Genetica Forense: è l'applicazione di tecniche e metodologie molecolari nel contesto legale della genetica, solitamente volta all'identificazione

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1 Genetica Forense: è l'applicazione di tecniche e metodologie molecolari nel contesto legale della genetica, solitamente volta all'identificazione personale.

2 Utilizzi DNA fingerprinting Casi criminali: Test di paternità: Immigrazione: indagato/vittima-traccia paternità controversa relazioni familiari Mass disaster Soggetti scomparsi Identificazioni storiche Identificazione

3 Scoperta dei primi polimorfismi genetici, i gruppi sanguigni AB0, da parte di Landsteiner Locard enuncia il principio secondo il quale ogni contatto Lascia una traccia Scoperta ed uso dei polimorfismi degli enzimi dei globuli rossi Ammissione del DNA nelle corti Ammissione del DNA nelle corti italiane (caso Balzorano) Descrizione del primo Y-STR e Sviluppo dei primi kit commerciali per il profilo di STRs Fondazione del UK DNA Database (profili STR) EPOCA DEGLI SNPs? Primi test, basati sugli anticorpi, per i gruppi sanguigni AB0 (1920s-1950s) Scoperta ed uso di altri gruppi sanguigni e proteine del siero Primo utilizzo del DNA in criminalistica Sviluppo del multilocus DNA fingerprinting da da parte di Jeffreys, seguita dal single-locus-profiling (SLP) Introduzione della PCR in genetica forense Caratterizzazione dei primi STRs umani polimorfi Primo utilizzo del DNA per l identificazione di vittime in disastri di massa (Waco, Texas) Analisi di profili da singole cellule (singolo capello)

4 A. Jeffreys e il DNA fingerprinting

5 METODICA FINGERPRINTING Il DNA viene estratto, digerito con enzimi di restrizione, sottoposto ad elettroforesi, denaturato e trasferito su membrana (southern blotting). Quindi viene utilizzata una sonda multi-locus core minisatellite marcata con radioattivo per l ibridazione. Il segnale radioattivo viene rivelato mediante esposizione di una lastra sensibile ai raggi X

6 CHI E IL COLPEVOLE? C C C C C C 1 2 3

7 FINGERPRINTING 20ANNI FA OGGI

8 Breve storia della genetica forense 1985: MINISATELLITI, inizia l era del DNA typing Il primo caso criminale risolto mediante DNA typing: il signor Colin Pitchfork 1983: Lynda Mann, 15 anni, viene violentata e uccisa nel Leichestershire (UK) 1986: Dawn Ashworth, 15 anni, viene violentata e uccisa nella stessa zona Il modus operandi nei due delitti era lo stesso ed il gruppo sanguigno (gruppo A), determinato dalle tracce di liquido seminale, era il medesimo. 1986: Richard Buckland, un ragazzo del posto, venne incriminato dei due delitti, ma l analisi del DNA mediante fingerprinting rivelò successivamente che egli era innocente. Circa 5000 individui nel Leichestershire possedevano il gruppo sanguigno A. Si organizzò uno screening di massa ed in nessun caso il DNA fingerprinting dei 5000 individui corrispondeva a quello dell assassino. 1987: una persona del posto rivelò che un amico, un certo Colin Pitchford, gli aveva chiesto di partecipare allo screening in sua vece in cambio di denaro. Il signor Pitchfork venne invitato a donare il sangue ed il profilo del suo DNA risultò identico a quello del DNA raccolto sulla scena dei due delitti.

9 IL SOPRALLUOGO GIUDIZIARIO

10 Il sopralluogo è la riproduzione e registrazione dello scenario Nel 1919 Salvatore Ottolenghi, fondatore della Polizia Scientifica parla del sopralluogo come di un portrait parlé, ritratto parlato Sopralluogo Autopsia Ricostruzione di causa e modalità degli eventi

11 RICERCA DELLA TRACCIA

12 Crime Scene Investigation Linee Guida. Departments of Justice USA: a Reference for Law Enforcement Training Evidenzia protocolli ancor più restrittivi: I. Designare aree separate per i rifiuti prodotti nel corso dell investigazione sulla scena; II. Stabilire area/aree come ubicazione per le apparecchiature: III. Nominare un responsabile per la rimozione dei rifiuti: utilizzare PPE (equipaggiamento protettivo personale) specifico; IV. Eliminare il PPF nei contenitori specifici per il rischio biologico; V. Utilizzare attrezzature/equipaggiamento pulite o monouso: VI. Gettare attrezzature/equipaggiamento mononuso nei contenitori per il rischio biologico o nel contenitore specifico dopo l uso; VII. - Pulire lo strumentario riusabile prima della repertazione di ciascuna nuova traccia

13 LA CATENA DI CUSTODIA trasporto analisi campioni residui

14 Repertazione dei campioni Evitare di toccare la zone dove c è una traccia con mani nude Evitare di tossire o starnutire nelle vicinanze della traccia Ogni traccia deve essere collezionata separatamente Macchie di sangue, di sperma, devono essere essiccate direttamente all aria prima di essere sigillate Usare buste di carta non di plastica

15 Repertazione dei campioni Repertare l oggetto macchiato direttamente Rimuovere la macchia su un cotton fioc inumidito o grattarlo a secco

16 Conservazione e trasporto dei campioni Le tracce biologiche si conservano meglio se essiccate e poste in ambiente freddo; condizioni che riducono il tasso di crescita batterica e la degradazione del DNA. I campioni devono essere sigillati e trasportati con cura I campioni vanno conservati a +4 C (breve tempo), a 20 C (lungo tempo) oppure a 80 C.

