CANCEROGENESI CHIMICA

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1 NEOPLASIA è definita come una crescita di tessuto ereditariamente alterata e relativamente autonoma. Punti critici: a) aspetti ereditabili a livello di cellule somatiche o germinali; b) relativa autonomia delle cellule neoplastiche che riflette la regolazione anomala dell espressione genetica, insita nella cellula neoplastica o che avviene come risposta a stimoli ambientali.

2 Le neoplasie possono essere benigne o maligne. La distinzione è relativa alla possibile crescita metastatica. METASTASI crescita secondaria di cellule dalla neoplasia primaria. Il termine cancro definisce una neoplasia maligna. Il termine tumore descrive lesioni che occupano uno spazio e che possono anche non essere neoplastiche.

3 NOMENCLATURA benigni suffisso -oma maligni suffisso -sarcoma La neoplasia maligna che deriva da tessuti di origine ectodermica o epidermica (epiteli) è chiamata carcinoma, con la descrizione del tessuto (e.g. epatocarcinoma, adenocarcinoma gastrico)

4 Un cancerogeno è, in genere, un agente che causa o induce neoplasia o, più appropriatamente: E un agente che somministrato ad animali precedentemente non trattati porta ad un aumento statisticamente significativo dell incidenza di neoplasie di uno o piu tipi istogenetici, comparata con l incidenza in appropriati animali non trattati.

5 La prima descrizione di induzione di tumori cutanei per applicazione di catrame alla cute risale al 1915 (Giappone). CANCEROGENESI DA SOSTANZE CHIMICHE ORGANICHE Il primo idrocarburo policiclico aromatico (IPA) di sintesi fu prodotto nel 1930 (dibenzo[a,h]antracene) e si dimostrò un potente cancerogeno cutaneo (topo).

6 CANCEROGENESI DA SOSTANZE CHIMICHE ORGANICHE Nel 1932 fu isolato dal catrame il benzo[a]pirene. La potenza cancerogena degli IPA è variabile. Ad esempio, l isomero dibenzo[a,c]antracene è poco attivo al contrario del dibenzo[a,h]antracene. I più potenti sono il 3-metilcolantrene e il 7,12- dimetilbenzo[a]antracene. Il benzo[e]pirene è inattivo nell induzione del cancro cutaneo, ma può iniziare il processo.

7 IPA

8 CANCEROGENESI DA SOSTANZE CHIMICHE ORGANICHE Nel 1935 fu dimostrato che il colorante azoico o- aminoazotoluene, somministrato con la dieta, induceva neoplasie epatiche. I coloranti azoici, a differenza degli IPA, non agiscono nella sede di contatto, ma in una sede remota, come ad esempio il fegato. Alcune amine aromatiche sono potenti cancerogeni.

9 CANCEROGENESI DA SOSTANZE CHIMICHE ORGANICHE La nitrosamina NNK [4-(metilnitrosamino-)-1-(3- piridil)-1-butanone] è prodotto dalla nicotina durante la combustione ed è un potente cancerogeno. Altro potente cancerogeno per il fegato è l aflatossina B1, prodotta da una specie di Aspergillus flavus (un fungo). E uno dei più potenti cancerogeni epatici noti.

10 AFLATOSSINE (struttura generale)

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12 Aspergillus Flavus

13 CANCEROGENESI DA SOSTANZE CHIMICHE INORGANICHE Alcuni metalli sono noti come cancerogeni: As (raffinerie di Cu, pesticidi, impianti chimici, acqua, fumo di sigaretta) è un noto cancerogeno per polmone, cute, fegato e sangue (linfomi, leucemie). Cd (raffinerie di Cd, saldatura) è un sospetto cancerogeno per il polmone e la prostata. Cr (raffinerie di Cr, cromatura, pigmenti) è un cancerogeno per polmone e tratto digestivo.

14 CANCEROGENESI DA SOSTANZE CHIMICHE INORGANICHE Ni (raffinerie di Ni, galvaniche) è cancerogeno per polmone, nasofaringe, stomaco e rene. CANCEROGENESI DA PLASTICHE E FIBRE L impianto di film plastici o metallici causa sarcoma nella sede di impianto in alcuni roditori (ratti e topi), ma non in altri (cavie). La natura chimica dell impianto non è critica.

