Lettura Magistrale Marcello. Quintiliani. Radiobiologia e Ricerca Traslazionale

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1 XIV CONVEGNO NAZIONALE DELLA SOCIETÀ ITALIANA PER LE RICERCHE SULLE RADIAZIONI (S.I.R.R.( S.I.R.R.) TRIESTE, GIUGNO 2008 Lettura Magistrale Marcello Quintiliani Radiobiologia e Ricerca Traslazionale Donatella Tirindelli Danesi Dipartimento Biotecnologie Sez. Scienze Biomediche ENEA - Roma

2 Primo Presidente Eletto e Presidente Onorario della Società Italiana per le Ricerche sulle Radiazioni

3 PERCENT OF K* RETENTIVITY Dose-effect curve for K+ retentivity and survival of E.coli B/r cells irradiated with X-rays in the presence of iodine containing compounds control SURVIVAL NaI IPA IAM IAA DOSE (Krad)

4 Translational research

5 Ricerca traslazionale Strategie con le quali i risultati di laboratorio possono essere convertiti in ricadute pratiche per la salute umana Il successo della ricerca traslazionale richiede nuovi esperti, infrastrutture e incentivi Esperti in medicina, biologia, farmacologia, tossicologia, proprietà intellettuale, trasferimento tecnologico, sviluppo industriale, disegno di trials clinici

6 Two-way process Esperimenti su tessuti umani e trials clinici possono ispirare nuovi interrogativi da testare in laboratorio che potranno migliorare il disegno del trial clinico in una sua nuova formulazione

7 Translational Research: Getting the message across

8 Ricerca traslazionale in radioterapia Importanza crescente attribuita dalla comunità radioterapica alla ricerca biologica Radioterapia non più solo disciplina tecnologica

9 Ricerca traslazionale in radioterapia Radiobiologia molecolare Tecniche di irradiazione più sofisticate (3D conformal therapy, IMRT, IORT, Protontherapy,..)

10 Technologies and resources available in functional genomics Copyright 2003 American Society for Biochemistry and Molecular Biology

11 Radiobiologia molecolare Riparo del DNA Ipossia Microambiente tumorale Predittività della risposta del tumore e dei tessuti normali Targeting molecolare

12 Targeting DNA Repair in Oncology: Rationale DNA damage frequently occurs in all cells Why is DNA repair a good target? DNA repair defects lead to increased cancer susceptibility and increased sensitivity to DNA-damaging agents Normal cells have multiple DNA repair pathways but some are lost in cancer cells Inhibiting DNA repair in cancer cells that have impaired repair pathways leads to selective cell killing and an increased therapeutic ratio Novel targeted therapeutic approach

13 Types of DNA Damage and Repair Type of damage: Singlestrand breaks Doublestrand breaks Bulky O6- adducts alkylguanine Insertions and deletions Repair pathway: Base excision repair Recombinational repair HR NHEJ Nucleotideexcision repair Mismatch repair Direct reversal Repair enzymes: PARP ATM DNA-PK XP, polymerases MSH2, MLH1 AGT

14 PARP and Base Excision Repair DNA damage NAD+ PARP PARP recruitment poly(adp-ribose) PARP PARP activation and assembly of repair factors PARG PARP XRCC1 LigIII PAR degradation via PARG pol β PNK 1 pol βpnk 1 XRCC1 LigIII End processing, gap filling, and ligation

15 Targeted Killing of Cancer Cells With Defective DNA-Repair Mechanisms Double-stranded break Normal cell Cancer cell with defective repair Repair by HR pathway BRCA deficient or deficiency of other HR proteins No repair (No HR pathway) Survival Exploits inherent weakness of cancer cells that have defective DNA repair Cell death

16 DNA Repair Inhibitors in Cancer Cells: 2 Modes of Action Potentiation Inhibition of DNA repair following DNA-damaging agents Original hypothesis Synthetic lethality Selected cancer cells lose DNA repair pathways, whereas normal cells remain unaffected Targeting these defective cells may cause selective cell kill with an increased therapeutic ratio May allow for a novel targeted approach to cancer treatment

