Profilo di colonizzazione del S. cardinale ed. isolamento ed analisi dei geni coinvolti nella resistenza. a cancro

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1 Profilo di colonizzazione del S. cardinale ed isolamento ed analisi dei geni coinvolti nella resistenza a cancro Giovanna Piva, Anita Zamboni, Luca Pedron, Ari Hietala, Nicola La Porta

2 Cancro del cipresso Patosistema C. sempervirens / S. cardinale Due obbiettivi: profilo spaziale di colonizzazione identificazione di geni coinvolti nella resistenza Meccanismi di difesa nella corteccia delle conifere barriere fisiche del periderma sintesi di composti fenolici tossici formazione di periderma di ferita Spanos et al., 1999

3 Cloni usati per il profilo di colonizzazione clone di C. sempervirens resistente (Bolgheri ) clone selvatico di C. sempervirens suscettibile Galbula infetta Rametto infetto L inoculo utilizzato proveniva da infezione su rametto

4 Metodologia di inoculazione tassello di corteccia inoculo di un tassello di agar con micelio di S. cardinale in attiva crescita WOUND + PATHOGEN SAMPLE TO COLONIZATION PROFILE > cm SAMPLE TO GENE EXPRESSION WOUND SAMPLE TO GENE EXPRESSION campionamenti a 7 gg campionamento a 30 gg

5 Fasi di campionamento a 30 gg

6 Profilo di colonizzazione spaziale Real time PCR Nc=No*E C Log(Nc)= Log(No)+Log(Eff)xC

7 Real time PCR Plot di amplificazione Numero di cicli CT

8 Profilo di colonizzazione spaziale Real-time PCR ospite: Phytocromo-P (AY380891) patogeno: ITS1 (AY687314) curve standard WOUND + PATHOGEN > cm SAMPLE TO COLONIZATION PROFILE SAMPLE TO GENE EXPRESSION WOUND SAMPLE TO GENE EXPRESSION Real-time PCR su tessuti dello stelo del clone resistente e di quello suscettibile ( 30 gg) zone di lesione separate in sezioni (lunghezza: 1 cm, larghezza 5 mm, spessore 3 mm) estrazione di DNA da ciascuna sezione (DNeasy Plant Mini kit, Qiagen) analisi Real-time PCR quantificazione DNA di ospite e patogeno utilizzando le rispettive curve standard

9 Profilo di colonizzazione dopo 30 giorni dall infezione clone resistente clone suscettibile

10 Studio di espressione genica 1. Estrazione di RNA totale (Moser et al., 2004 modificata) campionamento a 7 gg di parte dello stelo di un ramet di C. sempervirens resistente inoculato con S. cardinale e di quello di un ramet non inoculato (controllo) sezione (lunghezza 2 cm) a partire da 2 cm dal punto di inoculo 2. Produzione di una libreria a cdna sottratta sintesi di cdna (SMART cdna Synthesis kit, Clontech) SSH (PCR-Select TM, Clontech) clonaggio del cdna sottratto nel vettore pcr 2.1-TOPO (TOPO TA Cloning, Invitrogen)

11 Studio di espressione genica Suppression subtractive hybridization (PCR-Select TM, Clontech) tester: ramet resistente ferito ed inoculato con S. cardinale driver: ramet resistente (stesso clone) ferito e non inoculato WOUND + PATHOGEN SAMPLE TO COLONIZATION PROFILE > cm SAMPLE TO GENE EXPRESSION WOUND SAMPLE TO GENE EXPRESSION