17 LA RICERCA DELLE TRACCE: METODI FISICI

18 RICERCA DI TRACCE DI LIQ. SEMINALE

19 LA RICERCA DELLE TRACCE: METODI CHIMICI IL LUMINOL (PER IL SANGUE) LA RICERCA DELLE TRACCE: METODI CHIMICI IL LUMINOL (PER IL SANGUE

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21 Codis: Combined DNA Index System Negli anni 90 l FBI propone la creazione di un database nazionale per lo scambio di informazioni tra laboratori a livello federale, statale e locale. Alla fine del 2003 conteneva già oltre 1 milione e mezzo di profili genotipici. In pochi anni si è passati dall uso degli RFLP agli STR Il CODIS è composto da due indici: CONVICTED OFFENDER INDEX (contiene i profili di soggetti colpevoli di crimini a sfondo sessuale o crimini violenti FORENSIC INDEX (contiene i profili genetici estrapolati da campioni biologici rinvenuti sulla scena del crimine All interno del CODIS i profili non sono associati ad altri dati personali del soggetto

22 Le caratteristiche del CODIS sono: Gli STR del CODIS sono adottati da tutti i laboratori di genetica forense Gli alleli degli STR possono essere analizzati rapidamente mediante kit commerciali I dati sono digitalizzati per essere inseriti nel database Grazie all adozione degli STR i laboratori di genetica forense contribuiscono a fornire dati statistici sulle popolazioni nazionali IL CODIS ha 3 livelli gerarchici: Locale (LDIS- local DNA index system) Statale(SDIS- state DNA index system) Nazionale(NDIS- national DNA index system) Lo scambio e la comparazione di profili genetici, a vari livelli, consentono di correlare fatti delittuosi avvenuti in tempi e luoghi differenti. In ambito Europeo a partire dal 1995 l Inghilterra è stata la prima a dotarsi di una banca dati del DNA fino ad arrivare al 2003, anno in cui sono state attivate le banche dati di Ungheria e Lettonia.

23 In Italia L Italia fino a poco tempo fa non disponeva di una banca dati nazionale criminalistica del DNA, già presente in tutti i paesi Europei. Prevaleva il timore, diffuso nell opinione pubblica, della possibilità che dalla banca dati potessero proliferare informazioni personali originariamente non previste. Sono sorti anche problemi di ordine etico: le regioni usate in ambito forense non risultano in alcun caso interessate da alterazioni che siano alla base di patologie. Qualora venga verificata scientificamente tale eventualità si dovrebbe non considerare più utile quel locus per la costituzione della banca dati. Il gruppo di lavoro di biosicurezza e biotecnologie Italiano ha redatto un elaborato che si articola in due punti cardine

24 Art. 13 Cost: La libertà personale è inviolabile. Non è ammessa alcuna forma di detenzione, di ispezione o perquisizione personale né qualsiasi altra restrizione della libertà personale se non per atto motivato dell autorità giudiziaria e nei soli casi e modi previsti dalla legge. [ ] È punita ogni violenza fisica e morale sulle persone comunque sottoposte a restrizioni di libertà.

25 ... Articolo 224 bis Codice di Procedura Penale Provvedimenti del giudice per le perizie che richiedono il compimento di atti idonei ad incidere sulla libertà personale I. 1. Quando si procede per delitto non colposo, consumato o tentato, per il quale la legge stabilisce la pena dell ergastolo o della reclusione superiore nel massimo a tre anni e negli altri casi espressamente previsti dalla legge, se per l esecuzione della perizia è necessario compiere atti idonei ad incidere sulla libertà personale, quali il prelievo di capelli, di peli o di mucosa del cavo orale su persone viventi ai fini della determinazione del profilo del DNA o accertamenti medici, e non vi è il consenso della persona da sottoporre all esame del perito, il giudice, anche d ufficio, ne dispone con ordinanza motivata l esecuzione coattiva, se essa risulta assolutamente indispensabile per la prova dei fatti. II. Direttive del Consiglio dell Unione Europea in materia di Raccolta di campioni biologici di Scambio dei risultati : definiscono i principi fondamentali per la raccolta dei campioni biologici finalizzata alla realizzazione delle banche dati e agli standard che devono essere seguiti per la gestione e la trattazione dei dati. Standardizzazione dei protocolli per lo scambio dei risultati e l impiego degli stessi marcatori genetici. Laboratori delle Forze di Polizia e istituzioni pubbliche o private devono essere accreditati secondo le norme UNI CEI EN ISO/IEC per lo standard di QUALITA.

26 Il prelievo e il ruolo del Laboratorio centrale I condannati, identificati attraverso l Afis (il sistema automatizzato per l identificazione delle impronte digitali del casellario centrale d identit{ del Viminale, collocato alla Direzione centrale anticrimine della Polizia), saranno sottoposti al prelievo di due campioni di mucosa orale che sarà effettuato da agenti penitenziari appositamente addestrati o dalle forze di polizia (in caso di arresti domiciliari o in flagranza). Il compito di accettare, catalogare e conservare i campioni biologici assicurandone la tracciabilità è assegnato invece a un Laboratorio centrale ad ho di circa metri quadrati, collocato al ministero della Giustizia presso la Direzione generale dei detenuti del Dap e dotato di strutture robotizzate. Chi sono gli interessati L archivio dovr{ essere predisposto per la raccolta e il raffronto dei profili del Dna di cinque categorie di persone: coloro ai quali sia applicata la misura della custodia cautelare in carcere o degli arresti domiciliari; chi viene arrestato in flagranza di reato o sottoposto a fermo di indiziato di delitto; i detenuti e gli internati per sentenza irrevocabile per un delitto non colposo; coloro ai quali è applicata una misura alternativa al carcere sempre per sentenza irrevocabile per un delitto non colposo; quelli che scontano una misura di sicurezza detentiva in via provvisoria o definitiva. Chiaro l obiettivo: a regime il sistema permetter{ di confrontare le tracce biologiche sulla scena di un reato con i profili dei pregiudicati. Come d altronde avviene gi{ in gran parte dei Paesi europei.

27 Le cautele per la privacy Il risultato è una miniera di dati sensibilissimi, accessibile per questo - secondo la bozza di decreto del presidente della Repubblica - soltanto da «operatori abilitati e designati incaricati del trattamento dei dati personali ai sensi dell articolo 28 del decreto legislativo 196/2003» (il Codice della privacy), secondo profili di autorizzazione predefiniti, in possesso di credenziali di autenticazione «previo superamento di una procedura informatica di autenticazione forte». Profili e procedure rimandati a un successivo decreto del ministero dell Interno, di concerto con la Giustizia e sentito il Garante per la protezione dei dati personali, da adottare entro trenta giorni dalla data di entrata in vigore del regolamento. Lo scambio dati con l estero Il punto di contatto nazionale per lo scambio dati per le finalità di collaborazione internazionale di polizia è individuato nel Servizio per la cooperazione internazionale di polizia nella Direzione centrale della polizia criminale del Dipartimento della pubblica sicurezza. Responsabile della banca dati è invece il direttore del Servizio per il sistema informativo interforze della stessa Direzione centrale: è lui che ne assicura la funzionalit{ e che garantisce l esecuzione di tutte le misure tecniche e di sicurezza, nel rispetto del Codice della privacy.