15 CANCEROGENESI DA PLASTICHE E FIBRE Gli impianti creerebbero le condizioni per attivare le cellule preneoplastiche già esistenti. Tumori pleurici da asbesto. CANCEROGENESI ORMONALE CANCEROGENESI DA MISCELE DI CANCEROGENI

16 CANGEROGENESI DA DIETA assunzione eccessiva di calorie assunzione eccessiva di alcol alimenti contaminati con aflatossina B1 Una carenza di gruppi metilati può indurre il cancro del fegato.

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19 MECCANISMI I cancerogeni necessitano generalmente di attivazione metabolica. I metaboliti intermedi tra il precancerogeno e il cancerogeno sono detti cancerogeni prossimi. Il cancerogeno finale è la forma che effettivamente interagisce coi target cellulari e causa probabilmente la trasformazione neoplastica.

20 MECCANISMI Per quanto riguarda gli IPA, è determinante l ossidazione dei carboni nella regione della baia che è la regione stericamente posteriore formata dall anello benzenico angolare. E stato suggerito che l epossidazione in questa zona possa portare al cancerogeno finale.

21 bay k region benzo[a]pirene bay k region L region benzo[a]antracene

22 MECCANISMI Mutagenesi e cancerogenesi Il DNA è il bersaglio per le alterazioni ereditarie e ciò è evidente in soggetti con un difetto nella possibilità di riparazione del DNA danneggiato (e.g. xeroderma pigmentosum). Malattia autosomica recessiva in cui i pazienti sono molto sensibili alle radiazioni UV e hanno un difetto di riparazione del DNA danneggiato

23 MECCANISMI Mutagenesi e cancerogenesi L induzione di una mutazione è dovuta ad una alterazione chimica o fisica nella struttura del DNA che esita in una non perfetta replicazione di una particolare regione del genoma. Il processo di mutagenesi consiste in alterazioni strutturali del DNA, in una proliferazione cellulare che fissa il danno del DNA e nella riparazione che o ripara direttamente le basi o esita nella rimozione di più lunghi segmenti di DNA.

24 MECCANISMI Mutagenesi e cancerogenesi Composti elettrofili possono interagire coi gruppi -N dell anello, con gruppi aminici esaciclici, con -O carbonilico e coi fosfodiesteri. Ciò porta a prodotti di alchilazione che sono derivati covalenti delle specie reattive col DNA. Agenti alchilanti diretti inducono preferenzialmente legami con centri altamenti nucleofili come la posizione N 7 della guanina.

25 MECCANISMI Mutagenesi e cancerogenesi Specie meno reattive reagiscono con gli ossigeni nucleofili. La posizione di un addotto del DNA e le proprietà chimiche e fisiche mostrano il tipo di mutazione indotta. Mutazioni puntiformi, mutazioni a slittamento di lettura, aberrazioni cromosomiche, aneuploidie e poliploidizzazioni possono essere indotte con vari gradi di specificità, in parte dose-dipendente.

26 DEFINIZIONI: MECCANISMI aneuploidia condizione nella quale un nucleo somatico o gametico non contiene un multiplo esatto di un set aploide di cromosomi (è il contrario della euplodia). aploidia assetto cromosomico costituito sia da un singolo cromosoma (batteri, virus), sia da cromosomi multipli non omologhi (gameti degli eucarioti). Nell uomo, il numero aploide dei cromosomi è 23.

27 RIPARAZIONE DEL DNA E CHIMICA Persistenza di addotti del DNA e riparazione CANCEROGENESI L estensione con cui si formano addotti del DNA dipende dal metabolismo e dalla reattività del metabolita finale. La persistenza dell addotto dipende dalle capacità di riparare le alterazioni strutturali. Meccanismi di riparazione del DNA La reazione del DNA con specie chimiche reattive producono addotti con le basi, gli zuccheri e i fosfati.

