APPUNTI DI GENETICA AGRARIA

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1 Università degli Studi di Camerino Dipartimento di Scienze ambientali APPUNTI DI GENETICA AGRARIA PROFESSOR CARLO RENIERI Anno Accademico 2007-'08

2 1. LA GENETICA. La genetica è la scienza dell eredità e delle variazioni; essa cerca di spiegare, attraverso delle leggi, la rassomiglianza e le differenti esistenti tra individui. L eredità è la trasmissione dei caratteri, e quindi dei geni, dai genitori ai loro discendenti. Le variazioni sono le differenze che esistono tra gli individui di una popolazione per un determinato carattere. 2. IL DNA. Oggi si dà per scontato che il materiale genetico è il DNA. Già nel 1928 lo statunitense Griffith dimostrò che una sostanza iniettata al Diplococcus pneumoniae lo trasformava da avirulento in virulento. Nel 1944 Avery identificò il DNA e dal 1952 tutta la comunità scientifica lo accettò come il materiale genetico alla base dell'eredità. L'acido desossiribonucleico è costituito da una sequenza di quattro molecole fondamentali denominate nucleotidi, che differiscono solamente per il fatto di contenere ciascuno una differente base azotata; ogni nucleotide risulta composto da uno zucchero a cinque atomi di carbonio (desossiribosio), da un gruppo fosfato e da una delle quattro basi azotate; da un punto di vista strutturale, le basi sono a due a due simili: da una parte adenina e guanina (purine, con un doppio anello) e dall'altra citosina e timina (pirimidine, ad anello singolo). La struttura di un nucleotide è quindi composta dall'anello del desossiribosio che lega il gruppo fosfato al suo carbonio 5' ed una delle quattro basi al carbonio 1'. Nel 1953, James Watson e Francis Crick proposero il primo modello della molecola del DNA che conteneva in sé l'indicazione di come il DNA potesse svolgere le sue funzioni di conservazione e trasmissione dell'informazione genetica. La struttura proposta da questi autori è quella di una doppia elica avvolta a spirale con avvitamento destrorso (cioè in senso orario). Ciascuna elica è formata da una catena di nucleotidi tenuti insieme da legami covalenti; più precisamente si tratta di legami fosfodiesterici nei quali un gruppo fosfato forma un ponte tra la posizione 3' di un pentoso e la posizione 5' del pentoso successivo. Ciascuna catena avrà ad una sua estremità un gruppo 5' libero ed all'estremità opposta un gruppo 3' libero; le due eliche sono tenute insieme dai legami idrogeno che si stabiliscono tra le basi complementari (A-T e C-G) per la presenza di due atomi elettronegativi che condividono un protone. I legami ad idrogeno che uniscono le due catene sono molto più deboli di quelli covalenti che uniscono due nucleotidi contigui nella stessa catena; per motivi sterici i legami ad idrogeno possono formarsi solo fra adenina e timina (2 legami) e fra citosina e guanina (3 legami): il differente numero di legami ad idrogeno che lega le coppie di basi azotate complementari spiega la diversa densità che il DNA può avere (è più denso se più ricco in citosina e guanina). Il modello richiede che le due catene siano anti-parallele, decorrano cioè in senso 5'-3' l'una e in senso 3'-5' l'altra: in altri termini l'estremità 5' di un filamento si trova di fronte all'estremità 3' dell'altro. Il modello proposto da Watson e Crick nel 1953 è ancora sostanzialmente valido: è il ß-DNA, dove l'andamento della spirale e dei filamenti è regolare e si può distinguere un solco minore (fra le due catene) ed un solco maggiore (quello dovuto alla spiralizzazione vera e propria). E' importante sottolineare che, in periodi successivi, sono state descritte altre conformazioni della molecola dell'acido desossiribonucleico. Queste differenti conformazioni strutturali del DNA sono state messe in rapporto a specifiche sequenze nucleotidiche della molecola stessa. Ad esempio, alcune sequenze caratterizzate da un regolare alternarsi di basi pirimidiniche e puriniche sono in grado di indurre la conversione da una normale doppia elica destrorsa ad una forma Z sinistrorsa, caratterizzata da uno scheletro portante di DNA molto più irregolare, seghettato, e dalla presenza di un unico solco minore che sostituisce i due solchi maggiore e minore della classica struttura ß. Altro caso simile è quello per cui le cosiddette ripetizioni invertite (cioè una sequenza seguita sullo stesso filamento dalla sua sequenza complementare disposta in ordine inverso) inducono nella molecola la comparsa di una struttura caratteristica "a croce": ciò è dovuto alla tendenza delle basi ad appaiarsi nell'ambito dello stesso filamento, con il conseguente ripiegarsi del filamento stesso. Il DNA è dunque una molecola estremamente flessibile e reattiva, in grado di interagire con tutta una serie di molecole cellulari grazie anche ad una continua modificazione conformazionale. 2

3 LA DUPLICAZIONE DEL DNA. Il meccanismo di replicazione del DNA è semiconservativo: la doppia elica madre darà due doppie eliche figlie, formate ciascuna da un filamento parentale e da un filamento neoformato; erano stati in precedenza proposti anche altri modelli che però non hanno trovato conferma (ad esempio, il modello conservativo, il modello dispersivo). La doppia elica si srotola e forma una doppia Y (la "forcina di replicazione"): la base della Y si srotola progressivamente mentre le due braccia fungono da stampo (template) per il nuovo filamento. L'intero meccanismo di replicazione è basato sulla complementarietà delle basi azotate. Lo srotolamento necessita di 3 proteine specifiche: la replicasi srotola il tratto da replicare, la proteina SSB si lega al filamento srotolato ed impedisce la sua degradazione e riunione, la proteina ligasi controlla la zona non despiralizzata proteggendola da trazioni ed altri traumi. La DNApolimerasi aggiunge un nucleotide ad un tratto preesistente: non è in grado di iniziare ex novo, ma necessita di un primer (può aggiungere nucleotidi solo all'estremità 3': il verso di formazione della catena è pertanto 5'-3'); l'energia della scissione del gruppo energetico fosfato è utilizzata per legare il nucleotide. La DNApolimerasi ha anche il compito di scindere eventuali legami erronei fra le basi. Il primer è dato dalla RNApolimerasi. Il filamento 3'-5' viene sintetizzato a tratti, sempre nel verso 5'-3', con un numero elevato di primer di RNA; i tratti sono detti frammenti di Okazaki. Quando la DNApolimerasi trova al termine di un tratto il primer di un tratto vicino lo scinde e lo risintetizza come DNA (sostituisce RNA con DNA). I vari frammenti di Okazaki sono uniti dalla DNAligasi. Negli eucarioti la replicazione del DNA non comincia in un solo punto ma contemporaneamente ed indipendentemente in più "forcine di replicazione": questi punti, detti "bolle di replicazione", confluiscono e sono infine uniti dalla DNAligasi; per dimostrare la molteplicità dei siti di replicazione si è ricorsi a timidina triziata, cioè marcata con trizio, e si è seguita la distribuzione della radioattività dopo la replicazione. LA DIVISIONE FUNZIONALE DEL DNA. Le dimensioni del genoma vengono espresse in numero di paia di basi (1 Kb = paia di basi). Salendo nella scala evolutiva si nota una certa tendenza all'aumento delle dimensioni del genoma, ma non vi è una esatta corrispondenza fra la complessità fenotipica o il livello evolutivo di un organismo e la grandezza del suo genoma: ad esempio, il genoma di una salamandra e quello del grano tenero hanno entrambi dimensioni superiori al genoma dell'uomo. Bisogna tenere conto non solo del numero di paia di basi ma anche del numero di geni. Il genoma di Eschirichia coli è composto da 4x10 6 paia di basi e considerando un gene in media codificato in 2-3 Kb si può sostenere che il genoma di questo batterio contiene poche migliaia di geni, come si è potuto anche controllare fenotipicamente; il genoma di Drosophyla melanogaster ha circa 2x10 8 paia di basi, ma è stato dimostrato contenere solo geni circa; il genoma dell'uomo (Homo sapiens) ha circa 3x10 9 paia di basi, e contiene circa geni. In realtà, mentre nei batteri le dimensioni del genoma sono proporzionali al numero dei geni, negli eucarioti ciò non si verifica. Come mai aumenta molto il DNA ma proporzionalmente non i geni? Esiste del DNA eucariotico che non funziona? In effetti negli eucarioti c'è molto DNA ripetuto: alcune centinaia di basi vengono ripetute più volte. Per studiare questo fenomeno si utilizza la cinetica della denaturazione; il DNA viene frammentato e poi denaturato (cioè trasformato da un doppio filamento in due filamenti singoli, in genere aumentando la temperatura); quando si riabbassa la temperatura il DNA si rinatura, cioè si ritrasforma in doppio filamento mediante l'appaiamento delle basi complementari: più esistono sequenze ripetute e più rapida è la rinaturazione (ci sono più probabilità di appaiamento fra frammenti complementari). 3