28 POLIMORFISMO GENETICO Un sito viene definito polimorfico se di esso si conoscono almeno due forme alleliche la più rara delle quali ha una frequenza di almeno l 1%

29 Il marcatore ideale per studi di mappatura genetica deve essere: altamente polimorfico; analizzabile con una tecnica semplice e a basso costo; analizzabile su un materiale biologico facilmente reperibile;

30 SVILUPPO DEI MARCATORI GENETICI NELL UOMO Tipo di marcatore n loci Caratteristiche Gruppi sanguigni 20 necessità di sangue fresco, talora dominanza Varianti proteiche 30 necessità di sangue fresco, saggi specialistici, polimorfismo limitato, spesso solo 2 alleli RFLP > alleli (eterozigosità massima 0.5), necessità di grande quantità di DNA, procedimento lungo e costoso VNTR (minisatelliti) >10 4 molti alleli, altamente informativi, limitati alle regioni telomeriche VNTR (microsatelliti) >10 5 molti alleli, altamente informativi distribuiti in tutto il genoma SNP >10 6 meno informativi dei microsatelliti ma se ne possono esaminare contemporaneamente migliaia

31 Come li si studia amplificazione tramite PCR del tratto che comprende le repeats e analisi dei prodotti di amplificazione su gel di poliacrilammide (permette la separazione di frammenti di DNA che differiscono anche di un solo nucleotide) o su sequenziatore automatico (elettroforesi capillare)

32 I microsatelliti, STRs, offrono sostanziali vantaggi: sono facilmente amplificabili tramite PCR utilizzando brevi sequenze nucleotidiche (primers) che riconoscono in maniera specifica le regioni fiancheggianti il polimorfismo di interesse; possono essere tipizzati con un alto grado di specificità in tempi relativamente brevi; la loro moderata variabilità permette una corretta tipizzazione degli alleli mediante confronto con un marcatore di peso molecolare noto (ladder); il ristretto range molecolare dei loci STRs, ossia l intervallo di lunghezza tra l allele a più basso peso molecolare e quello a più alto peso molecolare, in genere inferiore a 100 paia di basi, consente un amplificazione omogenea di ciascuno dei due alleli; le ridotte dimensioni molecolari delle relative regioni polimorfe permettono l amplificazione del DNA anche nei casi in cui questo risulti degradato; Elevata eterozigosità (corrisponde alla quota dei loci di un individuo che sono polimorfi); Facilità ad amplificarsi in multiplex. Da svariati anni sono in commercio kit che permettono l amplificazione simultanea di numerosi marcatori: oggi esistono kit commerciali, affidabili e validati che consentono di amplificare 24 STRs, comprendenti sia i marker CODIS (Combined DNA Index System) che i marcatori dell European Standard Set (ESS).

33 I microsatelliti in ambito forense «Il microsatellite ideale» (nella genetica forense) 1) Microsatellite con elevata eterozigosità 2) Microsatellite con range allelico contenuto 3) Microsatellite amplificabile in corti prodotti PCR 4) Microsatellite i cui alleli siano ben separabili su gel 5) Microsatellite che presenti un ridotto fenomeno di stuttering 6) Microsatellite con tasso di mutazione contenuto 7) Microsatellite situato su autosomi Molte di queste caratteristiche si escludono vicendevolmente: Qual è un ragionevole compromesso? Tetranucleotide repeats selezionati

34 STR utilizzati in ambito forense CODIS D8S1179 D21S11 D7S820 CSF1PO D3S1358 THO1 D13S317 D16S539 VWA TPOX D18S51 Amelogenina D5S818 FGA ESS D1S1656 D2S441 D3S1358 FGA D8S1179 TH01 vwa D10S1248 D12S391 D18S51 D21S11 D22S1045

35 I microsatelliti in ambito forense Necessità di identificare un set unico (core) di microsatelliti che sia condiviso da tutta la comunità genetico forense. I kit commerciali sviluppati da Applied Biosystems (a sinistra) e Promega (sotto) permettono di amplificare i 13 STR «core» del CODIS più alcuni altri STR. I kit commerciali sono in continua «evoluzione» inseguendo le richieste della comunità forense ( maggior numero di loci coamplificabili, mini STR, Y-STR, STR ipervariabili ecc.) CS7 PowerPlex,

36 The PowerPlex Fusion System 24 loci, including all CODIS and ESS loci: D3S1358, D1S1656, D2S441, D10S1248, D13S317, D16S539, D18S51, D2S1338, CSF1PO, TH01, vwa, D21S11, D7S820, D5S818, TPOX, D8S1179, D12S391, D19S433, D22S1045, and FGA plus Penta E, Penta D, DYS391 and Amelogenin. CS7 PowerPlex, I loci CS7 includono F13A01, F13B, FESFPS, LPL e Penta C. The most variable locus in our data set is SE33 with 52 observed alleles.

37 Autosomi PowerPlex Fusion System

38 Y-STRs Comprende sei ulteriori STR del cromosoma Y oltre a quelli del kit Applied Biosystems Yfiler : DYS481, DYS533, DYS549, DYS570, DYS576 e DYS643. PowerPlex Y23 System

39 L analisi del cromosoma Y assume un ruolo di primaria importanza: nei casi di paternit{ deficitari : qualora non sia disponibile il padre è possibile fare degli accertamenti indiretti attraverso i fratelli del padre o altri soggetti imparentati in linea paterna; nei casi di mixing biologici che coinvolgono più di due soggetti maschili: in questi casi l analisi può stabilire il numero di tali soggetti; nei casi di violenza sessuale: in tali casi infatti, può essere particolarmente difficile discriminare la componente genetica derivante dalla vittima (cellule mucosali) rispetto a quella derivante dal colpevole (spermatozoi). Il cromosoma Y è l unico materiale genetico posseduto esclusivamente dall individuo di sesso maschile (colui che ha compiuto il reato in questo specifico caso) e non è quindi soggetto alle contaminazioni da parte del DNA della vittima. Chiaramente, per quanto detto prima, è possibile anche rilevare l eventualit{ in cui più di un individuo abbia partecipato alla violenza; nei casi di identificazione di persone scomparse, mediante la comparazione con il profilo ottenuto da parenti di linea paterna.