28 RIPARAZIONE DEL DNA E CHIMICA CANCEROGENESI Sostanze chimiche reattive bifunzionali possono indurre legami crociati dei filamenti di DNA mediante una reazione con due basi opposte. Altri cambiamenti strutturali, quali la dimerizzazione della pirimidina, sono specifici delle radiazioni UV, mentre rotture del doppio filamento sono più comuni con le radiazioni ionizzanti. Più di 100 gene sono dedicati alla riparazione del DNA.

29 RIPARAZIONE DEL DNA E CANCEROGENESI CHIMICA Tipiche possibilità di riparazione del DNA: 1. Diretto annullamento del danno alchiltransferasi 2. Riparazione per taglio della base glicosilasi, endonucleasi apurinica/apirimidinica

30 RIPARAZIONE DEL DNA E CANCEROGENESI CHIMICA 3. Riparazione per taglio del nucleotide riparazione del dimero pirimidinico riparazione dell addotto ingombrante 4. Ricombinazione: riparazione post-replicazione 5. Riparazione di accoppiamento errato riparazione della deaminazione della 5-metilcitosina

31 RIPARAZIONE DEL DNA E CHIMICA Sono possibili 2 risposte: CANCEROGENESI a) meccanismo di riparazione (rimozione del DNA danneggiato) b) meccanismo di tolleranza (il danno viene ingannato e non viene fissato ) Dopo la rimozione, le DNA-polimerasi sintetizzano del DNA complementare per chiudere il buco nel filamento e le ligasi completano la formazione del doppio filamento.

32 LA PATOGENESI DELLA NEOPLASIA Iniziazione Il processo di iniziazione richiede uno o più cicli di divisione cellulare per fissare il processo. Una delle caratteristiche è la irreversibilità, nel senso che il genotipo e/o il fenotipo della cellula iniziata è stabilito al momento dell iniziazione ; non tutte le cellule iniziate sopravvivono a causa di processi di apoptosi.

33 Necrosi rigonfiamento cellulare rottura cellulare disintegrazione nucleare diffusione di cellule infiammatorie Apoptosi restringimento cellulare frammentazione nucleare formazione di corpi apoptotici assenza di infiammazione

34 LA PATOGENESI DELLA NEOPLASIA Promozione Numerose sostanze chimiche indicono promozione. Al contrario delle sostanze inizianti, non vi sono evidenze di una diretta interazione col DNA o che sia richiesto il loro metabolismo. La caratteristica distintiva è la reversibilità. La repressione di lesioni preneoplastiche dopo rimozione dell agente promovente è dovuta all apoptosi.

35 LA PATOGENESI DELLA NEOPLASIA Promozione Altra caratteristica è la ridifferenziazione rimodellamento. Ancora è la suscettibilità alla modulazione da parte di fattori fisiologici: età, sesso, fattori ormonali. La curva dose-risposta è sigmoide, quindi con una soglia e un effetto massimo. o

36 LA PATOGENESI DELLA NEOPLASIA Promozione La soglia è conseguenza della natura reversibile. L effetto massimo è dovuto alla saturazione dei legami e/o alla promozione di tutte le cellule iniziate. La potenza relativa di un agente promovente può essere determinata in funzione della sua abilità a indurre crescita clonale delle cellule iniziate.

37 LA PATOGENESI DELLA NEOPLASIA Progressione La caratteristica della progressione maligna (velocità di crescita, invasività, frequenza delle metastasi, risposta ormonale, caratteristiche morfologiche) varia indipendentemente dagli sviluppi della malattia. Sua caratteristica è l irreversibilità. Le lesioni pre-maligne, nella fase di progressione, accadono stocasticamente.

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39 MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI DEGLI STADI DELLA CANCEROGENESI Iniziazione Sono fondamentali 3 processi: 1. Metabolismo 2. Riparazione del DNA 3. Proliferazione cellulare

40 MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI DEGLI STADI DELLA CANCEROGENESI Iniziazione Si possono osservare: 1. Semplici mutazioni (transizioni, transversioni, piccole delezioni) coinvolgenti il genoma cellulare; 2. In alcune specie o tessuti, mutazioni puntiformi da protooncogeni e/o potenziali oncogeni cellulari;

41 MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI DEGLI STADI DELLA CANCEROGENESI Iniziazione 3. Mutazioni nei geni delle vie di transduzione del segnale che possono esitare in un fenotipo alterato.