4 In base alla quantità di ripetizioni vengono distinte negli eucarioti 3 classi di DNA: - DNA altamente ripetuto, che rappresenta da 0 al 50% del DNA, nel quale esistono oltre 10 5 copie delle stesse sequenze, come ad esempio nel caso del DNA satellite; - DNA mediamente ripetuto, che rappresenta dal 10 al 40% del DNA e con sequenze ripetute fra 10 e 10 5 volte, come nel caso dei geni per rrna, trna istoni; - DNA a sequenza unica, che non è cioè ripetuto, e rappresenta il 40-80% del DNA (ad esempio, i geni dell'emoglobina, dell'ovoalbumina). Il DNA satellite è costituito da sequenze altamente ripetute: ultracentrifugando in gradiente di cloruro di cesio, all'interno della provetta il DNA si stratifica in una banda corrispondente alla propria "densità di galleggiamento"; nei procarioti si ha una sola banda, mentre negli eucarioti in prossimità della banda principale si hanno altre bande, da cui il nome di DNA satellite; il fenomeno è legato al diverso contenuto in coppie di basi guanina-citosina, che provoca una densità diversa da quella della banda principale. Da un punto di vista funzionale il DNA può essere distinto in codificante e non codificante, a seconda che dia o meno esito alla sintesi di una proteina. Il genoma è composto da parti funzionalmente discontinue: la parte non codificante (introne) viene trascritta ma non dà alcuna proteina, mentre la parte codificante darà gli esoni e quindi le proteine. Per quale motivo nel DNA si ripetono più volte le stesse sequenze? Un'ipotesi era che più erano le sequenze e più poteva essere quantitativamente la sintesi della proteina, ma si è visto che più che dalla trascrizione la sintesi proteica è limitata da altre fasi. Si tratta di una specie di copie di riserva, in caso di mutazioni? Il DNA ripetuto modifica la probabilità che le mutazioni, che sono casuali, riguardino delle sequenze funzionalmente importanti? Si tratta di famiglie multigeniche, cioè di geni molto simili sia nelle sequenze nucleotidiche che nella proteina prodotta (ad esempio, le globine dell'emoglobina, oppure le cheratine della lana), con una qualche testimonianza evolutiva? Se il DNA ripetuto non è codificante, a che cosa può servire? E' forse la forma più semplice di parassitismo? IL CODICE GENETICO. In che modo la sequenza nucleotidica del DNA determina la sequenza aminoacidica delle proteine? E' il concetto di codice genetico. Il primo problema era di stabilire se nel codice c'erano o no delle sovrapposizioni, cioè di stabilire se un nucleotide poteva essere "letto" più di una volta, in diverse posizioni del codice: ad esempio, nel caso di una sequenza ATTGCTCAG, se il codice è senza sovrapposizione, i primi tre aminoacidi sono codificati dalle triplette ATT, GCT, CAG, mentre se il codice è con sovrapposizioni, i primi tre aminoacidi sono codificati dalle triplette ATT, TTG, TGC. Nel 1961 venne accertato che non ci sono sovrapposizioni: infatti, se muta una sola base muta nella corrispondente proteina un solo aminoacido; il codice con sovrapposizione farebbe invece prevedere che al cambiamento di un solo nucleotide corrisponda il cambiamento di più aminoacidi contigui (fino a tre). In realtà ci può essere una specie di sovrapposizione perché il DNA può essere letto con differente "frame" (lettura spostata di una o due basi) e quindi dare differenti proteine: si dicono proteine modificate per scivolamento ("shifting"); si tratta però non di una sovrapposizione nella lettura del codice genetico per una proteina ma di differenti fasi di lettura dello stesso tratto di DNA che codifica per proteine differenti. Le lettere a disposizione del codice genetico sono le 4 basi azotate. Con due basi azotate si potrebbero specificare 4 2 possibilità, cioè 16 differenti aminoacidi, mentre con tre si possono teoricamente specificare 64 differenti aminoacidi (4 3 ); essendo 20 gli aminoacidi c'è un problema di eccesso di possibilità. Ai 20 aminoacidi bisogna aggiungere un codon per il segnale di inizio della trascrizione ed uno per il segnale di fine della trascrizione, ma ne esistono anche che non specificano nulla (e quindi fanno immediatamente interrompere la trascrizione); si tratta inoltre di un codice degenerato, perché un aminoacido può essere indicato da più di un codon. Esperimenti condotti da Brenner (con mutanti del locus rii del fago T4) hanno dimostrato che un codon è effettivamente di tre lettere (e non più di tre). Il meccanismo di duplicazione del DNA è molto efficiente: in E. coli, in un minuto vengono replicate 4

5 basi e in una generazione c'è solo un errore su un milione di replicazioni del DNA. LE MUTAZIONI. Occasionalmente, durante la replicazione del DNA, possono verificarsi degli errori che vengono trasmessi alla generazione successiva. Potrebbe avvenire ad esempio che venga sostituito per errore un nucleotide: è una mutazione puntiforme; l'rna-polimerasi non è in grado di individuare l'errore, per cui l'informazione errata viene trascritta con conseguenze più o meno gravi; il cambio di una base azotata può dare un differente aminoacido o un codice non-senso, che interrompe la sintesi proteica, ma anche non provocare nulla se il nuovo codice è per lo stesso aminoacido (il codice genetico è un codice degenerato). Se un aminoacido diverso viene introdotto in una proteina l'attività della stessa potrà essere più o meno modificata (negativamente la maggior parte delle volte, positivamente qualche rara volta, ed in quest'ultimo caso il mutante potrà risultare favorito nella selezione). Se il nuovo codon derivante dalla sostituzione di un singolo nucleotide non codifica per alcun aminoacido, una volta giunto a questo livello, il processo di trascrizione si arresta: se ciò avviene subito dopo l'inizio del gene, l'assenza pressoché totale della proteina ha generalmente gravi conseguenze nell'organismo mutante. Altro tipo di mutazione puntiforme è la perdita di un nucleotide (delezione); in questo caso l'rnapolimerasi non ha più la corretta chiave di lettura (reading frame) e tutti i codon a valle della mutazione (e quindi i corrispondenti aminoacidi) assumono significati diversi. Questo tipo di mutazione viene definita frameshift. Le stesse conseguenze si hanno per l'inserzione di un nucleotide. In certi casi possono andare perduti o essere inseriti interi tratti di DNA. Si indicano con il termine di introsoni o trasposoni dei tratti di DNA più o meno lunghi, con sequenze terminali costanti, in grado di spostarsi da un punto ad un altro del genoma: la loro inserzione generalmente abolisce l'attività del gene. E' stato osservato che le coppie di nucleotidi non mutano tutte con la stessa frequenza: in certi siti la probabilità di mutazione è fino a 100 volte più elevata che in altri ("hot spots", cioè "punti caldi"). Un esempio di hot spot è il gene lact di E. coli: c'è un punto, a 200 basi dall'inizio del gene, dove la citosina è metilata in posizione 5'; normalmente la citosina è trasformata dalla desaminazione ossidativa in uracile, che viene riconosciuto come estraneo al DNA, allontanato e risostituito da citosina: la 5-metil-citosina è però trasformata dalla desaminazione ossidativa in timina, che è una normale base del DNA: ne consegue che un filamento resta normale mentre quello mutato, nella replicazione, avrà un appaiamento timina-adenina invece che citosina-guanina. L'RNA. L'informazione genetica contenuta nel DNA controlla la sintesi delle proteine: tale informazione viene trascritta in mrna e trasferita dal nucleo ai ribosomi, dove l'mrna fornisce il messaggio per la sintesi della proteina; l'rna è quindi il tramite tra il DNA e le proteine: senza di esso l'informazione genetica rimarrebbe inerte e non potrebbe essere espressa. A differenza di quanto visto nel DNA, nell'rna il filamento è singolo invece che doppio, nei nucleotidi è presente l'uracile al posto della timina, lo zucchero è il ribosio invece che il desossiribosio; nel desossiribosio il gruppo chimico legato al carbonio in posizione 2 è un atomo di idrogeno, mentre nel ribosio nella stessa posizione è presente un ossidrile. La scelta evolutiva del DNA come molecola deputata alla conservazione dell'informazione genetica è legata alle differenze chimiche esistenti fra DNA ed RNA; infatti, quando i ribonucleotidi sono uniti a formare l'rna, l'ossidrile in posizione 2 del ribosio rimane libero, e ciò rende l'rna meno stabile del DNA dal punto di vista chimico: in soluzione acquosa l'rna va incontro a rapida idrolisi. Negli esperimenti che tendono a ricostruire in laboratorio il "brodo primordiale" da cui si ritiene abbia avuto origine la vita, si ha prima la polimerizzazione dell'rna: ciò fa ritenere che l'rna abbia evolutivamente preceduto il DNA, il quale sarebbe originato da una trascriptasi inversa (DNApolimerasi-RNAdipendente) ed avrebbe in seguito soppiantato il DNA grazie alla sua maggiore 5

