Valutazione della immunogenicità in studi clinici: strategie sperimentali e statistiche

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1 Nuove frontiere nella bioanalitica e laboratorio clinico 3 Febbraio 2015 Valutazione della immunogenicità in studi clinici: strategie sperimentali e statistiche Claudia Getuli

2 INTRODUZIONE Il numero di farmaci biologici/proteine ricombinanti ad uso terapeutico è in costante aumento. Questi prodotti possono indurre una risposta immunitaria non voluta (ADA Anti Drug Antibodies). La presenza di ADA può avere effetti rilevanti nello sviluppo di un prodotto biotecnologico per problematiche di sicurezza ed efficacia.

3 IMMUNOGENICITA EFFETTI L immunogenicità può influenzare negativamente: Farmacocinetica Farmacodinamica Biodisponibilità Efficacia ADA possono causare la formazione di immunocomplessi che a loro volta possono causare: Reazioni allergiche Gravi reazioni autoimmunitarie

4 Rischio clinico Frequenza ADA: POSSIBILI RISPOSTE Basso Alto Legame, Binding Alterazione della PK Neutralizzazione, NAb Ipersensibilità Cross-reazione Alta Bassa La severità della risposta clinica è correlata alla frequenza in modo inversamente proporzionale J A Pedras-Vasconcelos FDA (2014)

5 Immunogenicita clinica: PRCA con Eprex : aumento delle segnalazioni di PRCA (Pure Red Cell Aplasia) Pazienti trattati con Eprex presentavano autoanticorpi N. Casadevall et al. - Nephr. Dialys. Transplant. (2002)

6 Valutazione Immunogenicità EMA (2006), Guideline on Immunogenicity Assessment of Biotechnology-Derived Therapeutic Proteins FDA Final Guidance (2014), Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products FDA Draft Guidance (2009), Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins

7 Importanza di prevedere il potenziale immunogenico di una sostanza E molto importante preparare una valutazione del rischio prima dell inizio della fase clinica Risk Assessment : deve essere deciso caso per caso l estensione della caratterizzazione degli ADA dipende dal rischio potenziale

8 Fattori che influenzano l incidenza di ADA Le variabili che possono incidere sull insorgenza di ADA sono molteplici: Caratteristiche della sostanza (e.g. dimensione, struttura, sequenza, modifiche come glicosilazione, ossidazione) Natura del formulato (e.g. presenza di impurezze/ contaminanti, aggregati) Popolazione Target (e.g. background genetico, cure concomitanti, immunodeficienza) Regime di trattamento (e.g. via di somministrazione, frequenza, dose)

9 Fattori che influenzano la valutazione del rischio di ADA Le variabili che possono aumentare il rischio di conseguenze: Analogie con proteine endogene Esiste una proteina endogena identica o simile? La proteina endogena ha attività unica o una funzione ridondante? Caratteristiche del paziente e della patologia Pazienti immuno-compromessi? Il paziente ha la proteina endogena? Trattamento Prodotto per terapia sostitutiva? Il prodotto è la sola terapia disponibile?

10 STRATEGIA GENERALE Studi clinici + Campioni di siero Test di Screening _ Test di conferma _ Report + Caratterizzazione della risposta (Titolo, NAb, isotipo, etc.)

11 METODO Determinazione degli ADA I metodi normalmente utilizzati sono: Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Radioimmunoassay (RIA) Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) Surface Plasmon Resonance (SPR) Electrochemiluminescence (ECL)

12 Selezione del formato ELISA DIRETTO ELISA BRIDGING FARMACO AGGIUNTA ANTICORPI FARMACO coniugato Secondario anti-igg coniugato AGGIUNTA SUBSTRATO

13 Selezione del formato ELISA DIRETTO VANTAGGI Maggiore capacità di legare anticorpi a bassa affinità SVANTAGGI L isotipo rivelato dipende dal secondario coniugato Specie specifico Reagenti per la rivelazione possono essere diversi tra controlli e campioni ELISA BRIDGING Determinazione di tutte le classi di Ig comprese IgM Non specie-specifico Capacità ridotta di determinare Ab a bassa affinità La coniugazione della sostanza può mascherare gli epitopi o modificare la struttura Maggiori problemi di interferenza da prodotto circolante

14 Saggi quasi-quantitativi I saggi immunologici per la determinazione degli ADA sono generalmente definiti come quantitativi relativi o quasi-quantitativi. Motivo: il Controllo Positivo (Reference Standard) normalmente non riflette le affinità/proporzioni degli Anticorpi presenti nei campioni dei pazienti. Finalità: determinare un cut point per definire un campione come negativo o reattivo (potenzialmente positivo).