12 Suppression subtractive hybridization (PCR-Select TM, Clontech)

13 Suppression subtractive hybridization (PCR-Select TM, Clontech) cicli di PCR sub unsub

14 Sequenziamento di 134 trascritti arricchiti ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) OUTPUT

15 Prima annotazione con tutte le 106 sequenze non-ridondanti ottenute

16 36 sequenze selezionate per alta omologia con quelle depositate in banche dati CODE ACCESSION NUMBER DNA HOMOLOGY SPECIES SIZE bp SCORE IDENTITIES E-VALUE L6 gi gb AY clone mrna Arabidopsis thaliana bits (113) 454/565 (80%) 6e-55 L12 gi dbj AB S-adenosyl-L-homocysteine hydrolase Beta vulgaris bits (58) 266/323 (82%) 1e-44 E13 gi gb AY LOS2 (los2) mrna Capsella bursa-pastoris bits (86) 260/318 (81%) 5e-39 A15 gi dbj AB CC2188 gene for putative Adomet decarboxylase Chamaecyparis obtusa bits (171) 267/299 (89%) 8e-90 H10 gi dbj AB mrna for putative peptidyl-prolyl cis-trans isomerase Cryptomeria japonica bits (268) 429/477 (89%) 9e-148 A17 gi gb DQ alkaline alpha galactosidase (AGA2) Cucumis sativus bits (41) 86/101 (85%) 5e-12 F5 gi dbj AB Chs gene for chalcone syntase Chs Juniperus rigida bits (135) 213/239 (89%) 2e-68 F6 gi dbj AB Chs gene for chalcone syntase Chs Juniperus rigida bits (215) 323/359 (89%) 3e-116 H20 gi dbj AB Chs gene for chalcone syntase Chs Juniperus rigida bits (141) 219/245 (89%) 3e-72 I1 gi gb DQ Qiu large subunit ribosomal RNA gene Juniperus sp bits (391) 399/402 (99%) 4e-23 E1 gi gb U chloroplast 16S rrna gene Juniperus virginiana bits (338) 365/370 (98%) 3e-13 K7 gi gb U chloroplast 16S rrna gene Juniperus virginiana bits (359) 373/375 (99%) 6e-18 I17 gi gb AY heat shock protein 70 (HSP70-1) mrna Medicago sativa bits (64) 169/204 (82%) 2e-26 L19 gi emb CR chromosome 5 clone mte1-9e19 Medicago truncatula bits (42) 93/110 (84%) 1e-12 F21 gi gb AC clone mth2-6a23 Medicago truncatula bits (32) 50/56 (89%) 1e-06 M23 gi emb CR chromosome 5 clone mte1-9e19 Medicago truncatula bits (42) 93/110 (84%) 1e-12 B13 gi gb AF GDP dissociation inhibitor (GDI) mrna Nicotiana tabacum bits (94) 387/479 (80%) 6e-44 M15 gi gb AY adenosine kinase isoform 1S mrna Nicotiana tabacum bits (84) 228/276 (82%) 7e-38 M1 gi ref NM_ chromosome 1 Oryza sativa bits (37) 58/65 (89%) 6e-10 A11 gi ref NM_ chromosome 7 Oryza sativa bits (27) 30/31 (96%) 8e-04 E19 gi ref NM_ chromosome 5 Oryza sativa bits (40) 79/92 (85%) 2e-11 N21 gi ref NM_ chromosome 7 Oryza sativa bits (53) 89/101 (88%) 3e-19 A23 gi gb AY clone 1R aldehyde dehydrogenase mrna Pinus halepensis bits (69) 126/144 (87%) 9e-29 B22 gi emb AJ glutamine synhtetase Pinus sylvestris bits (165) 352/413 (85%) 3e-86 E7 gi gb AF nascent polypeptide associated complex alpha chain Pinus taeda bits (58) 160/194 (82%) 3e-22 D6 gi gb AF nascent polypeptide associated complex alpha chain mrna Pinus taeda bits (147) 390/471 (82%) 2e-75 I11 gi emb AJ mrna for thioredoxin-dependent peroxidase (tpx1 gene) Plantago major bits (87) 198/235 (84%) 9e-40 I15 gi emb AJ mrna for thioredoxin-dependent peroxidase (tpx1 gene) Plantago major bits (87) 198/235 (84%) 9e-40 I7 gi emb AJ mrna for thioredoxin-dependent peroxidase (tpx1 gene) Plantago major bits (87) 198/235 (84%) 9e-40 D11 gi gb M ATP:pyruvate phosphotransferase (PK-p-beta) mrna Ricinus communis bits (64) 358/456 (78%) 9e-26 L2 gi gb AY WD-40 repeat protein mrna Solanum lycopersicum bits (76) 214/260 (82%) 3e-33 L3 gi gb AY WD-40 repeat protein mrna Solanum lycopersicum bits (76) 214/260 (82%) 3e-33 G23 gi emb Z DAHP synthase 1 precursor Solanum lycopersicum bits (54) 261/330 (79%) 5e-20 B1 gi dbj AK ribosomal protein Solanum lycopersicum bits (49) 106/125 (84%) 8e-17 L10 gi gb AF plastidic 6-phosphogluconate dehydrogenase (pgdp) mrna Spinacia oleracea bits (54) 99/114 (86%) 1e-19 D16 gi emb AM contig VV78X Vitis vinifera bits (39) 84/99 (84%) 5e-11

17 Specie arboree con alta omologia col cipresso Juniperus rigida e J. virginiana (Famiglia Cupressaceae, sottofamiglia Cupressoideae) Chamaecyparis obtusa (Famiglia Cupressaceae, sottofamiglia Cupressoideae) Cryptomeria japonica (Famiglia Cupressaceae, sottofamiglia Taxodioideae) Pinus halepensis Pinus sylvestris Pinus taeda (Famiglia Pinaceae) Tra i geni con meno pronunciata omologia (e quindi non selezionati tra i 36) rientrano anche geni altre conifere: Pinus pinaster Pinus koraiensis Abies alba

18 Conclusioni 1. Cloni resistenti e suscettibili appaiono avere un profilo differenziale della colonizzazione del fungo sulla corteccia dopo 30 gg dall infezione, in particolare a 8 cm di distanza dall inoculo 2. Una metodologia per l estrazione dell RNA totale è stata ottimizzata per il cipresso 3. SSH può essere utilizzata efficientemente in C. sempervirens per identificare geni di resistenza al cancro specialmente con basse concentrazione di trascritti 4. Nella prima settimana di infezione, decine di geni espressi, associati all interazione ospite/patogeno, sono stati selezionati 5. Una parte significativa di questi geni presentano alta omologia con quelli di altre specie erbacee e arboree, incluse diverse conifere, depositati in banche dati

19 Prospettive future Validazione e caratterizzazione attraverso Real-time RT-PCR dei geni identificati CHS, perossidasi cloni resistenti e cloni suscettibili Studio dei meccanismi molecolari della resistenza a S. cardinale Sviluppo di marcatori molecolari di selezione (MAS) per accelerare il lavoro di breeding Sviluppo di cloni cis-genici resistenti al cancro in C. serpenvirens

20 Grazie dell attenzione!