6 stabilità, che lo rende intrinsecamente più adatto per conservare l'informazione per lunghi periodi di tempo. LA TRASCRIZIONE. La trascrizione avviene ad opera della RNApolimerasi; la RNApolimerasi si lega al DNA in corrispondenza di un promotore, il quale è differente per i vari geni ma è sempre caratterizzato da una sequenza costante di 6 basi azotate (TATAAT). La formazione dell'rna è analoga a quella del DNA, ma non c'è bisogno di un primer; il verso della sintesi è sempre lo stesso (sul filamento 5'-3'). La sintesi dell'mrna inizia quando l'rna polimerasi comincia a trascrivere il DNA nucleotidi a valle della sequenza TATAAT. L'RNA polimerasi srotola per un breve tratto la doppia elica di DNA ed inizia la trascrizione: l'enzima si muove lungo il DNA aggiungendo i ribonucleotidi (complementari ai desossiribonucleotidi del DNA) al 3' del nucleotide terminale del filamento nascente di RNA. Prima che la lunghezza del trascritto abbia superato i 30 nucleotidi, l'estremità 5' libera del filamento di RNA neosintetizzato viene ricoperta da una specie di struttura protettiva di guanosina metilata, legata per mezzo di un gruppo trifosfato. La trascrizione continua finché l'enzima non oltrepassa una sequenza del DNA che rappresenta il segnale di termine della trascrizione stessa (in genere AAUAAA): circa 20 nucleotidi più a valle il trascritto viene scisso ed un enzima aggiunge una coda di adenin-nucleotidi all'estremità 3' del trascritto (poli-a). Nei procarioti si ha una sola RNA-polimerasi, mentre negli eucarioti si hanno tre diversi enzimi: uno per la produzione di mrna, uno per la produzione di rrna ed uno per la produzione di trna. LA TRADUZIONE. Il trascritto primario passa dal nucleo al citoplasma e viene tradotto a livello di ribosomi; intervengono a questo punto l'rna transfer (trna) e l'rna ribosomiale (rrna). Il trna è un filamento corto, di nucleotidi; esso ha una caratteristica struttura ripiegata, e lega ad una estremità un determinato aminoacido ed alla estremità opposta presenta un'ansa con l'anticodon per quell'aminoacido, ovvero il codon complementare; l'estremità a cui si lega l'aminoacido è sempre la stessa per tutti gli aminoacidi, in quanto è lo stesso enzima che lega l'aminoacido al trna a farsi carico del riconoscimento dell'anticodon. L'rRNA si trova legato ad alcune proteine insieme alle quali costituisce le due subunità ribonucleoproteiche (una maggiore ed una minore) che formano il ribosoma; nei procarioti il ribosoma ha un coefficiente di sedimentazione (misurato in Svedberg) di 70 S e le due subunità hanno rispettivamente 50 S e 30 S; negli eucarioti il coefficiente di sedimentazione del ribosoma è di 80 S e quello delle due subunità di 60 S e di 40 S: nella subunità grande ci sono 3 molecole di RNA, (una grande, di circa 4500 nucleotidi, due piccole di circa 160 e 120 nucleotidi), mentre nella piccola c'è una sola molecola di RNA (di circa 1800 nucleotidi). L'RNA messaggero (mrna) "scivola" sull'rrna un codon alla volta e ad uno ad uno si uniscono alla catena proteica nascente i vari aminoacidi portati dall'trna che ha l'anticodon corrispondente; in genere nei procarioti c'è all'inizio della sintesi sempre lo stesso aminoacido, che successivamente viene allontanato. La sequenza dei codon sull'mrna, dipendente dall'informazione contenuta nel DNA, determina a sua volta l'ordine degli aminoacidi nella proteina. LA MATURAZIONE DELL'RNA. Sin dal 1960 esperimenti effettuati marcando con isotopi radioattivi l'mrna hanno dimostrato che alcune molecole di mrna isolate a livello nucleare hanno dimensioni superiori (ad esempio, 5.000bs) a quelle dei medesimi mrna isolati dopo il trasferimento nel citoplasma (ad esempio, 1.000bs): infatti l'mrna marcato non si riibridizza completamente con il DNA denaturato, perché delle parti di DNA non si ritrovano nell'mrna citoplasmatico. I precursori nucleari vengono tagliati e riuniti per dare origine agli RNA maturi, senza alterazioni all'estremità protettiva di guanosina metilata ed alla coda di 6

7 poli-a, che si ritrovano anche nell'mrna maturo. Questo processo di maturazione dell'mrna è indicato con il termine di splicing. I geni degli organismi eucarioti sono discontinui, costituiti cioè da tratti effettivamente codificanti (indicati con il termine di esoni) inframmezzati da sequenze che non hanno alcuna funzione codificante (introni). Sia gli esoni che gli introni vengono trascritti dall'rna-polimerasi in un trascritto primario: tale trascritto subisce una maturazione a livello nucleare che comporta l'allontanamento delle porzioni introniche; l'mrna maturo che arriva ai ribosomi contiene pertanto solamente la porzione esonica, l'unica ad essere effettivamente espressa. Lo splicing dell'mrna non avviene invece nei batteri dove i geni sono continui. Durante il processo di maturazione, un ruolo fondamentale nell'allontanamento degli introni è svolto dalle snrnp, costituite da un gruppo di molecole proteiche legate ad un'unica molecola di RNA: si tratta di un RNA particolare, ricco di uracile (RNA U). Nel trascritto primario, nel punto di passaggio tra esoni ed introni, esistono delle sequenze caratteristiche ricche di guanina ed uracile: le snrnp si legano a tali sequenze G-U e tagliano la catena RNA in quel punto. Gli introni vengono così allontanati mentre gli esoni vengono saldati tra loro dando origine all'rna messaggero maturo. Agli scienziati che hanno scoperto la discontinuità dei geni è stato assegnato nel 1993 il premio Nobel. L'ESPRESSIONE DEI GENI. Le scoperte sulla discontinuità funzionale dei geni sono state fatte nel corso delle ricerche sull'espressione dei geni: le diverse cellule di un organismo hanno tutte lo stesso DNA, per cui come si spiegano le differenze? Un problema di fondamentale importanza nello studio del genoma è rappresentato dalla regolazione dell'espressione genica: è chiaro che una cellula, in un determinato istante, non contiene tutti gli mrna codificati dal suo DNA, ma trascrive alcuni geni e produce le proteine corrispondenti solo quando ne ha la necessità. Nei procarioti non ci sono introni (quelli identificati sono trascurabili), mentre negli eucarioti si è posto immediatamente il problema di stabilire quale importanza può avere la maturazione dell'rna nella regolazione dell'espressione genica. Secondo una teoria si ipotizzava che la scelta di quale proteina produrre, in quale cellula ed in quale momento, fosse legata alla maturazione differenziale di un'unica molecola di mrna trascritta in maniera totale ed indifferenziata in tutte le cellule: ad esempio, un trascritto contenente più esoni avrebbe potuto essere tagliato e poi nuovamente saldato in modo da includere nell'mrna maturo tutti o solo alcuni degli esoni, purché fossero conservati gli esoni alle estremità del gene (contenenti il "cappuccio" protettivo di guanosina metilata in posizione 5' e la coda di poli-a in posizione 3'), e che gli esoni fossero rimasti nello stesso ordine. Sono stati effettivamente scoperti diversi geni che si comportano in questo modo: si tratta di "unità di trascrizioni complesse", che codificano per più mrna (ottenuti mediante splicing differenziale). Un esempio di unità di trascrizioni complesse è rappresentato dal segmento di DNA che codifica per la calcitonina, ormone prodotto a livello della tiroide: è stato osservato che tale sequenza si ibridizza anche con un mrna prodotto nell'ipofisi. Il trascritto primario che si trova nelle cellule tiroidee si ritrova anche a livello dell'ipofisi e contiene due siti poli-a; nella tiroide viene accettato come segnale terminale il primo sito poli-a: i primi quattro esoni vengono saldati e danno origine ad un mrna che codifica per la calcitonina; nell'ipofisi invece lo stesso trascritto primario termina in corrispondenza del secondo sito poli-a: al momento della saldatura il quarto esone viene allontanato insieme agli introni, mentre vengono uniti il quinto ed il sesto esone, dando così origine all'mrna per una proteina, completamente diversa dalla calcitonina, nota come CGRP. Con la scoperta delle più recenti tecniche di biologia molecolare si è accertato che l'importanza dello splicing nella regolazione dell'espressione genica è relativa; la regolazione è effettuata essenzialmente attraverso un controllo della trascrizione primaria, quando alcuni geni vengono trascritti ed altri no: non si ha tanto una trascrizione indifferenziata seguita da una maturazione differenziale dell'mrna, ma direttamente una trascrizione differenziale del DNA. L'importanza della trascrizione differenziale è stata dimostrata isolando e clonando dei geni; vennero isolate e clonate delle sequenze nucleotidiche per proteine specifiche del fegato e per delle proteine non-specifiche; questi geni sono stati posti su un filtro di nitrocellulosa e messi a contatto con il trascritto primario, marcato con isotopi radioattivi, di 7

8 cellule epatiche, renali e cerebrali: il trascritto delle cellule epatiche si ibridizzava sia con i geni per le proteine del fegato che con i geni delle proteine non specifiche, mentre il trascritto primario delle cellule renali e quello delle cellule cerebrali si ibridizzava solo con le sequenze nucleotidiche per le proteine non-specifiche. Come è controllata l'attivazione e la disattivazione del gene? E' questo un problema particolarmente sentito da chi si occupa di ingegneria genetica, perché inserire un gene estraneo in un genoma (animali transgenici) è relativamente semplice, ma controllare l'espressione di questo gene è un problema ancora non risolto. Le conoscenze disponibili riguardano soprattutto i procarioti. Esperimenti condotti principalmente sul fago lambda hanno evidenziato come l'espressione genica può essere controllata da proteine regolatrici che si legano a siti specifici del segmento di DNA: tali proteine vengono indicate con il termine di repressori. Il repressore si lega ad una specifica sequenza di DNA denominata operatore, situata immediatamente accanto al promotore, cioè accanto a quella breve sequenza di DNA che rappresenta il punto di attacco dell'rna polimerasi e quindi di inizio della trascrizione: la presenza del repressore sul sito operatore impedisce il legame della RNA polimerasi al promotore e di conseguenza la trascrizione del gene. Nel fago lambda è stato anche evidenziato un meccanismo di autoamplificazione: l'rna polimerasi non si lega al promotore del gene ma al promotore del gene per la proteina che funge da repressore. Molto spesso un solo repressore controlla l'espressione coordinata di più geni: tale sistema nel suo complesso viene definito operone. Un esempio è l'operone lact di E. coli, che comprende tre geni (Z, Y, ed A) responsabili del catabolismo del lattosio attraverso la sintesi di tre enzimi (ß-galattosidasi, permeasi, transacetilasi). Il gene lact di E. coli è un sistema inducibile: se non c'è lattosio nel mezzo, il repressore si lega all'operatore ed inibisce la trascrizione dei geni per le tre proteine enzimatiche che dovrebbero catabolizzare il lattosio; se invece nel mezzo c'è lattosio, questo si lega al repressore che, così modificato nella forma, non è più in grado di inattivare l'operatore: l'rna polimerasi trascrive l'informazione per i tre geni Z, Y ed A in un'unica molecola di RNA policistronico. L'operone lact è un esempio di sistema inducibile nel senso che la sintesi di un enzima è indotta dalla presenza del suo substrato. Esistono anche dei sistemi reprimibili, nei quali il prodotto finale determina il blocco della trascrizione dei geni per gli enzimi responsabili della sintesi del prodotto stesso: un esempio è l'operone trp, responsabile della sintesi del triptofano. Il meccanismo di controllo dell'espressione genica di un sistema reprimibile comporta la presenza sul DNA di un'altra regione specifica denominata attenuatore, responsabile di una riduzione della velocità di trascrizione dell'mrna in presenza del prodotto finale (triptofano): l'assenza di questa regione in alcuni mutanti è associata ad una produzione continua e massiccia di triptofano. GLI INTRONI, GLI ESONI E L'EVOLUZIONE. Fino agli anni '60 la maggior parte degli studiosi riteneva che i batteri, per la loro semplicità, dovessero essere simili alle prime cellule ancestrali e che gli eucarioti si fossero evoluti da procarioti primordiali. Lo splicing del trascritto primario, costantemente presente negli eucarioti, avviene molto raramente nei procarioti che non contengono, se non in quantità trascurabile, introni: di conseguenza gli esoni venivano considerati come delle complessità introdotte relativamente tardi nel corso dell'evoluzione. La prima cosa ad essere messa in dubbio fu che i batteri fossero effettivamente gli organismi più antichi. Woese e collaboratori tracciarono una mappa delle genealogie cellulari confrontando le sequenze nucleotidiche degli rrna di differenti organismi; si utilizzava una particolare subunità 16 S dell'rrna perché è una struttura precedente la stessa cellula ed è una molecola che non ha mai mutato la sua attività funzionale; si digeriva l'rrna con ribonucleasi che spezzavano la catena in corrispondenza della guanina e si confrontavano i frammenti di almeno 6 basi azotate (una ventina di frammenti circa): più le sequenze sono conservate, maggiore è la probabilità che gli organismi discendano da un antenato comune. Ci si rese conto che gli archibatteri, un piccolo gruppo di metanobatteri, non rientravano nell'albero filogenetico dei batteri classici: essi non erano più vicini dal punto di vista filogenetico agli eubatteri di quanto lo fossero agli eucarioti. Si è quindi ipotizzata l'esistenza di tre linee evolutive separate, discendenti da un unico progenitore comune definito 8