42 MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI DEGLI STADI DELLA CANCEROGENESI Promozione Gli agenti promoventi possono indurre i loro effetti per la loro abilità ad alterare l espressione genica. Turbano la via dei segnali di transduzione. Il meccanismo di alterazione dell espressione genica può essere mediato da recettori specifici.

43 MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI DEGLI STADI DELLA CANCEROGENESI Promozione Si possono osservare: 1. Amplificazioni reversibili o repressione dell espressione genica mediata da recettori specifici per lo specifico agente promovente; 2. Inibizione dell apoptosi da parte dell agente promovente; 3. Non alterazioni strutturali dirette del DNA per azione diretta o dopo metabolismo dell agente promovente.

44 MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI DEGLI STADI DELLA CANCEROGENESI Progressione Generalmente si sviluppa da cellule in fase di promozione, ma può direttamente svilupparsi da cellule normali, come risultato di una dose elevata, citotossica, di un agente cancerogeno completo, capace cioè di indurre iniziazione e progressione. Cellule in stato di progressione possono evolvere con caratteristiche di invasività, crescita metastatica e anapalsia.

45 MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI DEGLI STADI DELLA CANCEROGENESI Progressione Anaplasia: processo o stato di una neoplasia caratterizzato da perdita delle normali differenziazioni cellulari, organizzazioni tissutali e funzioni.

46 MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI DEGLI STADI DELLA CANCEROGENESI Progressione Si possono osservare: 1. Alterazioni genetiche complesse risultanti da una evoluzione di instabilità cariotipica (translocazione cromosomica, delezione, amplificazione genica, ricombinazione); 2. Cambiamenti irreversibili nell espressione genica, inclusa quella fetale, alterata espressione genica dei

47 MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI DEGLI STADI DELLA CANCEROGENESI Progressione complessi di istocompatibilità maggiore e produzione ormonale ectopica; 3. Selezione di cellule neoplastiche per una crescita ottimale in risposta all ambiente cellulare, inclusa l evoluzione dell instabilità cariotipica.

48 MECCANISMI CELLULARI E MOLECOLARI DEGLI STADI DELLA CANCEROGENESI Progressione La caratteristica molecolare critica dello stadio di progressione è l instabilità cariotipica. I meccanismi di tale instabilità sono molti e includono: rottura dell apparato mitotico, alterazioni della funzione dei telomeri, ipometilazione del DNA, ricombinazione, amplificazione genica e transposizione genica.

49 CLASSIFICAZIONE DEI CANCEROGENI IN RELAZIONE ALLA LORO AZIONE SU UNA O PIU STADI DELLA CANCEROGENESI Agenti inizianti (cancerogeni incompleti): sostanze capaci solo di iniziare la cellula. Agenti promoventi: sostanze capaci di causare l espansione dei cloni cellulari iniziati. Agenti progressor : sostanze capaci di convertire una cellula iniziata o una cellula nello stadio di promozione a una cellula potenzialmente maligna. Agiscono soltanto per effettuare la

50 CLASSIFICAZIONE DEI CANCEROGENI IN RELAZIONE ALLA LORO AZIONE SU UNA O PIU STADI DELLA CANCEROGENESI transizione di una cellula dallo stadio di promozione a quello di progressione. Cancerogeni completi: sostanze con la capacità di indurre il cancro da cellule normali, generalmente con proprietà di iniziatori, promotori e di progressor.

51 CLASSIFICAZIONE DEI CANCEROGENI IN RELAZIONE ALLA LORO AZIONE SU UNA O PIU STADI DELLA CANCEROGENESI Agenti né mutageni né genotossici possono indurre tossicità diretta con danno tissutale e conseguente proliferazione cellulare.

52 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 1. Valutazione in vivo a 2 anni Test usato per definire un cancerogeno, studia l incidenza di tumori nei roditori in un modello biologico di due anni. La via di somministrazione è quella attraverso cui può causare il cancro nell uomo.