40 Markers del cromosoma Y Per le caratteristiche biologiche osservate, il cromosoma Y ha il più basso livello di polimorfismi tra i diversi cromosomi umani (International SNP Map Working Group 2001). In particolare il cromosoma Y mostra una variazione di sequenza ogni circa nucleotidi, mentre gli altri cromosomi in media mostrano una variazione di più di un nucleotide ogni Per quanto riguarda l esclusione, se l aplotipo ottenuto dall analisi del cromosoma Y di un sospettato non coincide con quello del colpevole la diagnosi di esclusione è certa (analogamente nei casi di STRs autosomici). Il discorso invece cambia radicalmente quando si tratti di effettuare una conferma sulla base dell aplotipo del cromosoma Y. Il problema chiave, come osservato, è la condivisione dello stesso aplogruppo (aplotipo) da parte di tutti i discendenti per linea paterna. Chiaramente, stabilire l identit{ biologica di una persona esclusivamente sulla base dei risultati forniti dall analisi dell aplotipo del cromosoma Y è impresa piuttosto avventata (lo stesso aplotipo può essere condiviso da tutti i parenti in linea paterna) e suscettibile di errori di false attribuzioni. La tipizzazione del cromosoma Y non è un sistema identificativo e, sebbene particolarmente dirimente in particolari condizioni, questa dovrebbe, ove possibile, essere sempre accompagnata dall analisi del DNA autosomico. Il suo utilizzo appare quindi un elemento di prova addizionale, piuttosto che una valida alternativa.

41 X-strs X-STR: poco utilizzati test di paternità su femmine come prodotti di concepimento di reati sessuali o incesti - verifica di consanguineità tra sorelle. Individui femminili con lo stesso padre biologico presentano uno stesso cromosoma X ereditato dal padre se gli alleli sono diversi (in assenza di mutazioni) allora le figlie hanno padri diversi. Investigator Argus X-12 QS Kit

42 Determinazione del sesso L Amelogenina è una proteina della matrice extracellulare espressa negli ameloblasti durante lo sviluppo dentale e coinvolta nel processo di produzione dello smalto. Il gene è localizzato sui cromosomi sessuali(x, Y) ed è presente in due forme: AmelX e AmelY. Tutti gli individui di sesso femminile presentano due copie del gene AmelX, mentre tutti gli individui di sesso maschile presentano una copia del gene AmelX e una copia del gene AmelY. I geni AmelX e AmelY sono lunghi, rispettivamente, 7.35 e 8.11 kb. Entrambi sono costituiti da 6 esoni e 5 introni. Una parte del primo esone del gene AmelY è più lungo di 6 basi rispetto al gene AmelX. E possibile, quindi, distinguere il DNA di un individuo di sesso maschile e quello di un individuo di sesso femminile dalla lunghezza di questo frammento.

43 L amplificato del soggetto di sesso maschile presenterà due bande di 106bp (AmelX) e 112bp (AmelY), mentre quello del soggetto di sesso femminile presenterà due bande sovrapposte di 106bp (AmelX). F F M

44 Un vantaggio introdotto negli ultimi anni nella tecnica del DNA fingerprinting è che i picchi degli elettroferogrammi vengono convertiti in un formato numerico che si presta bene alla creazione di una banca dati di profili genetici di individui già incriminati.

45 Analisi della traccia Analisi di genere e specie Estrazione DNA Amplificazione e Quantificazione Purificazione (MINELUTE Purification Kit (Qiagen) Analisi del marcatori genetici: autosomi, cromosoma x, cromosoma Y, mt-dna Interpretazione dati,calcolo biostatistico Presentazioni risultati e conclusioni

46 Generare un profilo STR: 2. Amplificazione mediante PCR multiplex Amplificare tramite PCR contemporaneamente più microsatelliti (multiplex), utilizzando primers fiancheggianti ciascun locus. Per ottenere buoni risultati i primers devono essere scelti con attenzione: Le temperature di annealing dei vari primers devono essere simili Devono essere valutate e minimizzate le possibili interazioni tra primers, anche appartenenti a coppie diverse (esempio complementarietà al 3 ) Una valutazione sperimentale della concentrazione ottimale dei singoli primers è sempre necessaria quando si mette a punto una nuova multiplex, così come una titolazione dei vari componenti della PCR.

47 Generare un profilo STR: 2. Amplificazione mediante PCR multiplex Problemi in ambito forense PRESENZA DI INIBITORI: I reperti biologici possono essere mescolati con inibitori della PCR di tipo organico ed inorganico che non sempre vengono eliminati efficacemente negli step di purificazione del DNA. Ulteriore purificazione, BSA, diluzione CONTAMINAZIONE IN LABORATORIO O IN FASE DI REPERTAZIONE: a causa della sua elevata sensibilità, la PCR presenta un forte problema legato alla contaminazione, in misura tanto maggiore quanto più il DNA in esame è scarso e/o degradato. Utilizzazione di guanti monouso e mascherine (in lab e in repertazione) Strumentazione e spazi pre- e post- PCR separati; Utilizzazione di puntali monouso con filtro Irradiazione con UV dell area dedicata alla preparazione della PCR Creazione di un database di profili genetici del personale del laboratorio

48 Generare un profilo STR: 3. Sequenziamento mediante elettroforesi capillare

49 Generare un profilo STR: Prodotto PCR fluorescente viene denaturato con formammide e posto nel campionatore Si applica voltaggio elettrico Il prodotto PCR viene elettroiniettato nel capillare 3. sequenziamento mediante elettroforesi capillare: Il DNA migra nel polimero contenuto nel capillare; tanto più velocemente quanto minore è la grandezza del frammento Quando il frammento arriva in corrispondenza di una finestra nel capillare, una sorgente laser eccita il fluorocromo legato al prodotto PCR Detector Window

50 Generare un profilo STR: 3. sequenziamento mediante elettroforesi capillare (segue) Il fluorocromo eccitato dal laser emette luce nel visibile, in un determinato intervallo di lunghezze d onda e con una intensità che è proporzionale alla quantità di molecole di fluorocromo eccitate. La luce emessa viene filtrata per determinati range di lunghezza d onda e convertita in un segnale elettrico che viene misurato in RFUs (Relative Fluorescence Units). I segnali elettrici vengono tradotti nei tipici picchi colorati degli elettroferogrammi. Argon ion LASER (488 nm) Fluorescence Capillary (filled with polymer solution) ABI Prism spectrograph Color Separation CCD Panel (with virtual filters) Sample Detection Processing with GeneScan/Genotyper software Sample Interpretation

51 RAW DATA Il software GENESCAN divide I dati grezzi in un elettroferogramma separato per ciascun colore Blue Green Yellow Red D3 vwa FGA Il software GENOTYPER identifica i differenti loci e per ciascuno di essi riconosce gli alleli facendo riferimento ad uno standard di peso molecolare e ad un ladder allelico Am D8 D21 D18 D5 D13 D7 PROCESSED DATA

52 ALLELIC LADDER Il Ladder è l insieme degli alleli di un locus rilevati nella popolazione generale. Assegna ad un determinato allele un nome univoco.