9 "progenote": eubatteri ed archibatteri sarebbero evoluti direttamente dal progenote, mentre gli eucarioti deriverebbero dalla fusione di un eucariote ancestrale con due tipi di eubatteri; l'eucariote ancestrale avrebbe dato origine al nucleo della cellula, mentre mitocondri e cloroplasti sarebbero derivati rispettivamente dai solfobatteri purpurei e dai cianobatteri (determinando le sequenze dell'rrna contenuto nei mitocondri si è dimostrato che sono analoghe a quelle dei solfobatteri purpurei, mentre le sequenze dell'rrna dei cloroplasti sono analoghe a quelle dei cianobatteri). L'origine di eucarioti e procarioti è quindi da considerare indipendente e contemporanea; essendo il nucleo degli eucarioti antico quanto i batteri, ed essendo il nucleo la sede dove avviene la maturazione dell'mrna, non vi è alcuna ragione per ritenere che tale processo abbia avuto inizio solo più tardi. Addirittura la maturazione dell'rna potrebbe essere iniziata ancora prima della comparsa del progenote: probabilmente sin dall'inizio la molecola era caratterizzata dalla presenza di esoni ed introni e ciò sembrerebbe confermato anche dalla posizione che introni ed esoni occupano in molti geni moderni; ad esempio, nei geni che codificano per le emoglobine, per le immunoglobuline e per altri enzimi, ogni esone codifica per un dominio della molecola proteica riconoscibile come unità funzionale: è poco plausibile ritenere che l'introduzione degli introni avvenuta casualmente possa aver determinato questa precisa suddivisione e molto più probabile invece uno sviluppo graduale dello splicing che avrebbe portato alla sintesi di proteine più grandi e più utili. E' molto probabile che i geni dei primi archibatteri ed eubatteri fossero discontinui e che, attraverso un'evoluzione durata innumerevoli generazioni, i batteri oggi esistenti abbiano eliminato quasi totalmente le sequenze non codificanti dal loro genoma; il DNA degli eucarioti, uomo compreso, si è invece evoluto più lentamente (maggior intervallo di generazione): i geni degli eucarioti presentano quindi "inutili" introni ed il sistema di traduzione è rimasto ancorato ad un complesso procedimento di maturazione, evolutivamente già superato dalle cellule procariote. Non tutti gli studiosi condividono però queste ipotesi: alcuni ritengono che l'organizzazione del genoma in esoni ed introni sia evolutivamente più recente. 3. LA GENETICA FATTORIALE Tra le varie specializzazioni della genetica, quella detta fattoriale o formale (o, più imprecisamente, Mendeliana) studia l eredità e le variazioni dei caratteri qualitativi, per cui si parla di eredità qualitativa o semplice e di variazione di tipo qualitativo. La definizione di un carattere qualitativo non è sempre facile e molto spesso essa risponde più a criteri soggettivi creati dagli studiosi che non alla realtà biologica del carattere stesso. Per poter dare le basi di studio della genetica fattoriale bisogna cercare di definire nel modo più rigoroso possibile che cosa si debba intendere per carattere qualitativo. Alla trattazione dell argomento si fa procedere una serie di definizioni necessarie per affinare la terminologia che sarà utilizzata. ALCUNE DEFINIZIONI Prima di continuare riteniamo opportuno dare alcune informazioni che ci saranno utili nel prosieguo. Il gene rappresenta l unità funzionale dell eredità; ciascun gene è formato da una sequenza di DNA che porta l informazione per la costituzione di un particolare polipeptide. Per locus si intende la localizzazione fisica di un gene su di un cromosoma: in un locus un individuo ha due geni omologhi provenienti ciascuno da uno dei due genitori. Un locus si dice polimorfo quando è rappresentato da due o più geni alleli. Tali alleli derivano da cambiamenti occasionali di un presunto gene normale (o non alterato), detti mutazioni. L organismo che porta il gene alterato è chiamato mutante; l organismo che porta il gene normale, tipo selvaggio. Due geni sono alleli quando sono situati nello stesso locus ed hanno un azione differente su di uno stesso carattere (ad es. in caso di locus biallelico saranno all eliche le coppie Aa e aa). 9

10 Un locus è monomorfo quando è rappresentato solo da uguali; due geni uguali si dicono identici quando hanno la stessa origine genealogica, cioè derivano da un gene presente in un antenato comune ai due individui portatori o trasmettitori dei due geni. Il fenotipo è l espressione fisica di un carattere in un individuo in un ambiente dato; può essere osservato e misurato. Il genotipo di un individuo per un determinato carattere è dato dall insieme dei geni che contribuiscono all espressione di questo carattere. Un individuo è omozigote in un locus se i due geni che esso possiede sono uguali (AA, aa); è eterozigoti se i due geni che esso possiede sono alleli (A e a). Nella genetica fattoriale, per incrocio si intende la riproduzione tra varietà diverse di individui; si parlerà successivamente di incrocio monoibrido per gli incroci implicanti una sola coppia di alleli, di incrocio di ibrido quando le coppie di alleli sono due, di incrocio poliibrido quando l incrocio interessa più coppie di alleli. La generazione parentale (P), rappresenta la generazione di partenza nell incrocio: ad essa seguono la prima generazione filiale o F1, la seconda o F2 ecc. Per back-cross si intende l accoppiamento tra un individuo F1 con uno dei suoi genitori o con un individuo dello stesso genotipo del genitore: il back-cross può essere perciò paterno o materno a seconda del genitore interessato. I CARATTERI QUALITATIVI Perché si possa definire qualitativo un carattere devono sussistere due condizioni, relative la prima al sistema ereditario che ne è alla base, la seconda all espressione della variabilità dello stesso. Un carattere qualitativo è determinato da un sistema ereditario semplice, cioè costituito da uno o pochi loci che interagiscono tra loro. I geni appartenenti al(ai) locus (i) hanno un azione importante, sempre identificabile e definibile. Per tale proprietà tali geni sono detti maggiori in confronto ad altri, detti minori perché la loro azione è scarsamente rilevante e di difficile valutazione; questi ultimi intervengono nell eredità dei caratteri qualitativi. Quando esiste variazione del carattere nella popolazione, questa si presenta sempre in maniera discontinua. Le varie espressioni del carattere possono cioè essere raggruppate in classi ben separabili le une dalle altre e sempre facilmente identificabili. È sempre possibile perciò ottenere una classificazione del carattere in fenotipo ben separabili. All opposto, una gran numero di caratteri presenta una variabilità che non può essere suddivisa in fenotipi ben definiti perché essa è costituita da una gamma continua di fenotipi con tutti i possibili intermediari da un tipo all altro; tali caratteri sono detti a variazione continua o quantitativi. Nei caratteri qualitativi, lo studio del meccanismo ereditario si basa sull analisi della discendenza in incroci individuali conosciuti e determinati; essi prendono il nome di segregazioni. La variabilità del carattere della popolazione si basa sull analisi per enumerazione dei soggetti di ciascuna classe e su calcoli di proporzioni. La definizione di carattere qualitativo necessita perciò della contemporanea presenza delle condizioni di eredità semplice e di variazione discontinua. Se prese individualmente, infatti, esse non sono in grado di definire con sicurezza un carattere qualitativo per l esistenza di due situazioni particolari e cioè eredità semplici che si presentano a variazione continua e, all inverso, caratteri pologenici (e quindi ad eredità complessa) che presentano un espressione fenotipica tipicamente discontinua i cosiddetti caratteri a soglia. Gli esempi del primo tipo sono stati descritti soprattutto nella genetica vegetale ed un autore, Weber ( a,b) ha anche messo a punto un sistema di analisi statistica capace di evidenziare tale situazione sia nelle segregazioni monoibride che di ibride. Un esempio di tale situazione è rappresentata dalla distribuzione dell attività della fosfatasi acida del globulo rosso. L analisi elettroforetica dell enzima eritrocitari fosfatasi acida mostra che si possono chiaramente distinguere sei genotipi determinati da tre alleli. Gli alleli danno luogo ad enzimi che possiedono qualche differenza nella loro attività enzimatica: A è il meno attivo, B ha un attività intermedia. C è il più attivo. Gli individui eterozigoti mostrano attività che sono quasi esattamente intermedie fra quelle dei rispettivi 10