17 DNA DAMAGE RESPONSE PATHWAY

18 Meccanismi di riparo delle DSBs

19 Ku DNA-binding activity in nuclear extracts of RT112 and SW48 cell lines Negroni, et al, 2008

20 Inhibition of Ku80 expression in RT112 by microrna Negroni, et al, 2008

21 Ku 80 interference causes a decrease of proliferation and viability of RT112 after X-ray exposure Negroni, et al, 2008

22 EGFR-PI3K-AKT pathway H. PETER RODEMANN, 2007

23 Radiation-induced nuclear translocation of EGFR

24 Inclusione di bioterapie molecolari in radioterapia EGFR overespressione associata a diminuito controllo tumorale dopo RT target in radioterapia

25 Trasduzione del segnale mediata da EGFR M. Baumann 2004

26 Inibizione di EGFR e RT SCC umano in topo nudo M. Baumann 2004

27 Inibizione ripopolamento e riossigenazione C225 MoAb anti-egfr Miglioramento del controllo locale durante un irraggiamento frazionato di tumori FaDu (human hypopharyngeal squamous cell carcinoma line)

28 Volume tumorale mediano M. Krause 2005

29 Espressione di EGFR in regioni ipossiche M. Krause 2005

30 RT e CETUXIMAB SCC testa-collo RT sola 213 paz RT + cetuximab 211 paz F.U. mediano 54 mesi LRC (mesi) OS (mesi) RT RT + cetuximab p =.005 p =.03 Bonner JA, NEJM 2006

31 RT+ cetuximab vs RT+ chemotherapy LRC, DMFS and DSS differenze non statisticamente significative 29 paz vs 103 Studio retrospettivo Necessità di identificare marker predittivi di radioresistenza o radiosensibilità alle terapie a target molecolare Caudell JJ, 2008

32 Insorgenza di resistenza a EGFR inibitori I tumori diventano resistenti per la maggior parte entro un anno dall inizio del trattamento Acquisizione di mutazioni secondarie che rendono inefficace il farmaco: seconda mutazione in EGFR amplificazione di MET E necessario sequenziare geni da tumori multipli per evidenziare le loro idiosincrasie genetiche

33 Directly Targeting the Cancer Cell: Disadvantages Major heterogeneity across and between histologies[1] Biologically/genetically unstable target Acquired genetic instability Increases with progression/stage/pretreatment Limits efficacy of treatment Homeostatic response/selection of resistant clones (acquired and de novo resistance) 1. Sjoblom T, et al. Science. 2006;314:

34 Targeting the Microenvironment Genetically stable substrate Less amenable to mutation/acquired resistance Common final pathways possible Less heterogeneity of target Relatively predictable response of tissues to cancer Addresses poorly understood and most lethal hallmark of malignancy: metastasis Plethora of potential novel targets

35 Interazioni Stroma-Epitelio nelle cellule tumorali Possiamo effettivamente manipolare queste interazioni a fini terapeutici? Terapie antiangiogeniche Terapie con anticorpi anti-ctla4

36 Strategie Microenvironment- Targeted Vantaggi teorici e pratici rispetto al targeting diretto delle cellule tumorali Multiple nuove opportunità di inibire la formazione di metastasi

37 La rivoluzione genomica e la radioterapia Mutazioni del DNA in un gene o in pochi geni non sono responsabili della differente radiosensibilità degli individui La radiosensibilità è oggi considerata come un fenotipo ereditario e un tratto genetico complesso dipendente dall interazione di molti geni o loro prodotti

38 Espressione genica dopo RT 10 ca cervice radioresistenti vs 9 ca cervice radiosensibili Microarray analisi di cdna 20 geni up-regolati nei radioresistenti (XRCC5,Ku80) 120 geni up-regolati nei radiosensibili (MAP3K2) 62 geni in grado di predire la classe appropriata Bassi livelli di Ku80 correlati con radiosensibilità in 89 ca cervice Kitahara, 2002; Harima, 2003

39 cdna array technology Mutanti radiosensibili o varianti di linee cellulari isolamento dei geni coinvolti nella risposta alle radiazioni espressione genica differenziale: può riflettere differenze in radiosensibilità