15 at least 4 experiments 6 experiments Pre-study assay validation - Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point * Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls * Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)

16 Primo step Immunogenicity Screening Assay Cut-point Fattore cruciale: determinazione dello Screening cut point che permette la definizione dei campioni come negativi o reattivi (potenzialmente Positivi) I campioni reattivi dovranno essere ulteriormente analizzati con un Saggio di Conferma

17 Immunogenicity Screening Assay Cut-point La sensibilità del metodo è più importante della specificità Attesi 5% di falsi positivi

18 Immunogenicity Screening Assay Cut-point

19 ISAC Immunogenicity Screening Assay Cut Point ISAC, programma generato con il software R v del 25 Settembre 2013 Il tool è stato confrontato importando le formule in SAS versione 9.3

20 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Flow scheme

21 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Un disegno sperimentale bilanciato è raccomandato per la determinazione dello screening cut point e della precisione del test. Lo schema consigliato è: 2 analisti x 3 esperimenti x 3 piastre Normalmente utilizzati 60 campioni che vengono suddivisi in tre sottogruppi da 20 Ogni sottogruppo viene analizzato da entrambi gli analisti una volta per esperimento e una volta per piastra.

22 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Balanced Experimental Design

23 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Assessment of normality Shapiro-Wilk test p =

24 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Outliers evaluation

25 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Assessment of Normality Shapiro-Wilk test p =

26 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Outliers evaluation Confermata l assenza di outliers

27 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Analysis of Variance (ANOVA) Analyst A La media delle letture risulta diversa in modo statisticamente significativo

28 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Analysis of Variance (ANOVA) Analyst B La media delle letture risulta diversa in modo statisticamente significativo

29 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Levene test per omogeneità della Varianza Analyst A Test a p-value Levene classical E-06 Brown-Forsythe Levene E-05 Analyst B Test a p-value Levene classical Brown-Forsythe Levene anche le varianze risultano diverse in modo statisticamente significativo

30 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Fixed Cut Point Il Fixed Cut Point può essere applicato soltanto se: Medie e Varianze non sono diverse in modo statisticamente significativo. Se entrambe le condizioni non sono soddisfatte sarà applicato un Floating Cut Point.

31 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Primo passaggio è comunque il calcolo del FIXED CUT POINT: Mean OD values * SD NORMALIZATION FACTOR NF = Cut Point - Negative Control (NQC) FLOATING CUT POINT è calcolato indipendentemente per ogni piastra: NQC (plate specific) + NF (analyst specific)

32 Immunogenicity Screening Assay Cut-point Flow scheme

33 Pre-study assay validation - Pre-study validation consisting in determination of: * Screening cut point * Assay Sensitivity * System suitability controls: QCH, QCL and negative controls * Precision * Definition of test acceptance criteria * Selectivity * Matrix interference * Drug interference * Related endogenous protein interference * Robustness * Stability * Ruggedness (if applicable)

34 Assay signal Assay Sensitivity Si utilizzano anche in questo caso i dati dei primi sei esperimenti. Cut point Level of Assay Sensitivity Ab Concentration (ng/ml)

35 Assay Sensitivity Calcolo effettuato sulla base dei dati di 6 esperimenti Il livello di sensibilità del sistema raccomandato per trial clinici è ng/ml (FDA Guidance for Industry - Assay Development for Immunogenicity Testing of Therapeutic Proteins - Draft, December 2009).

37 Risposta System Suitability Controls QCH: concentrazione che produce un segnale subito prima del plateau della curva QCH Conc QCL: concentrazione che produce un segnale riproducibilmente superiore al Cut Point Mean of OD values + t 0.01,df * SD NQC: matrice pool di sieri di controllo negativo per monitorare il background non specifico

38 System Suitability Controls I controlli qualità sono utilizzati per: Valutazione della Precisione; su sei esperimenti condotti con un disegno bilanciato (2 operatori * 3 esperimenti* 3 piastre) Determinazione dei Criteri di Accettabilità su tutti gli esperimenti disponibili poiché determinati statisticamente. Tali criteri garantiscono che il saggio rimanga valido anche nella fase in study ovvero durante lo studio clinico.