11 omozigoti. Ciascuno di tali genotipi presenta perciò un attività enzimatica che si distribuisce in maniera continua; i fenotipi però non possono venire distinti sulla base della sola attività enzimatica perché le distribuzioni tendono a sovrapporsi. Se si considera l attività edematica della popolazione generale senza distinguere i diversi genotipi, si ottiene una distribuzione perfettamente continua che maschererebbe completamente l eredità semplice che ne è alla base. Di maggiore interesse è l altra eccezione rappresentata dai caratteri a soglia. Sono infatti di questo tipo alcuni caratteri di grande interesse zootecnico, quali la predisposizione individuale a varie malattie, la prolificità che compare in specie tendenzialmente unipare e la mortalità perinatale e neonatale intesa nel suo insieme. Fanno parte di tale gruppo anche alcuni caratteri anatomici quali il numero di vertebre nel topo e, forse, nel suino domestico e il numero di data soprannumerarie del topo. Si definiscono a soglia quei carattere che non mostrano una variazione continua, ma che in un individuo sono presenti o assenti. Al di sotto di tale discontinuità fenotipica, però, esiste una variazione continua nella disposizione a manifestare questi caratteri; vi è inoltre ciascuna combinazione genotipica è soggetta all influenza dell ambiente, per cui la distribuzione della disposizione stessa è il frutto dell interazione tra i genotipi e l ambiente. La soglia è perciò un punto lungo la distribuzione della disposizione che separa le classi fenotipiche; quando cioè la disposizione si trova al di sotto della soglia l individuo presenta una certa espressione fenotipica; quando invece è al di sopra, l individuo presenta l altra espressione. Esistono caratteri che presentano più di due classi fenotipiche per cui esistono lungo la curva di distribuzione due o più soglie. Ritornando perciò alle definizioni di partenza, per poter parlare di carattere qualitativo bisogna dimostrare che la variazione discontinua sia legata ad un determinismo ereditario semplice. Tale dimostrazione può essere ottenuta attraverso studi di segregazione dei caratteri (nel caso in cui si dimostri che essi producano proporzioni fenotipiche particolari, ripetibili e quindi prevedibili), sia nel caso di rapporti allelici all interno di un locus sia nel caso di analisi dell azione di più loci contemporaneamente, cioè della segregazione di più caratteri diversi gli uni dagli altri. Le proporzioni a cui fare riferimento sono parecchie; le prime furono introdotte all inizio del 900 da un gruppo di genetisti europei e statunitensi che riscoprirono i lavori realizzati a metà del secolo precedente da un monaco boeme, Gregorio Mendel, dal quale la branca della genetica dei caratteri semplici ha preso nome genetica mendeliana. L originalità degli studi di Mendel riposa essenzialmente sul metodo utilizzato per gli studi, e cioè sull utilizzo di segregazioni e sulla valutazione statistica degli stessi. A partire dai suoi studi si è poi creato un vero e proprio corpus dottrinale, che ha progressivamente rivisto, alla luce delle sempre maggiori conoscenze, le basi teoriche dei caratteri e, soprattutto, è riuscito ad associare l analisi del comportamento ereditario dei caratteri alla realtà genetica dei individui. Solo per memoria storica si deve ricordare che la teorizzazione mendeliana era basata su tre postulati: - Il principio del carattere unità, secondo il quale ciascun carattere è determinato dall azione di un solo fattore ereditario che viene trasmesso alla discendenza per mezzo della riproduzione sessuale. - Il principio della purezza dei gameti, secondo il quale i gameti maschili e femminili prodotti dai individui ibridi sono puri, cioè contengono uno e uno solo dei geni determinanti i due caratteri di una coppia allelomorfa. - Il principio della indipendenza dei caratteri, per il quale ogni carattere è indipendente rispetto agli altri. Dei tre postulati rimane valido solo il secondo: gli altri due sono stati negati dai genetisti attraverso gli studi successivi. LE LEGGI DELLA TRASMISSIONE EREDITARIA a) LA TEORIA CROMOSOMICA DELL EREDITÀ E LE CONSEGUENZE A LIVELLO GENETICO DELLA MEIOSI Tutte le leggi della trasmissione ereditaria dei caratteri trovano la loro giustificazione in due situazioni particolari: a) la ripartizione dei cromosomi negli individui disploidi; 11

12 b) le conseguenze della meiosi a livello genico. Il corredo cromosomico di un individuo diploide è costituito da coppie di cromosimini omologhi, di derivazione uno paterna e l altro materna. Ciò fa sì che ogni individuo possieda per un locus qualsiasi sempre due geni, uno portato dal cromosoma paterno e l altro da quello materno. Le situazioni che si possono presentare sono diverse a seconda dei geni che si incontrano. Innanzi tutto i due geni possono essere uguali, cioè avere stessa sequenza nucleotidica e stessa funzione sintetica, per cui l individuo sarà genotipicamente omozigote. Oppure l individuo può portare due geni diversi, cioè due geni alleli (o semplicemente due alleli), quindi esso sarà eterozigote. Le possibilità di omozigosi ed eterozigosi saranno in relazioni al polimorfismo esistente all interno del locus nella popolazione. Ciò non toglie che ogni singolo individuo potrà avere due e solo due geni contemporaneamente. Fa eccezione alla regola dell omologia cromosomica la coppia eterocromosomica, che nei mammiferi è presente nei maschi ed è costituita da un cromosoma X e da uno Y, completamente diversi tra loro. Nei volatili la coppia eterocromosomica è invece femmine. Una coppia di cromosomi porta generalmente un numero piuttosto elevato di loci, che rappresentano un gruppo di associazione, i gruppi saranno perciò tanti quante sono le coppie cromosomiche, cioè n, ad eccezione del maschio nei mammiferi e delle femmine nei volatili, dove saranno n-1. Poiché il cromosoma si trasmette interno dai genitori ai figli, è evidente che i loci appartenenti allo stesso gruppo di associazione saranno trasmessi insieme. È ampiamente risaputo che per meiosi si intende un processo di divisione cellulare che interessa le cellule germinale, cioè le ovocellule e gli spermatozoi. Il significato cromosomico di tale divisione riposa nella possibilità di produrre gamete dotati di un corredo ridotto della metà rispetto a quello delle cellule germinale indifferenziate; solo un dei due cromosomi omologhi di ciascuna coppia, cioè entra nella costituzione dei gamete. L unione di due gamete aploidi (cioè a numero n di cromosomi) permette la ricostruzione di uno zigote a corredo diploide. Il passaggio casuale dei cromosomi di ciascuna coppia nei gameti ha conseguenze importantissime nella distribuzione dei geni. Se un individuo è eterozigote, infatti, produrrà due tipi di cromosomi e quindi due tipi di gameti, uno portatore solo del primo allele e l altro solo del secondo. Se esistono nello stesso gruppo di associazione altri loci polimorfi, ciascun allele di ogni locus si combinerà con gli alleli degli altri nel cromosoma in maniera del tutto casuale, ciascun cromosoma cioè è portatore di una combinazione all elica del tutto originale rispetto a ciascun altro cromosoma della sua coppia; i gameti prodotti non sono perciò equivalente da un punto di vista genetico, ma sono portatori di forme geniche differenti. In un individuo il cui numero di cromosomi è uguale a X, il numero Y totale di combinazioni cromosomiche possibili è pari a: Y = 2 x. La meiosi è importante anche per il fenomeno del crossing-over cioè dello scambio di frazioni di DNA tra cromosomi omologhi. Tale fenomeno permette infatti di creare nuove combinazioni gametiche rispetto a quelle che si avrebbero normalmente e quindi rappresenta un importante fattore di variabilità nelle popolazioni. B) MECCANISMI DI CREAZIONE DELLE SERIE POLIALLELICHE Una buona parte dei loci che costituiscono il menoma degli individui eucaristici e procariatici presentano più forme geniche, per cui parleremo di serie poliallelica quando in uno stesso locus sono identificabili uno o più alleli. Bisogna ricordare naturalmente che un individuo normale non può portare, nelle specie diploidi, più di due alleli differenti per ogni locus, posti ciascuno su uno dei due cromosomi omologhi. I meccanismi attraverso i quali si creano serie polialleliche sono attualmente abbastanza conosciuti. Qui di seguito verranno rapidamente ricordati. Le mutazioni geniche o mutazioni puntiformi rappresentano modificazioni chimiche nucleotidiche dovute a sottrazione addizione o altre modifiche riguardanti singoli geni o piccoli gruppi di geni. 12