40 Carcinoma della vescica cdna array technology MGH-U1 radioresistente SF S40b clone radiosensibile SF Kassem, Int J Cancer, 2002

41 Carcinoma della vescica cdna array technology Espressione di geni correlati allo stress e al riparo del DNA differenza: 20/234 (12%) geni HSP27 e NNMT down in S40b CDKN1A down after 2 Gy Kassem, Int J Cancer, 2002

42 Radiosensibilità tessuti normali 80-90% differenze genetiche individuali 10-20% eventi stocastici (uccisione cellulare random, variazioni random nella dosimetria e somministrazione della dose)

43 Test predittivi Skin fibroblast SF2 assays Lymphocyte assays Chromosomal aberrations and micronuclei Molecular approaches: gene expression profiling cytokine responses DNA end-binding complexes

44 Polimorfismi a singolo nucleotide (SNPs)..G G T A A C T T G.....G G C A A C T T G... un gene è polimorfico se ha varianti alleliche stabili all interno di una popolazione con una frequenza > 1% e una o più di queste varianti presentano differenze nell attività della proteina rispetto alla sua relativa forma wild-type Varianti ogni basi lungo i 3 bilioni di basi del genoma umano

45 Geni candidati di radiosensibilità Riconoscimento e riparo del danno al DNA (es. TP53, XRCC1, XRCC3, LIG4, APEX) Controllo checkpoint ciclo cellulare (es. CDKN1A) Risposta allo stress ossidativo (es. SOD2) Induzione di apoptosi (es. BCL2) Risposta delle citochine (es.tgfβ1)

46 Studi internazionali di genotipizzazione GENE-PARE Genetic Predictors of Adverse Radiotherapy Effects USA, Israele, Francia, Svizzera 2000 RT paz (mammella, prostata, testa-collo) GENEPI GENEtic pathways for the Prediction of the effects of irradiation Europa - ESTRO RT paz (mammella, prostata, testa-collo, retto) RAPPER Radiogenomics Assessment of Polymorphisms for Predicting the Effects of RT - UK 2200 RT paz (mammella, prostata, t.ginecologici) RACE ( RT complications and epidemiology) RadGenomics JapaneseRadGenomic study 1071 RT paz (mammella, cervice, prostata, testa-collo)

47 ATM in GENE-PARE 46 paz ca mammella 3/3 G 3-4 reazione sottocutanea avevano varianti ATM missense vs 3/43 G G-A variante in ATM: ED50 52Gy vs 61 Gy Paz ca prostata 10/16 con risposta avversa avevano varianti ATM missense vs 3/21senza variazioni nella sequenza ATM

48 RadGenomics In 284 pazienti con ca mammario sono stati identificati 25 SNPs marker per reazione cutanea acuta e 22 per effetti a 3-6 mesi

49 Polimorfismi e risposta tumorale 210 paz con ca esofageo Varianti XRCC1 nel DNA estratto dal tessuto tumorale associate a risposta patologica incompleta Wu X et al, 2006

50 Genetica di popolazioni HapMap Una mappa di aplotipi del genoma umano descrive i pattern comuni delle variazioni di sequenza del DNA umano in 269 campioni di 4 popolazioni HapMap potrebbe essere una risorsa chiave per identificare geni correlati a malattie e risposta alle terapie Nature, 2005

51 High-throughput whole genome SNP arrays E stato stimato che sono necessari più di pazienti per ottenere il potere statistico necessario a identificare correlazioni significative con la radiosensibilità clinica

52 SINERGIA FRA RADIAZIONI IONIZZANTI E FARMACI Tipo di farmaco Farmaco e dosi di RT e modalità di somministrazione Sequenza dei trattamenti

53 Meccanismi di interazione: - a livello molecolare (nuove lesioni o inibizione del riparo) - a livello cellulare (cooperazione citocinetica, sincronizzazione nella fase G2/M) - a livello tessutale (riossigenazione, incremento uptake farmaco, inibizione di ripopolamento o angiogenesi, ridistribuzione nel ciclo,..)

