PROTEINE TERAPEUTICHE IN ONCOLOGIA

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1 PROTEINE TERAPEUTICHE IN ONCOLOGIA

2 ANTICORPI TERAPEUTICI

3 GENERAZIONE DI UN ANTICORPO MONOCLONALE MEDIUM HAT: contiene ipoxantina, aminopterina, timidina. La cellula di mieloma non possiede l enzima HGPRT (ipoxantina-guaninafosforibosil-transferasi) quindi solo le cellule fuse riescono a sopravvivere nel medium HAT.

4 PROBLEMI PRINCIPALI ASSOCIATI ALL USO DI ANTICORPI MURINI: 1. La maggioranza dei pazienti (fino all 80%) sviluppa anticorpi contro gli Ab murini (HAMA, Human Anti-Mouse Antibody) 2. L Fc murino è poco efficiente nel reclutare effettori cellulari umani 3. Il t1/2 degli Ab murini è molto breve (< 24 ore; umani: t1/2 di alcune settimane)

5 EVOLUZIONE GRADUALE DELL UMANIZZAZIONE DEGLI ANTICORPI: 1. Produzione di anticorpi chimerici (70% sequenze umane) 2. Produzione di anticorpi umanizzati (95% sequenze umane) 3. Produzione di anticorpi completamente umani attraverso il phage display

6 Struttura base degli anticorpi IgG -tetrameri di 150 kda, formati da due catene H di kda e 2 catene L di 25 kda -ogni L si associa con una H tramite S-S -le due H sia associano tramite S-S (regione cerniera o hinge ) -ogni IgG è bivalente -gli N terminali sono altamente variabili (V) mentre gli C terminali sono costanti (C) -nell ambito di V H e V L ci sono 3 regioni ipervariabili e si chiamano regioni determinanti la complementarietà (CDR) -i domini CH2 e CH3 formano l Fc (porzione effettrice)

7 Anticorpo chimerico: fusione dei domini V murini con domini C umani Anticorpo umanizzato: trasferimento dall Ab murino a quello umano solo dei residui responsabili del legame all antigene

8 Produzione di anticorpi umani tramite phage display Il phage display permette di creare delle genoteche con un repertorio di variabilità simile a quello dei mammiferi La genoteca è costituita da geni V H e V L presenti in un singolo vettore Tramite mutagenesi casuale e rimescolamento delle varie catene si puo aumentare enormemente la diversità anticorpale Aumento dell AFFINITA

9 Anticorpi ingegnerizzati FUNZIONE DI LEGAME FUNZIONE EFFETTRICE

10 Anticorpi ingegnerizzati

11 Funzioni principali dei domini anticorpali Fab: LEGAME DELL ANTIGENE neutralizzazione, inattivazione, antagonismo agonismo, signaling Fc: LEGAME DEL FcR CDC, opsonizzazione ADCC CDC, complement-dependent cytotoxicity ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity

12 Possibili meccanismi citotossici mediati da anticorpi

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14 FAGOCITI: MACROFAGI E NEUTROFILI

15 FcRn (recettore Fc neonatale): un recettore per Fc fondamentale nella farmacocinetica degli anticorpi monoclonali FcRn ha una struttura simile all MHC di classe I e risulta espresso a livello della placenta, dove media il trasporto degli Ab dalla madre al feto, e delle cellule endoteliali. FcRn media l uptake delle IgG all interno delle cellule e permette anche l attraversamento delle cellule stesse. In questo modo le IgG sono protette dalla degradazione. Le IgG che non legano l FcRn non possono raggiungere il feto e hanno un emivita molto breve. (A) Struttura della regione Fc dell IgG1 umana con l indicazione dei residui coinvolti nel legame all FcRn murino, di ratto o umano; (B) struttura dell FcRn di ratto con i residui coinvolti nella formazione del complesso di ratto FcRn-Fc Le IgG murine non legano l FcRn umano: questo spiega la loro rapida eliminazione nell uomo. Le IgG possono essere ingegnerizzate per modulare a piacere la persistenza a livello plasmatico.