53 Test di parentela e paternità L analisi del DNA può essere usata per studi sulla parentela di individui diversi. La maggior parte di questi studi riguarda: 1. Test di paternità 2. Studi per determinare se determinati individui (viventi o deceduti) siano imparentati. 3. Analisi volte a risolvere casi di persone scomparse. 4. Analisi volte ad identificare cadaveri nei disastri di massa 5. Analisi di supporto ad investigazioni criminali ( il parente dell assassino ) 6. Predizione dell origine etnica di un DNA (estendendo il concetto di parentela a quello di «coancestry»)

54 Test di parentela e paternità

55 Test di paternità In tutti i casi, i test di parentela si basano su un concetto semplice: Individui imparentati condividono alleli in una maggiore proporzione (spesso misurabile) rispetto ad individui presi a caso dalla popolazione. Sono, in altre parole, più simili geneticamente

56 Test di paternità Due possibili risultati: (1) Compatibilità: Tutti* gli alleli obbligati paterni del figlio sono presenti nel padre putativo (2) Esclusione: Più* alleli obbligati paterni del figlio non sono presenti nel genotipo del padre putativo * Attenzione ad alleli nulli e mutazioni!!!

57 Test di paternità Allele obbligato paterno L allele (i) che il padre DEVE avere In base alle leggi dell ereditariet{ (1 legge Mendel ), considerando un locus autosomico e assumendo che la madre sia certa, se si conosce il genotipo di madre e figlio, è possibile dedurre (nella maggior parte dei casi) l allele di origine paterna. Oppure (nei casi meno fortunati) due alleli di cui uno sia di origine paterna. Questo allele (o alleli) deve essere presente nel padre putativo (allele obbligato) pena esclusione della paternità.

58 Laddove ci fossero una o due incompatibilità si impone il calcolo biostatistico perché potrebbe trattarsi del raro ricorrere di mutazioni. Per tre incompatibilità la regola empirica prevede l esclusione della paternit{.

59 Test di paternità In caso di esclusione, il test può considerarsi concluso In caso di compatibilità, è necessario quantificare il peso dell osservazione. P.I. = Indice di paternità (per un locus) C.P.I = Indice di paternità combinato (considerando più loci).

60 Test di paternità Indice di paternità L indice di paternit{ si calcola attraverso il rapporto di due probabilit{: (1)Numeratore: probabilit{ che il padre putativo trasmetta l allele(i) obbligato essendo il vero padre. Il trio in analisi è un vero trio (2)Denominatore: probabilità che un uomo qualsiasi della popolazione trasmetta l allele(i) obbligato essendo il vero padre. Il trio in analisi è un falso trio Queste due probabilità discendono rispettivamente dalle leggi di Mendel e dalle leggi della genetica di popolazioni, il loro rapporto esprime una verosimiglianza (Likelihood Ratio, LR)

61 Test di paternità Indice di paternità: Esercitarsi nel calcolo! Esempio (semplice): Madre AB, Figlio AC, Padre AC (1) Individuare l allele/i paterno obbligato/i (allele C in questo esempio) (2) Numeratore: Probabilità che il padre trasmetta l allele obbligato = ½ (Mendel!!) (3) Denominatore: Probabilità che un individuo a caso della popolazione trasmetta l allele obbligato = Frequenza dell allele nella popolazione (Hardy-Weinberg!!) necessità di utilizzare database di frequenze alleliche. Se l allele C ha frequenza nella popolazione (ad esempio) p C = 0,1, allora (in questo esempio): P.I. = 0,5/0,1 = 5

62 Test di paternità Indice di paternità Figlio Madre Padre presunto

63 Test di paternità Indice di paternità Un solo locus non è generalmente sufficiente per ottenere una informazione che abbia un peso rilevante circa la compatibilità osservata. Si considerano più loci C.P.I = Indice di paternità combinato Si ottiene come prodotto dei singoli P.I. Un valore di CPI > 100 viene in genere considerato sufficientemente alto da far ritenere il padre putativo il vero padre. CPI = 100 significa: «E 100 volte più probabile ottenere i risultati osservati (i profili genetici dei tre soggetti del trio) se il padre putativo (piuttosto che un uomo preso a caso dalla popolazione) è il vero padre Con i loci microsatelliti attualmente in uso in genetica forense, in caso di compatibilità si ottengono valori di CPI >> 100

64 Probabilità di paternità > 99,9999%

65 Test di paternità Test di paternità in presenza di mutazioni In caso di esclusione si osserva generalmente non compatibilità per più loci. Ma come considerare una situazione in cui solo uno (o pochi ) dei loci analizzati non sono compatibili? Bisogna tener conto delle possibili mutazioni Tasso di mutazione? Come si tiene conto delle mutazioni? two exclusion rule e CPI in presenza di mutazioni

66 Test di paternità Test di paternità in assenza di madre In caso di assenza della madre è sempre possibile determinare quale/i siano gli alleli obbligati paterni. In caso di non paternità, sarà molto frequente ottenere un giudizio di esclusione In caso di paternità, si avranno meno informazioni per dare un peso alla compatibilità osservata Si può utilizzare anche in questo caso il CPI

67 grado di eterozigosit{: fondamentale, maggiore l eterozigosit{, maggiore l informazione: OK minisatelliti, STR ereditarietà mendeliana: importante per una più facile trattazione statistica OK STR, SNPs tempi tecnici dell esperimento costi dell attrezzatura costi dell esperimento precisione del metodo Nella pratica forense per i test di paternità si utilizzano quasi solamente STRs

68 Captured December 13, 2003 Utilizzi Dna fingerprinting Uday and Qusay Hussein Questo uomo è realmente Sadaam Hussein? Killed July 22, 2003 Butler, J.M. (2005) Forensic DNA Typing, 2 nd Edition, Box 23.1, p. 534

69 1. DNA degradato 2. DNA scarso 3. Campioni misti Situazioni molto comuni nelle indagini forensi di tipo investigativo Quali strategie (tecniche e computazionali) possono essere utilizzate per risolvere casi in cui sono coinvolti campioni di questo tipo?