13 L alterazioni di almeno un gene di un cromosoma si può definire mutazione quanto è stabile, compatibile con la vita e trasmissione alle cellule figlie. Questa proprietà fanno sì che la mutazione rappresenti un fonte importante di variabilità genetica tra gli individui di una popolazione. Esistono mutazioni somatiche e mutazioni germinali: le prime avvengono in cellule somatiche del corpo e non sono trasmesse alla discendenza, le seconde si verificano in cellule germinali del testicolo o dell ovario e si possono trasmettere alla discendenza. Gli individui nei quali avviene una mutazione somatica vengono definiti mosaici genetici perché hanno due cloni cellulari geneticamente distinti. Le mutazioni geniche riconoscono tre meccanismi: a) La sostituzione di basi una coppia di basi viene sostituita da una coppia differente. La sostituzione provoca una sostituzione aminoacidica. b) La delezione di basi la lettura scala di una base azotata. c) L inserzione di basi si ha uno spostamento della lettura del codice. La delezione e l inserzione cambiano il gene per cui si ha la sintesi di una proteina diversa; in certi casi, la delezione blocca la normale sintesi proteica. La sostituzione è invece abbastanza conservativa ed è la causa, insieme la crossing-over, della variabilità genetica all interno di una popolazione. Gli effetti della sostituzione aminoacidica dipendono dalla regione polipeptidica ove essi avvengono. Tali cambiamenti possono essere drastici, lievi o addirittura nulli. Quest ultimo evento si può verificare quando: - la sostituzione avviene in una regione che può tollerarla senza subire cambiamenti; - la sostituzione avviene tra aminoacidi simili (ad esempio, leucina con isoleucina); - la sostituzione avviene tra codoni che codificano tutti per lo stesso aminoacido. In tutti questi casi il fenotipo risulterà normale la mutazione verrà svelata mediante elettroforesi. Altre situazioni portano, invece a risultati più evidenti. Una mutazione si dice non senso (nonsense) quando crea, in una regione codificante, un codono di terminazione; il gene perde perciò la capacità codificante. La mutazione frame-shift provoca lo slittamento del codice di lettura. Infine, la mutazione di senso (missense), può esistere in due situazioni differenti, la trasversione e la transizione. La prima consiste in una sostituzione di basi puriniche con basi pirimidiniche, e viceversa; la seconda nella sostituzione di purine epirimidine tra loro. In entrambi i casi, la mutazione di senso produce un nuovo gene. È soprattutto attraverso questo meccanismo che la mutazione genica diviene la principale causa della formazione delle serie polialleliche: all interno di una popolazione, cioè uno stesso locus non contiene sempre lo stesso gene selvaggio, ma si arricchisce di una serie più o meno numerosa di alleli, con conseguente aumento della variabilità della popolazione stessa. Generalmente l allele selvaggio rimane però il più frequente. Le mutazioni possono essere classificate in varie maniere; accenneremo alle principali. Un primo sistema può essere rappresentato dall età d insorgenza, nella quale il criterio è rappresentato dall in cui compare il fenotipo associato alla mutazione. In funzione degli effetti letali che una mutazione può provocare possiamo avere: - mutazioni letali, cioè incompatibili con la vita del soggetto o capaci di provocare sterilità maschile o femminile (letalità di tipo evoluzionistico); - mutazioni condizionali, cioè mutanti letali che si esprimono solo in determinati ambienti (sono infatti temperatura-sensibili, per cui in certi casi la temperatura crea una condizione restrittiva, in altri crea una condizione permissiva ). In relazione alla capacità di influenzare altre mutazioni si distinguono: - mutazioni Enhancer, le quali intensificano gli effetti fenotipici di altre mutazioni; - mutazioni soppressive, che riducono, invece, questi stessi effetti. In entrambi i casi si parla di mutazioni modificatrici. Le mutazioni instabili costituiscono una categoria di mutazioni individuata da pochissimi anni; esse sono responsabili di alcune malattie ereditarie dell uomo, tra cui il ritardo mentale conseguente alla fragilità del cromosoma X e la distrofia miotonia. Nel primo caso il meccanismo della mutazione 13

14 consiste in due fasi successive: la prima, chiamata permutazione, interessa solo i soggetti che trasmettono la malattia senza esserne colpiti (i maschi normali portatori e la maggior parte delle femmine portatrici); la seconda, detta mutazione completa interessa tutti i soggetti colpiti. Le permutazioni si manifestano con un moderato aumento della lunghezza di un piccolo frammento di DNA mentre le mutazioni complete consistono in un aumento significativo della grandezza del frammento precedentemente aumentato durante la maturazione delle cellule sessuali femminili, in conseguenza all instabilità della regione del DNA che porta il gene in questione. La mutazione completa si associa a mutilazione; del DNA limitrofo. Ciò che appare infine è una espansione progressiva di una parte di un gene, composta dalla ripetizione di tre nucleotidi (CGG). Gli uomini portatori di una permutazione la trasmettono a tutte le figlie senza eccezione; esse sono perciò tutte portatrici sane. Allorché una donna trasmette la permutazione, questa diviene spesso una mutazione completa, associata ad un ritardo mentale nel 100% dei figli maschi e nel 50% delle femmine. La mutazione instabile spiega nel caso del ritardo mentale associato a fragilità della X il particolare andamento di tale patologia che interessa circa un terzo delle femmine portatrici e, soprattutto, può essere trasmessa anche da maschi che non presentano né ritardo mentale né siti fragili. Nella distrofia miotinica il meccanismo è diverso; si tratta della ripetizione di trinucleotidi CTG nel gene che codifica per una proteina regolatrice, la proteina chinasi in questo caso però non si osserva un fenomeno tutto o niente (permutazione/mutazione), ma piuttosto un aumento della gravità della malattia con l aumentare della espansione. Inoltre, in questa mutazione manca la mutilazione del DNA. L instabilità di sequenze di DNA nella sindrome dello X fragile e nella distrofia mioclonica sembra legata alla lunghezza delle sequenze ripetute, ma al momento non è chiaro se essa interessa ogni sequenza lunga composta da motivi semplici o solamente certi motivi specifici, creando una conformazione anormale del DNA e, conseguentemente, delle difficoltà alla replicazione. I recenti progressi della genetica molecolare hanno dimostrato che la mutazione genica non è l unico meccanismo capace di provocare variazione genetica del DNA; per questo si parla di nuove fonti di variazioni genetiche. I principali fenomeni chiamati in causa sono: - la ricombinazione per omologia, nei due meccanismi del crossino-over illegittimo e della conversione genica; - i vari riarrangiamenti cromosomici; - la mobilizzazione di transposon (elementi genetici mobili); - la mobilizzazione di retrovirus; - la retrotrasposizione; - il trasferimento naturale dei geni tra specie diverse; - le cosiddette variazioni somaclonali. La ricombinazione per omologia rappresenta uno scambio di DNA tra sequenze all eliche portate ciascuna da due cromosomi omologhi. Si differenzia ulteriormente in crossing over ineguale e conversione gemica. Il crossing-over ineguale (ricombinazione ineguale) crea una situazione di asimmetria fra due cromosomi. Due sequenze di DNA, A e B, omologhe e ripetute in tandem si ricombinano in modo ineguale con conseguente asimmetria tra i due cromosomi: uno dei due, infatti, porta tre sequenze mentre l altro avendo subito una delezione ne avrà una sola. La ricombimnazione produce dei geni ibridi e si traduce in una ripartizione ineguale dei geni sui due cromosomi omologhi per amplificazioni e contrazioni di intere zone del menoma. Un esempio di crossing-over ineguale è l emoglobina detta lepore, che nell uomo provoca una anemia molto grave: essa è il risultato di una ricombinazione ineguale della famiglia multigenica dell emoglobina umana data da un appaiamento difettoso di due cromosomi omologhi durante la divisione meiotica di due geni al cromosoma numero 11. La conversione genica consiste in un trasferimento di una parte di un gene in un altro, con formazione di un gene chimerico. Poiché il gene donatore resta inalterato, si può supporre che tale trasferimento di DNA avvenga durante la sintesi del DNA nel corso della meiosi. Al termine del fenomeno della conversione genica, si avrà la presenza di geni normali su uno dei due cromosomi omologhi e la presenza, sull altro di un gene normale e di un gene chimerico. 14

15 La conversione genica è, probabilmente, un meccanismo relativamente generico che può realizzarsi sia tra due alleli sia tra sequenze ripetute codificanti e non. Essa provoca due effetti: introduce una grande variabilità ma nel contempo omogeinizza le sequenze in modo tale da provocare notevole vicinanza tra i membri di una famiglia multigenica. All opposto della ricombinazione per omologia, esiste anche una ricombinazione illegittima; essa riguarda segmenti di DNA che non hanno omologia di sequenze ed è frequente soprattutto nelle sequenze ridondanti. Il meccanismo d azione di una ricombinazione per omologia è abbastanza ben conosciuto. Una endonucleasi provoca una rottura cromosomica (Nick); partendo da tale punto i filamenti possono srotolarsi per un breve tratto per appaiarsi poi al filamento complementare dell altro duplex. Le regioni dove un filamento integro di uno dei due duplex si appaia con il filamento che ha subito la rottura dell altro duplex vengono definite eteroduplex; dopo la formazione degli eteroduplex gli scheletri di zucchero e fosfato dei filamenti sono saldati dalla DNA-LIGASI. Il cambiamento di struttura spaziale comporta la formazione di una struttura a forma della lettera greca chi. Si può comunque giungere alla riconversione della struttura a chi in due duplex separati per azione di nick di un altra endonucleasi in due dei filamenti, scambio fra questi e definitiva saldatura da parte della DNA-LIGASI. Il verificarsi della ricombinazione dipende dal modo in cui si risolve la struttura a chi: esistono all uopo due possibilità: a) la formazione di duplex non ricombinanti; b) la formazione di duplex ricombinanti. In entrambi i casi permangono aree di DNA aventi eteroduplex. Gli errori di appaiamento possono essere riparati: a) attraverso la correzione automatica nella successiva replicazione; b) attraverso il meccanismo del mismatch repair che consiste nell asportazione, dal filamento di DNA, del nucleotide erroneamente appaiato e nella sua sostituzione con quello giusto. Il tutto avviene per l azione di due enzimi; una endonucleasi che rompe lo scheletro di zucchero e fosfato nei pressi dei nucleotidi appaiati male e una esonucleasi che asporta un tratto di questo filamento; producendo un interruzione che comprende le coppie appaiate male. Se il mismatch repair si applica al fenomeno della conversione genica, il risultato sarà un allele convertito nell altro. Alcune aberrazioni cromosomiche (duplicazioni, delezioni, inversioni) possono essere responsabili di variazioni geniche attraverso vari meccanismi quali la delezione e la duplicazione di parti o di tutto un gene, l inattivazione conseguente a rottura, l avvicinamento del gene a nuovi promotori o a sequenze enhancers o soppressive, la creazione di trascritti antisenso o capaci di inibire dei promotori. I transposons sono elementi genetici dotati di capacità traspositiva, replicativi e di escissione autonome; essi possono perciò alterare la struttura di un gene attraverso vari meccanismi quali l inserimento all interno di un gene con conseguente in attivazione dello stesso, l alterazione della trascrizione di geni contigui, l escissione reciproca ecc. i trasposons degli eucarioti sono classificati in 4 classi, e mostrano polimorfismo sia nella localizzazione che nel numero di copie presenti, generalmente molto alto. La prima famiglia comprende i cosiddetti retrotrasposons, elementi simili ai retrovirus. I retrasposons, elementi simili ai retrovirus. I retrotrasposons presentano ripetizioni dirette di ciascuna estremità (LTRs) essenziali per l inserzione nel DNA ospite. Si traspongono al DNA eucaristico tramite un RNA intermedio. Presentano nella loro struttura fino a tre geni: il primo è simile al gene gag del retrovirus, dove ha funzione di codificazione di proteine interne strutturali; il secondo è simile al gene pol del retrovirus e codifica per una trascrittasi inversa; il terzo non è sempre presente e non ha similitudini con geni retrovirali. La seconda classe è costituita dai retrotrasposons non virali, i quali si traspongono al DNA eucaristico per mezzo di un RNA intermedio. Presentano nella loro struttura due geni, uno simile al gene gag l altro al gene pol dei retrovirus. Quest ultimo codifica per una trascrittasi inversa. La terza classe è costituita da elementi con piccole ripetizioni terminali invertite, tra i quali alcuni contengono un gene che codifica per una traspostasi la quale permette la loro trasposizione diretta nel dna eucaristico. L ultima classe, la meno conosciuta è rappresentata infine da elementi con lunghe ripetizioni terminali. 15

