l integrità dell epidermide e assicura la coesione tra cheratinociti adiacenti Ultrastruttura del desmosoma Modello molecolare del desmosoma

6 Struttura molecolare degli antigeni del pemfigo E posibile distinguere un dominio extracellulare (EC), composto da quattro molecole di caderina ed un dominio intracitoplasmatico (ICS) caderinaspecifico. IA, dominio di ancoraggio intracellulare, IPL, legame intracellulare ricco di prolina, DTD, dominio terminale desmogleina-specifico Amagai M, 2010

7 se dapprima anticopi circolanti sono stati ricercati mediante l immunofluorescenza indiretta (sezioni di esofago di scimmia) e Salt Skin Split oggi, utilizzando epitopi ricombinanti degli antigeni target, sono disponibili in commercio sistemi ELISA che ricercano anticorpi diretti verso specifici epitopi, con elevato valore diagnostico Schmidt E, Zillikens D, 2010

8 Sempre più numerosi sono i report della letteratura che dimostrano l accuratezza diagnostica dei metodi ELISA per la diagnosi di pemfigo volgare.

9 Diagnosi sierologica del pemfigo mediante ELISA: profilo anticorpale permette di differenziare subset di malattia PF solo Ab anti-dsg1 PV mucosale solo Ab anti-dsg3 PV mucocutaneo Ab anti-dsg1 + Dsg3 Tre subset di malattia in relazione al profilo autoanticorpale Amagai M, 2010

10 Epitopi patogenetici degli autoanticorpi anti desmogleine Le DsG sono sintetizzate come precursori inattivi, proproteine, nel reticolo endoplasmatico ed assemblate a DsG mature nei desmosomi. Anticorpi monoclonali patogenetici legano la Dsg1 matura piuttosto che il precursore. Anticorpi monoclonali non patogenetici, legano il precursore della Dsg1. Altri anticorpi monoclonali non patogenetici, riconoscono la porzione centrale della Dsg1, legando entrambi. L anticorpo patogenetico lega le regioni dell interfaccia di adesione delle Dsg1. Yokouchi M, 2009

11 La maggior parte dei sieri di pazienti con PF e PV mostra una maggiore reattività verso le forme mature di Dsg1 che non verso i precursori. Yokouchi M, 2009

12 Il trattamento con furina aumenta il rapporto tra DsG matura/ proproteina, incrementando il legame tra anticorpi monoclonali patogenetici anti-dsg e siero del paziente. a. Dsg3 purificata ricombinante è stata trattata con enzima furina incrementando il passaggio della proproteina di Dsg3 nella sua isoforma b. Il prettrattamento utilizzato nell allestimento di kit commerciali Dsg3 ELISA incrementa il legame di mabs (P1, P2, P3, e AK23), patogenetici del PV e non patogenetici (NP2) con gli epitopi amino terminali. c. 85 sieri di pazienti con PVsono stati testati mediante un kit ELISA contenente una miscela di forme mature e precursori di Dsg3 confrontato con un kit prodotto con solo antigene DsG3 maturo.

13 Schmidt E, 2009

14 Il titolo anticorpale Dsg1 e Dsg3 correla con la gravità di malattia Cheng SW et al. Monitoring disease activity in pemphigus with enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant desmogleins 1 and 3. Br J Dematol Kwon EJ et al. Anti-desmoglein IgG autoantibodies in patients with pemphigus in remission. JEADV Il titolo anticorpale Dsg1 e Dsg3 correla con l attività di malattia (si riduce in corso di terapia utile al follow up terapeutico) Cheng SW et al. Monitoring disease activity in pemphigus with enzyme-linked immunosorbent assay using recombinant desmogleins 1 and 3. Br J Dematol Kwon EJ et al. Anti-desmoglein IgG autoantibodies in patients with pemphigus in remission. JEADV Il titolo anticorpale Dsg1 correla con l evoluzione delle lesioni cutanee ed è significativamente predittivo di recidiva cutanea Abasq C et al. ELISA testing of anti-desmoglein 1 and 3 antibodies in the management of pemphigus. Arch Dermatol. 2009