54 Oltre 20 agenti attivi impiegati con la RT 5-Fluorouracile (5-FU) Platinum (cddp, 1-OHP) Antracicline (ADR, EpiDX) Tassani (Paclitaxel, Docetaxel) Gemcitabina (GEM) Camptotecina (CPT-11, RFS-2000)

55 Facilitazione del danno iniziale da radiazioni - incorporazione del farmaco nel DNA (5-FU) - formazione di intra e interstrand cross-links (cisplatino)

56 5-FLUOROURACILE - deve essere presente dopo ogni esposizione ai raggi X - la durata dell esposizione deve essere lunga almeno quanto un intero ciclo cellulare

57 5-FLUOROURACILE A causa della breve emivita del 5-FU nell uomo (10-15 min), questi prerequisiti possono essere soddisfatti solo con l infusione continua del farmaco concomitante alle radiazioni

58 Cisplatino Radiofacilitazione chimica: formazione intracellulare di radicali liberi reattivi o alterazione dell attività di legame dei complessi delplatino al DNA durante l irraggiamento radiation (sia nelle cellule ipossiche che ossigenate) alte dosi prima delle radiazioni

59 Cisplatino Radiofacilitazione biochimica : più importante meccanismo nel trattamento di pazienti neoplastici aumentata tossicità indotta dalle radiazioni per l inibizione dei meccanismi cellulari coinvolti nella riparazione del danno concomitante alla RT

60 Schema di trattamento DOSE / TARGET: DOSE / TARGET: Gy pelvi Gy vescica Radioterapia iperfrazionata: 100 cgy X 3/day or 150 cgy X 2/day PVI: CDDP: 5 mg/m 2 /day + 5-FU: 200 mg/m 2 /day

61 Risposta al trattamento MCV + : CR: 84.2% PR: 15.8% Total CR: 89.4% PR: 10.6% MCV - : CR: 96.4% PR: 3.6%

62 FIVE-YEAR CYSTECTOMY FREE SURVIVAL 1.0 Cumulative proportion surviving Months Tirindelli Danesi, et al, 2004

63 FIVE-YEAR DISEASE FREE SURVIVAL 1.0 Cumulative proportion surviving Months Tirindelli Danesi, et al, 2004

64 DISEASE SPECIFIC, OVERALL AND BLADDER INTACT SURVIVAL 1.0 Cumulative proportion surviving Disease specific survival Overall survival Bladder intact survival Months Tirindelli Danesi, et al, 2004

65 GEMCITABINA inibisce la sintesi del DNA induce arresto in fase S abbassa la soglia per l apoptosi indotta da radiazioni riduce il riparo del DNA DER in vitro

66 Citotossicità tessuto-dipendente in vivo GEM I tessuti normali recuperano più rapidamente di quelli tumorali Milas, Cancer Res 1999

67 Citotossicità in funzione della dose di farmaco, frazionamento e timing Basse dosi per frazione concomitanti alla RT sono più efficaci Più elevato DER con regimi settimanali o bisettimanali 24 h prima della RT

68 Giorni di trattamento Protocolli G G G G 2 RX RX RX RX RX RX RX RX RX RX 3 RX RX RX RX 4 G RX RX G + RX RX RX G + RX RX RX G + RX RX 5 G RX G RX G RX G RX G = Gemcitabina RX = raggi X

69 30 20 TGT4 (giorni) 10 Gem + RX (2 Gy x 10) Gem Dosi Gemcitabina (mg/kg/frazione)

70 50 40 TGT4 (giorni) RX 10 frazioni RX 4 frazioni Gem + RX 10 frazioni Gem + RX 4 frazioni Dose raggi X (Gy)

71 Gli studi su modelli animali possono fornire informazioni significative sulle modalità di trattamenti combinati, in particolare per definire la tossicità sui tessuti normali e la dose iniziale di farmaco nei protocolli clinici di fase I

72 Ricerca traslazionale Colpire più vie di segnale Cooperazione biologica Cooperazione cinetica Protezione tessuti normali Nuova impostazione trial clinici fase I (end-points aggiuntivi associati con il meccanismo molecolare dell interazione)

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