16 Un meccanismo d azione identico ai trasposons hanno i retrovirus, virus a RNA capaci di sintetizzare a scopo replicativi un DNA intermedio il quale può così inserirsi nel dna di cellule ospiti e di provocare variazioni. La retrotrasposizione consiste nella formazione di pseudogeni come conseguenza di una trascrizione inversa dell mrna e conseguente inserzione degli stessi nei cromosomi. Il trasferimento di geni tra specie diverse è stato osservato naturalmente e dimostrato sperimentalmente. Il trasferimento naturale chiama in causa sia i retrovirus che i plasmidi; quello artificiale consiste nella creazione di animali transgenici. Infine, le variazioni somaclonali sono state dimostrate in culture cellulare vegetali, le quali acquisiscono, con un meccanismo ancora sconosciuto, un elevato tasso di mutazioni. Sebbene mai dimostrate negli animali, esse potrebbero essere responsabili delle variazioni che si producono tra animali geneticamente identici prodotti attraverso manipolazioni in vitro quali l embryo splitting e la traspiantazione nucleare. c) ESPRESSIONE FENOTIPICA DEI GENI CODIFICANTI In un individuo diploide i cromosomi vanno sempre in coppia (con l eccezione degli eterocromosomi nei maschi) per cui in uno stesso locus si avranno sempre due geni. Nel caso dell esistenza di due o più alleli l individuo potrà essere omozigote per uno degli alleli o eterozigote. Gli omozigoti manifestano il carattere derivante dall azione biosintetica dei due geni uguali, i quali si esprimono entrambi. Fanno eccezione a tale regola i cosiddetti alleli nudi e i geni portati da uno dei due cromosomi X nella femmina (inattivazione funzionale di uno dei cromosomi X nella femmina o fenomeno di Lyon). L espressione fenotipica dell eterozigote, invece, dipende non solo dalle capacità biosintetiche dei due geni, ma anche delle interazioni che i loro trascritti intratterranno tra loro una volta sintetizzati. Infine, esistono alcune situazioni particolari nelle quali l attività biosintetica dei geni è più complicata di quella che normalmente si esplica. d) ECCEZIONI ALL ESPRESSIONE FENOTIPICA DEGLI OMOZIGOTI GLI ALLELI NULLI Si definiscono alleli nulli o silenziosi geni che in condizioni di omozigosi presentano una attività biosintetico che non può essere messa in evidenza con le tecniche analitiche anche più sofisticate o, addirittura, non hanno più alcuna attività biosintetica. L azione di tali alleli è evidente soprattutto a livello enzimatico, dove di solito rappresentano il livello più basso della variazione quantitativa dell attività enzimatica stessa. Per la loro caratteristica sono geni difficilissimi da essere individuati; anche in eterozigoti, infatti, essi passano solitamente inosservati, a meno che non si ricorra all analisi genealogica delle loro segregazioni. Un esempio interessantissimo di allele nullo è rappresentato da una variante genetica alle αs1 Caseine nella capra, presente negli animali che dimostrano assenza di tale proteina nel latte. Un altro esempio interessante è rappresentato dall allele recessivo al locus Agouti (chiamato non agouti ). Tale locus è responsabile della sintesi delle feomelanine; l allele recessivo inibisce completamente dalle attività biosintetica, permettendo all animale di apparire completamente nero. L INATTIVAZIONE FUNZIONALE DELLA X Benché gli individui di sesso maschile siano emizogoti per il cromosoma X (essi ne hanno una solo copia), la quantità minima dei prodotti di espressione dei geni localizzati sul cromosoma X, quale l attività della glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) nei globuli rossi, è identica a quella osservata negli individui di sesso femminile che hanno due cromosomi X. Quindi, deve esistere un meccanismo di compensazione di queste attività enzimatiche. Gli studi indipendenti di 4 specialisti in genetica, ARY LYON, LIANNE RUSSEL, ERNEST BEUTLER E SUSUMO OHNO, hanno 16

17 permesso la comprensione di questo meccanismo attualmente conosciuto sotto il nome di ipotesi di Lyon (figura 8). Secondo questa ipotesi: a) nelle cellule somatiche, l inattivazione di un cromosoma X avviene precocemente nella vita embrionale; b) l inattivazione è aleatoria, vale a dire che può essere inattivato il cromosoma X paterno o quello materno; c) l inattivazione è completa, sarebbe a dire la quasi totalità del cromosoma X è inattivato; d) l inattivazione del cromosoma X è permanente e trasmessa in modo clonale; se il cromosoma X di origine paterna è inattivo in una data cellula, tutte le cellule provenienti da questa cellula madre esprimeranno un cromosoma X attivo di origine materna, invece il cromosoma X di origine paterna rimarrà inattivo. Il risultato della Lyonizzazione è che l individuo di sesso femminile è un mosaico di cellule, ognuna essendo fondamentalmente emizigote per l uno o l altro dei cromosomi X. Esistono delle eccezioni alle regole enunciate riguardanti l inattivazione dell X. Questa inattivazione è certo aleatoria, ma un X di struttura anormale, sarebbe a dire portatore di una delezione, è preferibilmente inattivato. D altra parte, negli individui portatori di una traslocazione su un cromosoma X, è il cromosoma X che è generalmente inattivato. Benché l inattività del cromosoma X sia estesa alla sua quasi totalità, non è mai completa. Almeno due geni all estremità del braccio corto della X, quelli codificanti per l antigene Xg e l enzima steroide sulfatasi sfuggono all inattivazione. Inoltre certi geni sui bracci lunghi della X (Xq26) sfuggono alla inattivazione per mantenere la funzione ovarica fino all età normale della menopausa. Infine, è evidente che mentre l inattivazione della X è permanente nella maggior parte delle cellule somatiche, essa deve essere reversibile nello sviluppo delle cellule germinali. L ESPRESSIONE FENOTIPICA DEGLI ETEROZIGOTI a) DOMINANZA SEMPLICE O MENDELIANA Si parla di dominanza totale quando tutti gli eterozigoti presentano il fenotipo corrispondente a uno dei genotipi omozigoti, che assumerà perciò il nome di dominante. Il fenotipo corrispondente all altro genotipo omozigote è chiamato invece recessivo. La dominanza e la recessività associate ad un solo locus biallelico dovrebbero essere più propriamente chiamate dominanza semplice o recessività semplice per evitare confusioni con altri significati che nella genetica delle popolazioni ed in quella quantitativa vengono attribuiti al termine. La dominanza si esplica con diversi meccanismi. Il più semplice consiste nell inattività dell attività funzionale dell allele recessivo: più spesso, soprattutto a livello enzimatico, l enzima prodotto dal gene dominante presenta una maggiore velocità di azione o una maggiore affinità con il substrato o ancora una maggiore resistenza all attività catalitica di quello prodotto dal recessivo; altre volte, la proteina prodotta dal gene dominante ha un azione soppressiva su quella prodotta dal recessivo. La dominanza e la recessività in un locus producono delle proporzioni caratteristiche, sia a livello fenotipico che genotipico. Due di tali proporzioni derivano dalle prime due leggi di Mendel. La prima, detta della dominanza dei caratteri recita se si accoppiano tra loro soggetti che presentano due forme diverse dallo stesso carattere (ad esempio, due diversi colori), i soggetti che nascono porteranno tutti una delle due forme, che sarà perciò definita dominante, rispetto all altra, detta recessiva. La seconda, o legge della segregazione dei caratteri; riaccoppiando tra loro i soggetti nati dagli accoppiamenti di cui alla prima legge, ¾ dei nuovi nati avrà fenotipo dominante e ⅓ fenotipo recessivo ; ricompare cioè in questa generazione il carattere che era scomparso nella precedente. Esse fanno riferimento infatti a due dei sei possibili sistemi di segregazioni per un locus biallelico. Il primo consiste nella segregazione tra omozigoti dominanti e omozigoti recessivi; tutti gli F1 che da essi 17