70 Reperti difficili: 1. DNA degradato L esposizione all ambiente (acqua,batteri e funghi, UV, nucleasi) determina la progressiva degradazione del DNA. In presenza di DNA degradato, il vantaggio dell utilizzazione di marcatori «corti» quali gli STRs è evidente. Se il DNA è fortemente degradato, potrebbero presentarsi dei problemi di amplificazione utilizzando le multiplex STRs, principalmente a carico dei microsatelliti in ampliconi più grandi. Progressiva diminuzione dell amplificato

71 S M A L L Degradazione L A R G E Quando il campione biologico è esposto a condizioni ambientali avverse, si degrada: caldo, umido, luce solare, tempo La degradazione rompe il DNA in punti random

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73 Base pairs Reperti difficili: 1. DNA degradato In situazioni di forte degradazione, si può ricorrere a markers/strategie alternative rispetto agli STR convenzionali In questi casi si possono utilizzare: -SNPs (ampliconi < 100 basi) -mtdna (l elevato numero di copie rispetto al nucleare aumenta la probabilità che i primer si appaino ad un segmento di DNA «intatto») -«Mini-STRs» (STR con primer ridisegnati in modo da ottenere ampliconi più piccoli di quelli utilizzati normalmente) -Altre possibilità valutate: aree protette da nucleosomi, riparazione del DNA RFLP (minisat multi-locus D1S80 STRs ministrs SNPs Differenti Markers

74 Reperti difficili: 1. DNA degradato Mini STR

75 Reperti difficili: 2. DNA scarso (Low Copy Number ~ Low template; «touch» DNA) Si parla di «low template» DNA (LT-DNA) quando la quantità di DNA disponibile per l analisi è inferiore a pg (il contenuto in DNA di cellule diploidi). Sebbene la PCR sia in grado (con qualche difficoltà) di amplificare un bersaglio a partire da una sola cellula, il problema principale del LT-DNA è quello della sensibilità del metodo. Nel tempo sono stati messi a punto vari sistemi per aumentare il prodotto PCR, ad esempio aumentando il numero di cicli. Un alternativa agli STR, in caso di LT_DNA, è l analisi di mtdna Perché? Vantaggi e svantaggi

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77 Problemi nell interpretazione di profili STR A. Problemi «biologici» Alleli nulli e fenomeno drop-out In presenza di una mutazione al 3 del sito di annealing di uno dei due primers utilizzati per amplificare un STR, la Taq polimerasi non è in grado di sintetizzare il prodotto PCR. La conseguenza può essere quella che solo uno dei due alleli STR vengono amplificati. Punti da considerare: -Kit differenti per STR multiplex con diversi set di primers -Problemi per il confronto con databases: stringenza della ricerca di match -Problemi nei test di paternità

78 Dropout allelico Campione di riferimento 1500 Campione da analizzare 150? Quando il DNA estratto è molto scarso o fortemente degradato si può verificare che uno solo dei due alleli ad un locus venga amplificato. Nella figura l allele 14 al sito D13S317 non si è amplificato: Falso omozigote 8/8, in realtà eterozigote 8/14

79 LIMITI NELLA TIPIZZAZIONE TRAMITE STRs Campioni di DNA degradato potrebbero essere difficili da analizzare I risultati ottenuti potrebbero essere difficili da interpretare Gli STRs sono soggetti ad artefatti Le tecnologie richieste sono molto costose

80 Thresholds Soglia stocastica: 150 RFU (Unità relativa di fluorescenza) (In presenza di LCN può diminuire purché sia validata dal laboratorio secondo gli standard interni) Soglia analitica: 50 RFU LOQ: è la più bassa concentrazione di analita che può essere determinato con una precisione accettabile LOD: è il limite di sensibilità del segnale rilevabile. Il limite di detenction è RFU

81 EFFETTI STOCASTICI Amplificazione sproporzionata di due alleli ad un locus eterozigote Allele dropout e alleli nulli Falsa omozigosi Extrapicchi & Off ladder Stutter Effetto pull up Poliadenilazione

82 Problemi nell interpretazione di profili STR Aggiunta di adenina al 3 incompleta A. Problemi «biologici» La Taq polimerasi in genere aggiunge al 3 del filamento PCR neosintetizzato un adenina. Le multiplex STR sono ottimizzate in modo che questo avvenga regolarmente. Può accedere tuttavia in alcuni casi che si verifichi una adenilazione incompleta dei prodotti PCR, che da luogo, per ciascun allele) a due picchi distanziati di una sola base nell elettroferogramma. +A Incomplete adenylation +A Punti da considerare: Un picco più corto di una base rispetto al normale potrebbe essere interpretato come una «microvariante» -A -A D8S1179

83 Problemi nell interpretazione di profili STR Alleli «off ladder» A. Problemi «biologici» Sono alleli che presentano un numero minore (alleli below ladder ) o maggiore ( above ladder ) di ripetizioni di quante ne siano presenti nei ladder commerciali per multiplex STR. Sono considerati off ladder anche gli alleli con una lunghezza dell amplicone PCR tale da ricadere tra due alleli del ladder (microvarianti o alleli between ladder ), generalmente dovuti a piccole inserzioni delezioni nell amplicone. Allelic ladder Allelic ladder Allelic ladder below ladder above ladder between-ladder (microvariante)

84 Microvarianti e alleli off-ladder Microvarianti: alleli rari che differiscono dalle forme più comuni per una o più coppie di basi a causa di inserzioni, delezioni o cambiamenti nucleotidici e differiscono pochissimo dagli alleli contenenti ripetizioni complete (0.2 bp). Off-Ladder: le microvarianti rare, non sono contenute nel ladder allelico, perciò si presentano con una taglia diversa (più di 0.5 bp) da quella degli alleli del ladder

85 Stutter Si producono a causa dello slippage della polimerasi durante l amplificazione Sono caratterizzati da una unità ripetuta in meno (4 Basi) Altezza picco stutter/ altezza picco principale*100 La percentuale varia in relazione - al locus -all allele In genere inferiore al 10% - 15%

86 Problemi nell interpretazione di profili STR A. Problemi «biologici» Prodotti «stutter». Come conseguenza dello scivolamento della polimerasi nell amplificare durante la PCR ripetizioni in tandem (fenomeno analogo a quello che porta alla mutabilità in natura dei microsatelliti) si ottengono alcuni prodotti PCR più corti di un unit{ rispetto al numero di ripetizioni dell allele amplificato. In genere, il prodotto dello stuttering ha un altezza inferiore al 20% del picco «reale» (almeno per i loci validati in ambito forense). Punti da considerare: - differenze tra loci, - differenze per lo stesso locus in esperimenti diversi, - possibili problemi nell interpretazione di tracce miste.