40 OD value OD value Matrix interference Selectivity QCL level Subject No. * 10 campioni di siero di diversi individui * Aggiunta di controllo positivo: QCH e QCL QCH level Si calcola la concentrazione rispetto alla curva di riferimento (siero pool) Subject No.

41 Drug interference Selectivity * 10 campioni di siero di diversi individui * Aggiunta di: livello basso di controllo positivo. + concentrazioni crescenti di sostanza (drug). Competizione Inibizione del segnale Biotin- Drug Falsi negativi ADA Drug

42 Assay signal Drug interference Selectivity Dalla curva che interpola i dati si calcola la DRUG TOLERANCE Cut point Drug Concentration (ng/ml) Level of Drug Tolerance

43 Drug interference Selectivity Calcolo effettuato sulla base dei dati di 10 curve (= 10 diversi individui)

45 Robustness La Robustness è una indicazione dell affidabilità di un saggio ed è determinata dalla capacità dello stesso di funzionare adeguatamente in seguito a variazioni come: cambio della strumentazione, della temperatura di incubazione, del numero delle piastre etc...

47 Stability La stabilità a lungo termine a temperature -20 C per 2 o più anni non è normalmente richiesta ed è supportata da dati di letteratura. L analita negli studi di validazione immunogenicità è un ADA: Anti-drug X Oppure Anti-drug Y comunque un anticorpo policlonale ed è ragionevole pensare che la sua stabilità sia la stessa se specifico per Drug X o Drug Y. L approccio più corretto è quello di valutare la stabilità su campioni di studio risultati positivi andando a confrontare il titolo del conservato rispetto al fresco.

48 Ruggdness Riproducibilità del saggio in laboratori diversi. Valutazione non necessaria quando è un solo laboratorio ad effettuare le analisi.

49 STRATEGIA GENERALE Studi clinici + Campioni di siero Test di Screening _ Test di conferma _ Report + Caratterizzazione della risposta (Titolo, NAb, isotipo, etc.

50 Confirmatory Assay I campioni risultati positivi al Saggio di Screening devono poi essere analizzati con un Saggio di Conferma (Confirmatory Assay). Lo scopo è verificare se la reattività è dovuta ad ADA (anticorpi specifici per la sostanza). Anche in questo caso si stabilisce un Cut Point (valore percentuale).

51 Confirmatory Assay Screening Assay Confirmatory Assay: Competition with unlabeled Drug Drug ADA ADA Drug Biotin Avidin Plate Biotin Avidin

52 Confirmatory Assay Lo schema sperimentale comprende: * campioni di siero di diversi individui * QCH e QCL * NQC Tutti i campioni sono testati in due forme con aggiunta di buffer o aggiunta di sostanza (drug) Per ogni campione si calcola: % Signal inhibition = 100 * [1 (Study drug inhibited sample / Uninhibited sample)] Specificity Cut Point = Mean % Signal inhibition * Standard Deviation

53 Quantitation of Positive Samples - Titer Se un campione è confermato positivo si procede con la determinazione del titolo. Vengono preparate diluizioni seriali del campione. Cut point Il titolo del campione è il fattore di diluizione al quale la risposta interseca lo screening cut point. TITOLO = Fattore di diluizione Esempio: Diluizione Diluizione 1:2 1:4 1:8 Titolo 2 4 8

54 Anticorpi neutralizzanti (NAbs) Gli Anticorpi Neutralizzanti sono generalmente determinati con due tipi di saggi: Saggi biologici che utilizzano linee cellulari (saggi funzionali) Saggi immunologici competitivi La scelta del formato per determinare i Nabs dipende da: Natura del prodotto Rischio potenziale I saggi biologici sono preferiti per le terapie sostitutive (es. proteine), i saggi immunologici competitivi sono preferiti nel caso di proteine con funzione antagonista (es. mab).

55 Strategia bioanalitica Rischio clinico Basso Medio Alto * Saggio di screening Saggio di conferma Titolo * Analisi in tempo reale NAb anche con saggi immunologici Test NAb contro proteina endogena NAb con saggi cell based preferito Test NAb contro proteina endogena Determinazione Isotipi

56 Conclusioni Importanza di individuare/sviluppare precocemente i reagenti e il saggio Necessità di sviluppare saggi validati in una fase precoce (preclinica). Necessità di sviluppare una strategia per il monitoraggio della immunogenicità per prevenirne le conseguenze Risk Assessment Decisione caso per caso basato sulle caratteristiche del prodotto e della popolazione

57 Grazie per la Vostra attenzione