15 Case report. Paziente affetto da lesione bollose sierologicamente negativo agli anticopri anti-dsg 3 e Dsg 1 Donna di 72 anni operata di pregresso carcinoma della mammella. La diagnosi di pemfigo è stata fatta sulla base di caratteristiche cliniche ed istologiche. L immunofluorescena indiretta ha evidenziato un debole positività anti-sostanza intercellulare, con pattern di fluorescenza finemente granulare. Mediante test ELISA che utilizzano antigeni umani ricombinanti la ricerca di autoanticorpi anti-dsg 1 e 3, è risultata negativa. Questo dato suggerisce che gli antigeni target, responsabili dell acantolisi, possano essere diversi dalle desmogleine. Bolle ed erosioni della mucosa buccale Acantolisi delle mucose orali Immunofluorescenza indiretta

16 Quadro clinico ed immunopatologico del pemfigo paraneoplastico. Pemfigo Paraneoplastico (PNP) è una rara malattia autoimmune bollosa, mortale. Il quadro clinico è spesso polimorfo e le bolle possono essere assenti. Gli autoanticorpi sono diretti contro antigeni bersaglio, tra cui le plakine e le desmogleine. PNP ha un alto tasso di mortalità che non dipende direttamente dalla malignità della neoplasia. In associazione alla neoplasia, una severa stomatite e la presenza di autoanticorpi diretti contro la periplakina e l envoplakina sono caratteristici di PNP. Diagnostic criteria are proposed Zimmermann J, 2010

17 Report pubblicati sullo sviluppo di test diagnostici in ELISA pe la ricerca di autoanticorpi anti-envoplakina e periplakina. Detection of anti-envoplakin and anti-periplakin autoantibodies by ELISA in patients with paraneoplastic pemphigus. Huang Y, Li J, Zhu X. Arch Dermatol Res Oct;301(10): Development of ELISA for the specific determination of autoantibodies against envoplakin and periplakin in paraneoplastic pemphigus. Probst C, Schlumberger W, Stöcker W, Recke A, Schmidt E, Hashimoto T, Zhu XJ, Zillikens D, Komorowski L. Clin Chim Acta Dec;410(1-2):13-8.

18 Manifestazioni cliniche e neoplasie associate in 14 casi di PNP Livelli anticorpali in pazienti affetti da PNP Jing LI, 2009 Chin Med J.

19 Pemphigoid diseases EMIDESMOSOMA strutture specializzate degli epiteli stratificati coinvolte nell ancoraggio della cellula alla sottostante BMZ Ultrastruttura emidesmosoma Modello molecolare emidesmosoma

20 BPAg2 (BP180kDa) proteina transmembrana con una porzione NH 2 - citoplasma del cheratinocita basale ed una porzione COOH- extracellulare caratterizzata da alternanza di domini collagenici (C) e non collagenici (NC) Il 16 th domino non-collagenico (NC16A NC16A), suddiviso in sei frammenti (NC16 A1-A5) A5) è il target maggiore degli autoanticorpi nel PB e nell PG Zillikens D. Keio J Med, 2002

21 Revisione sistematica sull accuratezza diagnostica del test anti-bp180 (Met.EIA) la ricerca degli articoli è stata condotta su PubMed considerando un arco di tempo di 13 anni ( ) ed ha prodotto la selezione iniziale di 83 lavori eliminando review e casi clinici, selezionando solo dati relativi a test diagnostici eliminando review e casi clinici, selezionando solo dati relativi a test diagnostici Eseguiti con metodo EIA, abbiamo ottenuto 12 articoli

22 Numero di soggetti Autore, anno casi controllo sani Tampoia, Di Zenzo, Ishiura, antigene kit TP FP TN FN human recombinant human recombinant human recombinant MBL MBL MBL Atzori, recombinant home made Feng, recombinant home made Sitaru, recombinant home made Yoshida, recombinant home made D Agosto, recombinant MBL Thoma- Uszynski, recombinant in baculovirus home made Sakuma, recombinant MBL Kobayashi, Zillikens, bacteric recombinant estrattiva murina home made home made

23 Metanalisi sull accuratezza diagnostica del test anti-bp180 (Met.EIA)

24 Curva ROC conclusiva

25 BPAg1 (BP230kDa) Sybille Thoma-Uszynski, 2004

26 Entrambi i metodi mostrano una elevata specificità per il PB, gli autoanticorpi anti-bp180 sono più sensibili degli anti-bp230.