16 Ingegnerizzazione degli anticorpi terapeutici: aspetti fondamentali 1. Diminuzione dell immunogenicità specie, dimensione, glicosilazione, PEG 2. Ottimizzazione delle caratteristiche farmacocinetiche t1/2 (natura dell Fc; glicosilazione; dimensione; PEG) 3. Ottimizzazione delle caratteristiche farmacodinamiche legame all antigene (mono-, bi-, tri-valente) affinità (phage display) anticorpi neutralizzanti, inattivanti o antagonisti: meglio no Fc anticorpi attivanti il segnale: l Fc può favorire il cross-linking modulazione della funzione dell Fc doppia specificità (anticorpi bispecifici) -coniugazione a tossine, radioisotopi

17 Proteine terapeutiche in oncologia Anticorpi monoclonali nudi ( naked ) coniugati bispecifici terapia genica ( intrabodies ) Citochine native modificate coniugate Tossine modificate coniugate Enzimi modificati

18 Gli anticorpi terapeutici approvati in campo oncologico Bexxar CD20(I 131 ) Mouse NHL 2003 Oncolym HLA-Dr10 Mouse NHL Phase III (I 131 )

19 Rituximab (Rituxan): il primo anticorpo terapeutico anti-tumorale E un mab anti-cd20 chimerico murino/umano. E stato approvato per l uso in pazienti affetti da NHL e da patologie autoimmunitarie. NAKED ANTIBODY

20 Il CD20 come target terapeutico anti-tumorale Il CD20 e una proteina espressa sulla superficie di cellule pre-b, cellule B mature e per piu del 95% da cellule B di NHL. Non e espressa da precursori staminali e plasmacellule. Il meccanismo d azione di rituximab non e stato ancora ben chiarito. L interazione di CD20 con questo anticorpo non porta ad internalizzazione ma all attivazione della trasduzione di un segnale i cui effetti finali sono inibizione della crescita cellulare ed apoptosi. L Fc dell anticorpo sembra inoltre contribuire all effetto reclutando gli effettori naturali per l ADCC ed attivando la CDC. Il rituximab e efficace in circa il 50% dei pazienti affetti da NHL di basso grado. La sua tossicità e ridotta e limitata agli effetti collaterali tipici di in infusione, quali febbre, brividi, nausea, dispnea,eritema,tosse, broncospasmo. Puo essere associato con successo ai chemioterapici tradizionali.

21 Herceptin (trastuzumab): il primo anticorpo terapeutico per i tumori solidi E un IgG1 umanizzata diretta contro Her-2 o ErbB2. E approvato per l uso nel cancro metastatico della mammella. NAKED ANTIBODY

22 Her-2 (ErbB2): un proto-oncogene come target antitumorale Her-2 appartiene alla famiglia degli EGFR. Gli EGFR sono dei receptor tyrosine kinases (RTK) che controllano la differenziazione e proliferazione cellulare. In cellule normali, la attività degli RTK è sotto stretto controllo. L espressione aumentata degli RTK oppure alterazioni funzionali dovute a mutazioni oppure ad un abnorme stimolazione da parte di fattori di crescita autocrini puo portare ad un attivazione costitutiva di tali recettori. Her-2 e espresso 100 volte di più in cellule tumorali rispetto alle cellule non neoplastiche del 30% di pazienti affette da cancro invasivo della mammella. Il trastuzumab è solitamente associato a paclitaxel (tassolo)o doxorubicina.

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24 Campath 1H (alemtuzumab): un anticorpo terapeutico per la leucemia linfocitica cronica (CLL) E una IgG1 umanizzata diretta contro CD52. NAKED ANTIBODY La funzione di CD52 e ignota. E espresso su linfociti T e B normali, monociti, macrofagi e nella maggior parte dei linfomi B e T, ma non nei precursori staminali. Alemtuzumab lega CD52 e attiva la CDC e l ADCC.