87 Formazione degli stutter Amplificazione normale Slippaggio Walsh et al (1996) Nucleic Acids Res. 24:

88 Mixture - Contaminazione Contaminazione: aggiunta di materiale biologico o di DNA durante o dopo la repertazione dei campioni. Mixture: campione contente DNA appartenente a due o più individui diversi.

89 TRACCIA LCN INDAGATO IL CASO BORDERLINE ESCLUSIONE O NON ESCLUSIONE? 1ng 50 µl PCR Drop Out 8pg 5 µl PCR Drop In Sbilanciamento Da: D. Hobson - LCN Workshop AAFS 2003

90 ANALISI E INTERPRETAZIONE TR. FRESCA INDAGATO TR. MISTA? TR. SCARSA? TRACCIA CON DNA DEGRADATO NESSUN RISULTATO

91 TRACCE MISTE Nel caso di violenza con più aggressori Nel caso di commistione tra fluidi biologici appartenenti a più individui Valutazione dei profili e dell altezza dei picchi

92 Relative Fluorescence Units Sample Mixture Example 4 picchi in un singolo locus D3S1358 Profiler Plus data VWA FGA Più alto di una stutter band blue panel Amel D8S1179 D21S11 green panel D18S51 Imbalance tra X e Y D5S818 D13S317 Stutter nella posizione sbagliata D7S820 yellow panel

93 IL TEST DEL DNA INTEGRA GLI ELEMENTI A DISPOSIZIONE DEGLI INVESTIGATORI E DEL GIUDICE.

94 COSA NON PUÒ DIRE IL TEST DEL DNA QUANDO LA TRACCIA È STATA DEPOSTA IN QUALI CIRCOSTANZE / MODALITÀ IN UNA TRACCIA MISTA LA COMPONENTE MINORE SPARISCE IN UNA TRACCIA MISTA QUALE SIA STATA DEPOSTA PER PRIMA.

95 Le alternative agli STR autosomici

96 Non solo STR: gli SNPs nelle scienze forensi Sebbene gli STR autosomici siano i marcatori d elezione della genetica forense, in alcuni casi si fa ricorso a marcatori differenti (SNPs) o situati su porzioni del genoma non autosomiche (mtdna oppure cromosoma Y). Gli SNPs sono utilizzati principalmente quando il DNA da analizzare è fortemente degradato (prodotti PCR più piccoli, quindi maggiore probabilità di successo tecnico). Trovano tuttavia applicazione anche in: Predizione circa la popolazione di origine di un reperto biologico (AIMs, ancestry informartive markers) Predizione di caratteristiche fenotipiche. Ad esempio il fenotipo «capelli rossi» può essere dedotto (in una certa misura) dall analisi di polimorfismi nel gene «recettore della melanocortina 1» (MC1R).

97 45 SNPs risultati associati alla variazione del colore dei capelli localizzati su 12 geni Branicki et al., (2011). Model-based prediction of human hair color using DNA variants Human Genet

98 Modello predittivo finale Area Under the Curve La selezione degli SNPs si è basata sul contributo di ciascuno di essi sull accuratezza predittiva, attraverso l utilizzo di procedure automatizzate come lo STEP-WISE ANALYSIS MC1R, OCA2 (rs ), HERC2 utilizzati per il loro grande contributo all effetto fenotipico

99 AUC CURVE La statistica di sintesi per valutare l accuratezza di un modello predittivo è l aera sottesa alla curva AUC Accuracy of hair color prediction RED OVER 0.9 BLACK ALMOST 0.9 BLOND OVER 0.8 BROWN ALMOST 0.8

100 Da questo studio è emerso che: La predizione del biondo e del castano è più bassa di quella del rosso e del nero L et{ ed il genere non sono risultati significativi nell accuratezza della predizione Ci sono differenze tra studi eseguiti con singolo osservatore e quelli eseguiti con l utilizzo dello spettrofotometro La predizione più alta la troviamo nel colore dei capelli ROSSO e NERO con un accuratezza del 90%, per i colori BIONDO e CASTANO l accuratezza si abbassa all 80%

101 Conclusioni Il numero di campioni utilizzato è abbastanza grande da ottenere un modello di ragionevole accuratezza e si auspica che tali risultati possano essere confermati e ed utilizzati in ulteriori studi. Ci si aspetta che per la predizione del colore dei capelli basata sull analisi del DNA, i marcatori consigliati in questo lavoro siano utilizzati in future applicazioni pratiche soprattutto per ciò che riguarda il contesto forense. Infatti, grazie a questo modello possiamo ottenere dal genotipo estrapolato da una traccia sulla scena del crimine, informazioni utili soprattutto nei casi in cui non vi è il sospettato.