27 sensibilità diagnostica RIMeL IJLaM, 2011 in press

28 Correlazione tra score di attività di malattia e livelli di autoanticorpi anti-bp180 e anti-bp230 score di attività di malattia score vs Ab anti-bp180 rho =0.83 p < score di attività di malattia score vs Ab anti-bp230 rho =0.39 p = Ab anti-bp180 Ab anti-bp230 I livelli sierici di autoanticorpi anti-bp180 hanno mostrato una più forte correlazione con l attività di malattia (P <0,0001; rho = 0,83) rispetto ai livelli sierici di autoanticorpi anti-bp230 (P =0,01; rho =0,39)

29 marcatori predittivi di severità di malattia Considerando gli autoanticorpi anti-bp180 e anti-bp230 come variabili dicotomiche (positivo/negativo) è stata osservata una significativa associazione con la severità di malattia per la doppia positività agli autoanticorpi (P =0,0003) e con un R2 di 0,60. marcatore predittivo di remissione clinica in 25 pz che hanno completato il follow-up

30 Proteine collagene della cute I principali collageni presenti nella cute umana sono: -collagene tipo I e III, l 80% e il 10% del collagene totale, rispettivamente. -collagene di tipo V, meno del 5% del collagene totale, presente nel derma, -collagene tipo IV, localizzato entro la giunzione dermo-epidermica e nella membrana basale dei vasi. -collagene tipo VII, il maggiore se non esclusivo componente delle fibrille di ancoraggio.

31 Struttura primaria del collagene VII Collagene VII è un omotrimero, costituito da tre subunità identiche polipeptidiche, α1(vii), costituito da dominio centrale di 145 kd,affiancato da un grande dominio di ~ 145 kd non collagene, NC1, aminoterminale e da un più piccolo dominio di ~ 20 kd non collagene, NC2. carbossi-terminale.

32 Fisiologia del legame del collagene VII al collagene IV nella giunzione dermo-epidermica Il dominio NC-1 di collagene VII lega il dominio C del collagene IV, la laminina 5 e la laminina 6. Le fibrille di ancoraggio intrappolano fibre di collagene VII, stabilizzando il legame della lamina densa della membrana basale dermoepidermico al derma sottostante.

33 anchorless del collagene VII nei cheratinociti normali e affetti da Epidermolisi Bollosa. espressione troncata espressione assente Nella cute normale le interazioni con altre componenti della matrice extracellulare, sono mediate dall attivazione di segnale dell α6β4 integrina al dominio NC1 del collagene VII.

34 Epidermolisi bollosa L epidermolisi bollosa (EB) è un gruppo di patologie congenite ed acquisite, caratterizzate dalla presenza di lesioni bollose della cute e delle membrane mucosali Si conoscono quattro principali tipi di EB, causate da mutazioni in 13 differenti geni, che sono: EB simplex (EBS), junctional EB (JEB), dystrophic EB (DEB), and Kindler syndrome. In aggiunta alle forme congenite vi è una forma acquisita, conosciuta come EB acquisita (EBA). Pazienti affetti da EBA presentano autoanticorpi IgG che riconoscono come antigene il collagene tipo VII, maggiore componente delle fibrille di ancoraggio localizzate nella giunzione dermo-epidermica della cute.