53 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 1. Valutazione in vivo a 2 anni Gli animali debbono essere suscettibili, non ipersensibili. La dose utilizzata è la Massima Dose Tollerata (MDT) e metà della MDT. Sono inclusi un gruppo di controllo trattato col solvente e un gruppo non trattato. Numero minimo: 50 x dose x sesso x specie.

54 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 2. Test a breve termine di mutagenesi in vivo Si basa sull assunzione che tutti i cancerogeni siano mutageni, ma mentre almeno la metà degli agenti cancerogeni noti sono anche mutageni, non tutti i composti valutati nel test a due anni lo sono, direttamente o dopo metabolismo.

55 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 3. Test di mutagenesi sui batteri Il più comune è quello sviluppato da Ames sulla Salmonella typhimurium. Cellule batteriche con deficit della riparazione del DNA e impossibilitate a crescere in assenza di istidina sono trattate con dosi diverse del composto. Viene aggiunta la frazione S9.

56 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 3. Test di mutagenesi sui batteri Sono state create linee differenti di Salmonella per determinare le mutazioni puntiformi (TA100, TA1535) e per scivolamento di lettura (TA98, TA1537, TA1538. Tipicamente sono utilizzate 5 dosi e un controllo col solvente.

57 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 3. Test di mutagenesi sui batteri Certi cancerogeni (ormoni, metalli, agenti con un meccanismo d azione multiorgano e agenti non genotossici) risultano negativi al test. D altro canto, in presenza della frazione S9 è un test molto sensibile.

58 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 4. Test di mutagenesi sui mammiferi Oltre a cellule batteriche, esistono linee cellulari di mammiferi quali le cellule di linfoma murino L5178Y, le cellule ovariche di criceto cinese (CHO) e i fibroblasti V79. Usano come endpoint la ipoxantina-guanina fosforibosiltransferasi o la timidina chinasi. E basato sulla presunzione che venga danneggiato il DNA.

59 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 5. Test su cellule o animali sottoposti a ingegneria genetica Si usano cellule modificate contenenti vari Cit. P-450 per mimare più strettamente i sistemi di attivazione. L alterazione dell equilibrio cellulare e la perdita di continuità tra attivazione metabolica e sistemi di coniugazione permette test di mutagenesi in vivo (inclusi i topi transgenici).

60 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 5. Test su cellule o animali sottoposti a ingegneria genetica E molto versatile per identificare la mutagenesi in vivo, ma non è stata validata la capacità di definire gli agenti clastogeni, mentre è dubbia quella di identificare i cancerogeni non mutageni.

61 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 6. Uso di geni endogeni per determinare mutazioni Studia le modificazioni dei geni durante i processi di cancerogenesi.

62 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 7. Test indiretti per definire la cancerogenesi Epatociti di ratto per studiare la riparazione del DNA in vivo e in vitro. Studio della rottura dei filamenti del DNA in epatociti di ratto (valutazione indiretta di danno genetico).

63 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 7. Test indiretti per definire la cancerogenesi Scambio di cromatidi fratelli (SCE), valutato in cellule CHO o nei linfociti periferici. Con tale test si possono identificare vari cancerogeni tra cui agenti promoventi.

64 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 8. Induzione di aberrazioni cromosomiche L analisi del cariotipo permette di definire il numero e l integrità dei cromosomi. Il test dei micronuclei permette di individuare agenti clastogeni e composti che interferiscono con la formazione e la funzione del fuso.

65 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 9. Test di trasformazione cellulare Sono stati sviluppati nei fibroblasti di topo, ma poiché la maggioranza delle neoplasie umane sono di origine epiteliale e poiché il DNA estratto da tumori umani non trasforma i fibroblasti, sono state sviluppate altre linee cellulari tra cui le cellule embrionali di criceti siriani che contengono i tre tipi di tessuti primari.

66 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 9. Test di trasformazione cellulare La sensibilità può essere aumentata integrando la coltura con un sistema metabolico, con un oncogeno attivato o con un gene soppressore inattivato del tumore.

67 TEST PER IDENTIFICARE I POTENZIALI AGENTI CANCEROGENI 10. Cancerogeni non genotossici Gli effetti dei cancerogeni non genotossici sono spesso organo-specifici e/o specie-dipendenti.