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26 Zevalin ( 90 Y-ibritumomab tiuxetan): il primo anticorpo terapeutico coniugato ad una molecola radioattiva E una IgG intera murina diretta contro CD20. E approvato per l uso nel NHL. CONJUGATED ANTIBODY 90 y = ITTRIO 90, emette radiazioni molto potenti ed ha un emivita di 2.5 giorni. IL razionale della coniugazione a radioisotopi consiste nella possibilità di aumentare il potenziale citotossico dei mab terapeutici. Inoltre, l anticorpo radioattivo può uccidere tramite la radioattività anche cellule tumorali negative per l antigene verso cui e diretto l anticorpo. Il fatto che il mab sia di topo in questo caso e positivo, perché una lunga permanenza in circolo potrebbe aumentare la possibilità di tossicità mediata dal radioisotopo in organi quali il fegato e il rene. La % di pazienti responsivi allo zevalin è significativamente superiore rispetto al Rituximab. La tossicità, soprattutto ematologica, è significativamente superiore per lo zevalin, anche se tali effetti sono generalmente reversibili.

27 Mylotarg (Gemtuzumab Ozogamicin) un nuovo farmaco per la leucemia mieloide acuta (AML) CONJUGATED ANTIBODY (RITIRATO DAL MERCATO NEL 2010)

28 Il CD33 come target del Mylotarg

29 Il CD33 come target terapeutico anti-tumorale Il CD33 e una proteina di adesione di 67 kda capace di legare molecole contenenti acidi sialici. E espressa sia su cellule normali che tumorali, ma non sulle cellule staminali. Piu dell 80% dei pazienti affetti da AML esprime CD33 nei blasti leucemici. Il trattamento con anti-cd33 può determinare neutropenia e trombocitopenia, che sono tuttavia spesso seguite da recupero ematologico dovuto al fatto che CD33 non e espresso sui precursori staminali. L interazione di CD33 con l anticorpo specifico non attiva un segnale nella cellula (e pertanto l anti-cd33 da solo non ha valore terapeutico) ma determina la rapida internalizzazione del complesso in vescicole lisosomiali a ph acido.

30 Calicheamicine Sono una famiglia di potenti agenti citotossici appartenenti alla classe delle enedine. Tali composti sono prodotti da un microrganismo presente nel suolo, il Micromonospora echinospora. La -calicheamicina è la molecola più rappresentativa di tale classe. Il Mylotarg contiene un derivato della -calicheamicina, l N-acetil - -calicheamicina dimetil idrazide. Tale molecola e in realta un profarmaco che viene liberato dall anticorpo solo in ambiente acido. Somministrate da sole, presentano un basso IT ed alta tossicità. Il meccanismo di citotossicità è mediato dal legame di tali molecole al minor groove del DNA in maniera abbastanza sequenza-specifica con conseguente rottura in più punti della doppia catena del DNA causando morte, sia per apoptosi che non per apoptosi.

31 Gli anticorpi terapeutici approvati in campo oncologico Bexxar CD20(I 131 ) Mouse NHL 2003 Oncolym HLA-Dr10 Mouse NHL Phase III (I 131 )

32 Anticorpi bispecifici in oncologia Caratteristiche ideali: 1. Elevata selettività ed affinità per il target tumorale 2. Legame monovalente al triggering receptor ; cross-linking solo quando si è legata anche la controparte al target 3. Non deve avere porzioni Fc 4. Deve essere di origine umana 5. Deve essere sufficientemente piccolo per penetrare nel tumore se questo è solido

33 Anticorpi bispecifici in oncologia Triggering receptors: Fc RI Fc RII Fc RIII Fc RI (TCR) Tumor surface molecules: Folate-binding protein (ovarian cancer cells) Her-2 CD20 RISULTATI DEGLI STUDI CLINICI: -Tossicità negli studi iniziali -Scarsa efficacia -(Costi ancora proibitivi)

34 Intrabodies

35 Anticorpi terapeutici in oncologia: prospettive future 1. Identificare target sempre piu selettivi 2. Approfondire le conoscenze del rapporto tra la struttura, la farmacodinamica e la farmacocinetica degli Abs 3. Ottimizzare gli anticorpi bispecifici 3. Rendere praticabile la gene therapy con gli anticorpi 4. Potenziare lo sviluppo dei piccoli anticorpi per i tumori solidi 5. Abbassare i costi sfruttando la produzione nei batteri