102 Marcatori autosomici, del mtdna e del cromosoma Y: vantaggi e svantaggi nelle scienze forensi

103 Marcatori uniparentali nelle scienze forensi Cromosoma Y si utilizzano principalmente Y-STR La variabilità del cromosoma Y viene sfruttata nelle scienze forensi principalmente nei casi di misture maschio-femmina (es. violenza sessuale), per ottenere un profilo STR maschio-specifico non contaminato dal DNA della vittima. Problemi principali: Essendo un cromosoma non ricombinante ( a parte le PAR) la variabilità si accumula solo per mutazione. Minore informazione e impossibilità di ottenere probabilità di match con la regola del prodotto (si usa la frequenza dell intero aplotipo nella popolazione) Altre applicazioni interessano: - test di parentela nei quali non siano disponibili parenti stretti del probando (il profilo STR del cromosoma Y sarà identico in parenti anche molto lontani lungo le linee di discendenza maschile) - Misture con un numero elevato di maschi possono essere più facilmente interpretabili se si analizza il cromosoma Y. - Maschi deficienti per amelogenina

104 La probabilità di match: la regola del prodotto Il peso di una corrispondenza (match) tra un profilo di DNA ed un sospetto è quantificato tramite la probabilità di match, cioè: La probabilità che due persone non imparentate condividano lo stesso profilo genetico. Si applica la regola statistica del prodotto per eventi indipendenti

105 Probabilità di match: la regola del prodotto x 1 in 10 1 in in 20 x 1 in in 14 1 in 81 x x 1 in 22,200 x 1 in in 17 1 in 16 1 in 113,400 1 in 31,552 1 in 79,531,528,960,000,000 x By NA

106 Marcatori uniparentali nelle scienze forensi mtdna si utilizza principalmente la sequenza delle regioni ipervariabili (nel mtdna umano non ci sono microsatelliti!!) La variabilità del mtdna viene sfruttata nelle scienze forensi principalmente nei casi di DNA degradato o scarso, a causa dell elevato numero di copie di mtdna per cellula. Al pari del cromosoma Y, il mtdna viene usato anche nei test di parentela nei quali non siano disponibili parenti stretti del probando (la sequenza del mtdna sarà identica in parenti anche molto lontani lungo le linee di discendenza femminile). Problemi principali: Come il cromosoma Y, mtdna è un sistema non ricombinante e quindi la variabilità si accumula solo per mutazione. Ne consegue minore informatività («minore» variabilità) e impossibilità di ottenere probabilit{ di match con la regola del prodotto (si usa la frequenza dell intero aplotipo nella popolazione per dare un peso alle compatibilità). Il DNA mitocondriale, per il tipo di genotyping cui è sottoposto (sequenziamento) non si presta facilmente nella risoluzione delle misture. La presenza frequente di eteroplasmia rappresenta un problema, soprattutto nel confronto di profili genetici provenienti da DNA estratto da tessuti diversi

107 Presentazione risultati e conclusioni L utilizzo di affermazioni come: probabilit{ praticamente accertata tizio è padre di..l assassino è E da ritenersi assolutamente IMPROPRIO! L esperto fornisce solo ed esclusivamente i valori ottenuti dai vari approcci biostatistici illustrandone il risultato probabilistico. Dall analisi dei loci si evince che la probabilit{ che Tizio sia il padre biologico di Caio è di 1.3x10⁶ volte, rispetto ad un individuo preso a caso nella popolazione di riferimento. Tizio è compatibile biologicamente in tutti i loci analizzati stimando una probabilit{ di compatibilit{ pari a 99, Indicare il colpevole o attribuire una paternità è esclusivamente compito del giudice.

108 Test di parentela Investigazioni su persone scomparse Tre categorie di campioni utilizzabili per identificazione di persone scomparse tramite l analisi di profili genetici: 1) Campioni provenienti dall individuo scomparso (spazzolino da denti, pettine, vestiti, vecchi reperti medici come biopsie) 2) Campioni di parenti che possono essere utlizzati per ricostruire il genotipo dell individuo scomparso ( reverse parentage testing ) 3) Campioni provenienti da resti umani non identificati Si utilizzano e si confrontano: (1) database di profili di DNA di persone scomparse; (2) database di profili di resti umani non identificati; (3) database di profili di parenti di persone scomparse

109 Test di parentela Identificazione delle vittime dei disastri di massa (DVI) Tre categorie di campioni utilizzabili per identificazione di vittime di disastri: 1) Campioni provenienti dall individuo scomparso (spazzolino da denti, pettine, vestiti, vecchi reperti medici come biopsie) 2) Campioni di parenti che possono essere utlizzati per ricostruire il genotipo dell individuo scomparso ( reverse parentage testing ) 3) Campioni provenienti dai resti rinvenuti sulla scena del disastro Problemi: - Complicazioni dovute al numero di vittime - In alcuni casi frammentazione e dispersione dei reperti - Spesso DNA fortemente degradato a causa di incendi

110 Identificazione delle persone disperse nel World trade center in seguito ad attacco terroristico del 9/11 Il progetto ha generato 52,000 profili STR 44,000 profili mtdna 17,000 profili SNPs 850 delle 1594 vittime identificate grazie all analisi del DNA

111 Mini STR AmpFlSTR MiniFiler. The primers amplify the STR loci D13S317, D7S820, D2S1338, D21S11, D16S539, D18S51, CSF1PO, FGA, and the gender marker Amelogenin. AmpFlSTR MiniFiler PCR Amplification Convalidato secondo le norme / Nazionali FBI e le linee guida SWGDAM.

112 L utilizzo dei micro RNA Microarrays qrt-pcr RNA SEq

113 L utilizzo dei micro RNA

114 RM- YSTR Analysis of Y-chromosomal short tandem repeat (Y-STR) loci provides an extremely useful tool in forensic DNA testing. In particular, it allows the unambiguous detection of the male DNA component in mixtures with a high female background, as often found in sexual assault cases. Moreover, due to their haploid nature and uniparental transmission favouring the geographical clustering of haplotypes, Y-STRs can provide intelligence information on the ethnic origin of a stain donor in non-suspect cases. The principal weakness of Y-STR analysis is that, even when a crime sample matches the Y-STR haplotype of a suspect, his patrilineal relatives cannot be excluded as being the donor of the stain. Adding additional markers to the current sets of Y-STRs used in forensic casework can improve the level of paternal lineage differentiation. Since mutation is the only genetic force behind Y-haplotype variation, Y-STRs displaying high mutation rates are best fitted for this purpose. A systematic Y-STR mutation study by Ballantyne et al. identified a set of 13 novel rapidly mutating (RM) Y-STR markers with exceptionally high mutation rates (>10 2 per locus per generation) if compared to >170 other Y-STRs including all conventionally used markers, the latter in the order of a few mutations per marker every 1000 generations. RM Y-STRs have been demonstrated not only to improve the resolution of male lineage differentiation, but also to allow close male relative separation with a power unsurpassed by standard Y-STRs.

115 Genetica Forense Testo consigliato: Per eventuali approfondimenti:

116 Grazie per l attenzione!!