35 Vi sono criteri clinici diagnostici di EB, ma non vi sono segni clinici specifici per un determinato tipo di EB Per stabilire la diagnosi di tipo: una biopsia su cute fresca prelevata da una bolla di nuova formazione una microscopia elettronica

36 SCOPO DEL LAVORO 1. valutare la prevalenza degli autoanticorpi anti-cute classici in pazienti affetti da Epidermolisi Bollosa Congenita 2. valutare l accuratezza diagnostica di un nuovo test anticollagene VII nella diagnosi di EB 3. rapportare le positività riscontrate a parametri biologici e clinici (in progress).

37 PAZIENTI 34 pazienti affetti da Epidermolisi Bollosa, arruolati consecutivamente presso la Dermatologia Pediatrica del Policlinico di Bari, 13 M e 21 F, eta anagrafica media 18.6 anni(range 1-56) Distribuzione in rapporto alla EB n DEB (2 pazienti con DEB- Barth) 22 EBS ( 4 pazienti EBS-DM) 12 Totali 34

38 CONTROLLI 65 soggetti, 22 M e 43F, età anagrafica: media 64 anni (range 35-90) Distribuzione dei casi controllo n sani 20 Pemfigoide bolloso 21 Pemfigo volgare 20 Lupus eritematoso Discoide 4 Totale 65

39 Autoanticorpi e coating antigenico Autoanticorpi anti-bp180: frammento NC16A, proteina umana ricombinante, purificata Autoanticorpi anti-bp230: frammento N e C terminale, proteine umane ricombinante, purificato Autoanticorpi anti-collagene VII : frammenti NC1 e NC2, proteine umane ricombinante, NC1 e NC2 I kit per la ricerca di autoanticorpi anti-collagene VII prodotti da MBL, Japan, sono stati gentilmente forniti da Dasit.

40 Caratteristiche sierologiche dei pazienti e controlli casi EB (n.34) controlli PB (n.20) controlli PV (n.21) sani (n.20) n pz con Ab anti-cute positivi (IFI) 2/34 10/20 18/21 0/20 concentrazione media Ab anti-bp180, UA/mL concentrazione media Ab anti-bp230, UA/mL concentrazione media Ab anti-collagene VII, UA/mL

41 Livelli di autoanticorpi anti-collagene VII nei pazienti e nei controlli Ab anti-collagenevii Livelli autoanticorpi anti-collagene VII, UI/mL 0 1 controlli pazienti

42 Determinazione del cut-off mediante lo studio ROC 100 Ab anti-collagenevii 80 Sensitivity AUC CI to Specificity cut-off >4.5 sensibilità 50% (CI ) specificità 95% (CI )

43 Profilo autoanticorpale in pazienti affetti da EB Ab anti-collagene VII Ab anti-bp180 e anti-bp230 EBS 0 3 (25%) EBD 17(77%) 18(82%) La prevalenza di autoanticorpi è maggiore nelle forme EBD, sia per la presenza di autoanticorpi anti-collagene VII (specifici di malattia) sia per altri autoanticorpi anti-cute (chi-quadro, P< ; OR 79 95%CI ).

44 Correlazione con altri autoanticorpi Ab anti-bp180 Ab anti-bp Coll VII 40 Coll VII BP BP230 R R Slope P < Slope P < I livelli di autoanticorpi anti-collagene VII correlano con autoanticorpi anti-bp180 e BP230.

45 Autoanticorpi anti-collagene VII come marcatore sensibile e specifico di DEB 77% dei pazienti affetti da DEB è risultato positivo al test, 50% a titolo elevato (5 volte il valore di cut-off) nessuno dei pazienti con EBS è risultato positivo al test la presenza di autoanticorpi si associa a forme più gravi di EB, permettendo di identificare una Epidermolisi Bollosa Autoimmune

46 La diagnostica autoanticorpale delle dermatiti bollose ha subito negli ultimi decenni un importante impulso. Vi sono due aspetti importanti: 1.elevato valore diagnostico dei test ELISA Landscape viewing 2.individuazione di epitopi antigenici coinvolti nei meccanismi patogenetici di malattia

47 Landscape viewing I test immunoenzimatici, possono rappresentare l unico metodo da eseguire per la diagnosi e il monitoraggio clinico dei pazienti. La ricerca contestuale di più autoanticorpi, profilo autoanticorpale, può essere utile sia nella fase diagnostica ( maggiore sensibilità) che nella valutazione prognostica. Il dosaggio quantitativo autoanticorpale è utile nel monitoraggio clinico dei pazienti affetti da dermatite bollosa autoimmune e correla direttamente con lo score di attività e severità di malattia.