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37 Proleukin (aldesleukin): la prima citochina ingegnerizzata in oncologia Modello del complesso IL-2/IL-2R

38 Proleukin (aldesleukin): la prima citochina ingegnerizzata in oncologia Gli effetti di IL-2

39 Proleukin (ril-2, aldesleukin): la prima citochina ingegnerizzata in oncologia E una forma ricombinante dell IL-2 umana (15 kda) prodotta nell E. coli. Si distingue dall IL-2 nativa perche non è glicosilata, manca del residuo di Ala iniziale, ed ha una Ser al posto di una Cys in posizione 125. Tali modifiche comportano un diminuita tendenza all aggregazione ed un aumentata biodisponibilità. E indicata per l uso nel carcinoma renale metastatico e nel melanoma. I dosaggi utilizzati sono molto elevati (6 x 10 5 U/Kg in 15 min). In alcuni pazienti un unico ciclo di trattamento risulta efficace. La sua somministrazione è associata a grave tossicità cardiovascolare associata ad aumento della permeabilità capillare (sindrome di perdita capillare) con conseguente perdita del tono vascolare e fuoriuscita di di fluido e proteine plasmatiche nello spazio extravascolare. Tale tossicità può tradursi in ipotensione, ridotta perfusione degli organi e morte. Inoltre, la proleukin puo indurre infezioni disseminate dovute a compromissione della funzione dei neutrofili.

40 Ontak (denileukin diftitox, DAB 389 IL-2) E una proteina di fusione costituita da una forma troncata di DT e da IL-2 umana. E citotossica per cellule che esprimono il recettore ad alta o intermedia affinità per IL-2. E indicato per forme avanzate di linfoma cutaneo T cellulare (CTCL). La responsività è pari a 36% ad alti dosaggi. La tossicità è ridotta rispetto a proleukin anche se in alcuni pazienti compare la sindrome da perdita capillare.

41 Struttura schematica delle immunotossine Tossine vegetali: olotossine, costituite da una catena A catalitica e una catena B di legame, oppure emitossine, costituite dalla sola catena A Tossine batteriche: Sono costituite da catene singole che contengono sia il sito catalitico che di legame

42 Meccanismi di intossicazione cellulare da parte di tossine

43 Proteine di fusione per tumori cerebrali Il recettore per la transferrina è espresso su cellule cerebrali neoplastiche ma non normali. 454A12-rRA: proteina di fusione costituita da un anticorpo anti -recettore per la transferrina e la catena A della ricina. 50% responsività (terapia intraventricolare) Tf-CRM107: proteina di fusione costituita dalla transferrina umana e una forma troncata della DT. 50% responsività

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45 Oncaspar (pegaspargase): un enzima per la leucemia linfoblastica acuta Nel 1953 fu dimostrato che il siero di cavia possiede attività antileucemica grazie alla L-asparaginasi. La L-asparaginasi converte la L-asparagina in acido aspartico e ammoniaca. Cellule normali producono L-asparagina in quantità sufficienti per la sintesi proteica. Cellule tumorali quali quelle leucemiche linfoblastiche acute richiedono invece spesso sorgenti esogene di tale amino acido. La somministrazione di L-asparaginasi depriva tali cellule da L-asparagina causando apoptosi. L asparaginasi (Elspar) è prodotta in E. coli ed ha un t1/2 di 30 ore. Induce ipersensitività con alta frequenza (fino al 20%, puo essere anche fatale). La pegilazione dell asparaginasi di E. coli ha permesso sia di aumentare significativamente il t1/2 (t1/2 pegaspargase = 15 giorni) sia di diminuire l incidenza di ipersensitività (<5%). La pegaspargase viene somministrata in associazione ad altri farmaci antitumorali. Tossicità: epatotossicità, inibizione della sintesi di fattori della coagulazione (emorragie), neurotossicità, tossicità pancreatica.

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