18 derivano sono eterozigoti e presentano tutti fenotipo dominante. Il secondo consiste nella segregazione di soggetti eterozigoti; in questo caso si avranno due fenotipi, uno dominante ed uno recessivo, e tre genotipi, i due omozigoti e l eterozigote; quest ultimo sarà fenotipicamente identico a uno degli omozigoti che prende così il nome di dominante, in opposizione all altro che sarà invece recessivo. Il rapporto fenotipico di segregazione sarà di tre feonotipi dominato ogni uno recessivo; ad esso corrisponde un rapporto di ¼ di omozigoti dominanti, 2 /4 di eterozigoti e ¼ di omozigoti recessivi. La tabella 1 e 2 riportano tutti e 6 i sistemi di segregazione possibili. L implicazione pratica più importante della dominanza semplice è che i soggetti omozigoti dominante e quelli eterozigoti non sono fenotipicamente distinguibili. b) DOMINANZA INTERMEDIA E CODOMINANZA Pur se spesso considerati sinonimi, i termini di dominanza intermedia e di codominanza fanno riferimento in realtà a due situazioni differenti. Nel primo caso, l espressione fenotipica dell eterozigote è intermedia rispetto a quella dei due omozigoti. Espressione intermedia non vuol dire necessariamente che l eterozigote è perfettamente intermedio, ma che si trova tra l espressione fenotipica dei due omozigoti. La dominanza intermedia è molto spesso presente nel comportamento di alcuni enzimi responsabili di malattie metaboliche, e ciò permette di ottenere una rapida diagnosi della condizione di portatore (cioè di individuo a genotipo eterozigote). Nella codominanza, invece, l eterozigote mostra le proprietà di entrambi gli alleli. Gli esempi di quest ultima situazioni sono numerosi. Le due situazioni possono essere trattate insieme perché in entrambe è possibile distinguere gli eterozigoti dai due omozigoti dominanti. Nelle segregazioni corrispondenti ai vari tipi di accoppiamento per un locus biallelico, perciò esiste sempre perfetta corrispondenza tra i rapporti fenotipici e quelli genotipici. c) I PARAMETRI DI PENETRANZA ED ESPRESSIVITÀ La penetranza è un parametro che caratterizza l azione di ogni genotipo. Essa può essere quantificata come proporzione di individui che mostrano l effetto fenotipico usuale del genotipo in esame. Se un dato genotipo occasionalmente non è in grado di produrre il suo fenotipo usuale, esso mostra solo una manifestazione parziale per cui si dice che tale genotipo è incompletamente penetrante. Per i caratteri dominanti, la penetranza incompleta interessa solitamente gli eterozigoti, che appaiono come fenotipi recessivi (Aa, aa); più raramente possono essere interessati gli omozigoti recessivi, che appariranno come eterozigoti dominanti (aa, Aa). È anche possibile che l omozigote dominante appaia come il recessivo (AA, aa). La scelta dei fenotipi interessati è del tutto occasionale. Una parziale spiegazione a tale occasionalità può derivare dall azione di condizionamento sull espressione fenotipica di un genotipo operata da altri geni non alleli e da condizioni ambientali (modificazione della dominanza) e certe combinazioni geniche rappresentino situazioni genetiche non bilanciate; nella vita prenatale esse possono perciò essere influenzate da differenti fattori fisiologici per cui, interagendo con piccole cause esterne, possono perdere la capacità di produrre un certo fenotipo; in tal caso, essendo l influenza fisiologica e quella ambientale del tutto casuali, solo una certa parte dei genotipi sarà interessato; l altra parte rimarrà perfettamente penetrante. La penetranza è un parametro esclusivamente genotipico: esso non può essere in alcun caso attribuito ad un singolo gene, inoltre, la penetranza non deve essere confusa con l azione di geni soppressori o inibitori, come in alcuni casi di epistasi. La stima del parametro di penetranza richiede: - la conoscenza del tipo di eredità del carattere considerato; - la frequenza relativa dei casi in cui il genotipo manca nell esprimere il carattere appropriato. 18

19 Quando è penetrante, uno stesso genotipo può presentare una serie di manifestazioni fenotipiche. Questa situazione prende il nome di espressività di un genotipo. Generalmente i caratteri qualitativi a penetranza totale si presentano fenotipicamente uniformi; sono i caratteri a penetranza ridotta che possono presentarsi non uniformi da un punto di vista fenotipico. L espressività variabile si associa sempre perciò alla penetranza ridotta. Essa può essere spiegata chiamando in causa diverse situazioni: - possono esistere geni particolari, detti modificatori che cambiano solo leggermente l effetto fenotipico di geni maggiori. Il ruolo di tali geni non è ben conosciuto ed è difficile stabilire i loro rapporti di segregazione; - le condizioni ambientali, combinate con la base genetica, possono cambiare entro certi limiti la manifestazione fenotipica di un genotipo; - infine, alcuni caratteri possono essere controllati non da un singolo gene maggiore, ma da più geni e vari loci con effetto cumulativo. d) LA PLEIOTROPIA La pleiotropia rappresenta una proprietà di un gene e consiste nella sua capacità di sintetizzare più caratteri contemporaneamente. In tutti gli organismi viventi, molte vie biosintetiche sono spesso interconnesse e interdipendenti. È possibile perciò che i prodotti di una catena metabolica possano essere utilizzati da altre e viceversa. Un gene può perciò manifestarsi con più di una espressione fenotipica. Nella maggior parte dei casi, un carattere sarà molto ben evidente, mentre gli altri appariranno più come effetti secondari, spesso anche mal collegabili al principale; molte malattie monogenetiche presentano tale meccanismo di manifestazione fenotipica. Più raramente, le manifestazioni importanti sono varie, ma sempre piuttosto simili tra loro. L insieme delle espressioni fenotipiche di un gene fa parlare di effetti pleiotropici. La pleiotria può essere confusa con l associazione, soprattutto se questa è completa o manifesta bassa frequenza di crossing-over. L associazione va considerata possibile rispetto alla pleiotropia quando: - i due caratteri, ciascuno conosciuto come entità genetica specifica, sono presenti solo in uno scarso numero di famiglie; - anche un solo individuo presenta uno solo dei due caratteri; - entrambi i caratteri presentano espressività totale; - nessun legame biochimico o fisiologico è conosciuto o è plausibile tra i due caratteri. Un esempio classico di falsa pleiotropia è rappresentato dai caratteri dell ipertermia maligna conseguente ad anestesia con alitano e ipertrofia muscolare nel suino. Facciamo degli esempi: e) LA LETALITÀ Certi alleli si manifestano con la morte dell individuo prima della maturità, nel periodo pre o post-natale; vengono definiti perciò letali. Un gene si definisce letale quando in doppia dose porta a morte l individuo portatore. Il fenomeno si realizza cioè allo stadio diploide, allo stadio omozigote. Inoltre la mortalità si può avere anche allo stadio di gamete: i gameti portatori del gene sono non viabili. In generale: gli omozigoti muoiono, mentre gli eterozigoti sopravvivono, ma risultano spesso poco fecondi, poco resistenti e più predisposti alle malattie. La letalità fu scoperta da Cuenot nei suoi studi sui topi di laboratorio yellow. Accoppiando topi gialli tra di loro, Cuenot constatò che non era mai possibile ottenere linee gialle pure; all interno di una popolazione si ottenevano sempre degli individui che per ⅔ erano gialli e per il restante terzo erano neri. Ciò è spiegato dal fatto che i topi gialli sono tutti eterozigoti poiché gli omozigoti non nascono, il gene responsabile del colore giallo è dunque letale. I geni letali possono essere: 19

20 a) dominanti: portano a morte sia l omozigote dominante che l eterozigote; di solito possono sopraggiungere per mutazione di un allele recessivo: b) recessivi: portano a morte solo l omozigote recessivo; l eterozigote è perfettamente normale o presenta qualche piccola deficienza. Ancora possono essere: - autosomici; - legati al sesso. Quelli di tipo autosomico hanno spesso penetranza incompleta, o sono pleiotropici. A volte, infine, la loro espressione può essere limitata dal sesso. Certi geni letali sono situati sui cromosomi sessuali: il cromosoma X è dunque il solo a poter portare questi geni, in quanto nel maschio la presenza di un solo gene letale recessivo sul cromosoma X porta a morte. La trasmissione avverrà invece per mezzo di eterozigoti femmine. Queste danno: - nella progenitura maschile o letalità o normalità perché l unico X del maschio viene dalla madre; - nella progenitura femminile metà omozigote normale, metà omozigote portatrice poiché il maschio porta solo l allele normale. MASCHIO L X FEMMINA LI se M se F ½ [L] ½ [l] ½ LL ½ LI normale muore normale normale portatrice Nascono perciò ⅔ di femmine ed ⅓ di maschi. L accoppiamento di maschi con femmine letali eterozigoti da un rapporto di 2 a 1 in favore delle femmine. f) L ETEROGENEITÀ GENETICA Quando una o più mutazioni o variazioni genetiche producono lo stesso carattere, si parla di eterogeneità genetica. Essa può conseguire sia all azione di mutanti differenti ad un singolo locus, ed allora si parla di eterogeneità all elica sia all azione di geni mutati appartenenti a loci diversi, eterogeneità non allelica. Entrambe le forme sono state ampiamento dimostrate sia nell uomo che in vari animali domestici. Molto frequentemente essa compare in malattie monogenetiche quali l albinismo, l emofilia ecc. Molto spesso l eterogeneità può essere svelata attraverso delle differenze che comunque esistono tra i caratteri eterogenei a livello fenotipico, fisiologico o biochimico. A volte invece, l unica possibilità di distinzione deriva da appropriate indagini genetiche. Tre in particolare vanno considerati: - metodi genetici veri e propri, che analizzino cioè comportamento ereditario dei geni in esame; - studi su cellule somatiche in coltura; - analisi di genetica molecolare. I metodi genetici sono: - l individuazione di un meccanismo ereditario differente; alcuni caratteri si presentano identici fenotipicamente, ma presentano modelli ereditari diversi (dominanti o recessivi, autosomici o legati al sesso ecc.). - il non allelismo dei recessivi, dimostrabile attraverso il test di complementazione. Esso consiste nell accoppiare tra loro soggetti a fenotipo recessivi provenienti da famiglie, popolazioni o razze diverse. Se il carattere recessivo è dovuto allo stesso gene, tutti i soggetti nati saranno a loro volta 20

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