48 Studio in progress:correlare il titolo autoanticorpali alla gravità di malattia, mediante il BEBS. Moss C, 2009

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53 Differente profilo di reattività autoanticorpale verso BP180 nelle pazienti affette da PG sieri di pazienti con PG reagiscono con epitopi differenti dal NC 16, ma solo un caso indagato è risultato positivo a due epitopi intracellulari e negativo al NC16A. anticorpi diretti contro epitopi intracellulari compaiono precocemente nel decorso clinico Di Zenzo G, 2007

54 Sensitivity and specificity of the NC16A-specific IgE ELISA

55 Livelli di anti-nc16a-ige ed IgG specifiche riflettono l'attività clinica della malattia non sembra esserci differenza nel follow up del paziente tra isotipo autoanticorpale.

56 BPAg1 (BP230kDa) Sybille Thoma-Uszynski, 2004

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59 25 pazienti che hanno completato il follow-up,12 non hanno presentato remissione clinica di malattia entro 6 mesi L OR degli autoanticorpi al momento dell arruolamento verso la mancata remissione clinica di malattia, ha evidenziato che il maggior rischio era associato alla positività per gli autoanticorpi anti-bp230 (OR 16,5; P =0,004), rispetto a quella per gli anti-bp180 (OR 2,2; P ns) e per gli autoanticorpi anti-cute in IFI (OR 6,6; P =0,04). Considerando gli elevati titoli (>27 UA/mL) di anti-bp230 e anti-bp180, si è visto che la significatività di tale rischio aumenta per gli anti-bp180 (OR 6,7; P =0,04). Conclusioni:.

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61 Vi sono criteri clinici diagnostici di EB, ma non vi sono segni clinici specifici per un determinato tipo di EB 1.tutti i quattro principali tipi di EB presentano fragilità della pelle, che si manifesta con vescicole e / o erosioni spontanee o per piccoli traumi 2.il segno positivo di Nikolsky (formazione di vesciche sulla pelle sana dopo sfregamento) è comune a tutti i tipi di EB. ma non vi sono segni clinici specifici per un determinato tipo di EB 3.nei pazienti giovani e nei neonati, l estensione e la severità delle bolle e delle cicatrici può non essere definita o sufficientemente significativa ad identificare un tipo di EB. 4.l interessamento delle mucose e delle unghie e la presenza o assenza di milia potrebbero non essere discriminanti. 5.le alterazioni post-infiammatorie, cosi come quelle viste nella EBS, Dowling-Meara (EBS- DM) sono spesso confuse con cicatrici o chiazze di pigmentazione. 6.le stesse cicatrici possono presentarsi in EB simplex e junctional EB come il risultato di erosioni infettive o graffi, che spesso danneggiano la superficie esposta. 7. assenza congenita di cute può essere presente in ciascuna delle tre principali forme di EB (EBS, JEB, DEB) e non essere un fattore discriminante.

62 Alcuni aspetti clinici che potrebbero essere specifici di tipo di EB sono: Erosioni corneali, restringimenti esofagei e coinvolgimento degli annessi suggeriscono la diagnosi di DEB. Coinvolgimento dello smalto dei denti suggeriscono la JEB. Cicatrici e milia delle mani e dei piedi in molti casi suggeriscono una DEB piuttosto che una EBS. Pseudosindattilia (deformità a guanto) causata da cicatrici delle mani e dei piedi in bambini più grandi ed adulti usualmente suggerisce una DEB. Per stabilire la diagnosi di tipo è necessario eseguire una biopsia su cute fresca prelevata da una bolla di nuova formazione oppure la microscopia elettronica

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