Il cluster a-globinico: organizzazione, alterazioni molecolari e classificazione delle a-talassemie Cristina Passarello U.O. Ematologia II Laboratorio per lo Studio e la Diagnosi Molecolare Prenatale di Talassemia A.O. V. Cervello, Palermo Durante i diversi periodi di sviluppo (Embrionale, Fetale ed Adulto) sono presenti diversi tipi di emoglobine, costituite da coppie diverse di catene; si può notare che alcune catene sono specifiche per un tipo di emoglobina, mentre altre sono comuni a più tipi. Le catene comuni sono: le catene z presenti all inizio del periodo embrionale (nell Hb Gower I e nell Hb Portland) e le catene a presenti a partire dalla 6 a settimana di gestazione (dalla Hb Gower II all Hb Adulta). I geni che codificano le catene z ed a si trovano all estremità distale del braccio corto del cromosom6; l insieme di questi geni è definito cluster alpha. Cluster alpha ζ 2 ψζ 1 ψα 2 ψα 1 α 2 α 1 θ HVR Inter-ζ HVR HVR α MRE HS-40 sequenze Alu I Cromosoma 16pter-p13.3 Regione di circa 30 Kb molto ricca in G + C (60%) Dr.ssa Il cluster alpha si trova in una regione del DNA di circa 30 Kb particolarmente ricca in GC (60%) ed include, secondo il loro ordine di attivazione ed espressione durante i vari periodi di sviluppo, in direzione i geni: ζ 2, tre pseudogeni (geni che presentano delle omologie di sequenza con gli altri loci globinici ma presentano delle mutazioni che li rendono non funzionali e quindi non essenziali) Ψζ 1, Ψα 2,Ψα 1, i geni α 2 ed α 1 ed infine lo pseudogene θ. A monte del cluster alpha da circa -30 a -60 Kb dal cap del gene ζ 2, è presente una sequenza regolatrice positiva α MRE (il cui principale elemento regolatore positivo è il sito HS-40) simile a quella identificata alla LCR a monte del cluster β. Geni Alpha: I due geni α 2 ed α 1 sono il risultato di una duplicazione avvenuta circa 60 milioni di anni fa; sono inseriti in tre grandi sequenze omologhe (, ed ) anch esse duplicate in tandem. Sono entrambi costituiti da 3 esoni perfettamente identici fra loro e le uniche differenze si possono riscontrare all interno del II introne (sostituzione Esone 1 Esone 2 Esone 3 UTR di una base e delezione di sette basi nell α Cd 1-31 IVS I Cd 32-99 IVS II Cd 100-142 2 117 bp α 2 142 basi GT AG GT AG rispetto all α 1 ) e dopo il 3 esone, nella regione CAP α 1 149 basi ATG fiancheggiante UTR (sostituzione di diciotto Promoter CAAT ATA basi e delezione di una base nell α 2 rispetto CCGCC all α 1 ). Un altra differenza si riscontra a livello di espressione: il gene α 2 ha un ruolo predominante UTR TAA AATAAA Dr.ssa 12
rispetto ad α 1 come si evidenzia dal rapporto fra gli mrna, che risulta ~2.6-2.8 a favore dell α 2. Le Alpha Thalassemie sono causate da difetti genetici che determinano un decremento o una completa soppressione delle catene α. Fenotipicamente si distinguono in: a + thalassemie: si hanno 3 geni funzionanti su 4; il quadro ematologico è pressoché normale (lieve microcitemia) ed un quadro emoglobinico normale (livelli di HbA 2 nella norma). a 0 thalassemie: si hanno 2 geni funzionanti su 4; il quadro ematologico è evidente (marcata microcitemia) ed un quadro emoglobinico pressoché normale (livelli di HbA 2 da lievemente più bassi a normali). I geni non funzionanti possono trovarsi in cis sullo stesso allele o in trans, su alleli diversi per associazione tra alleli α +. L'interazione tra un determinante α + ed uno α 0 causa la malattia da Hb H (β 4 ): la presenza di 3 geni α non funzionanti porta ad una deficienza quantitativa dell mrna dell α globina rispetto all mrna della β globina. Le catene β e γ in eccesso si associano in tetrametri, β 4 e γ 4, inefficienti dal punto di vista funzionale, che si ossidano e precipitano rapidamente. Si ha una eritropoiesi inefficace, ma anche una discreta quota di eritropoiesi efficace che produce emazie mature ma con breve vita a causa dei precipitati. Le emazie vengono sequestrate e distrutte nella milza che di conseguenza aumenta di volume (nei casi più gravi si ricorre a splenectomia). Una quota di catene α, sia pur piccola, continua ad essere prodotta e dà luogo a piccole quote di HbA, HbA 2 ed HbF. Il paziente riesce a condurre una vita normale con un livello di Hb basso ma che, in generale, non richiede terapia trasfusionale; può però, andare incontro a gravi crisi emolitiche in caso di assunzione di farmaci ossidanti (sulfamidici, altimalarici). Si può avere una forma grave di malattia da Hb H in pazienti con genotipo α 0 da delezione ed α + da mutazione puntiforme. La malattia si manifesta nella prima infanzia con grave anemia, crisi emolitiche e splenomegalia per cui sono richieste trasfusioni e splenectomia. L'interazione tra due determinanti α 0 causa la Sindrome dell Idrope Fetale con Hb Bart (γ 4 ): nessuno dei 4 geni alpha è funzionale e si ha una totale incapacità di sintetizzare catene α; circa il 25% dei feti muore in utero tra l8 a e la 38 a sett. il resto alla nascita o poco dopo. Natura molecolare delle Alpha-Thalassemie: Possono essere causate da delezioni di variabile lunghezza o da mutazioni puntiformi; data la particolare struttura del cluster alpha (presenza di molte regioni omologhe ripetute) le delezioni sono la causa predominante delle alpha-thalassemie. Tipi di mutazioni da delezione: Le delezioni corte che eliminano un solo gene α determinano un fenotipo da α + ; alcuni esempi sono la α 3.7, la α 4.2, la α 3.5, la α 2.7, la (α) 5.3. Tra queste le più comuni nell area Mediterranea sono la α 3.7 e la α 4.2 che si formano, rispettivamente, per ricombinazione errata fra le regioni omologhe ed. Nella a 3.7 si ha la formazione di un gene ibrido α 2 /α 1 meno funzionale rispetto ai geni normali. Esistono tre tipi di delezione α 3.7 a seconda del punto esatto di ricombinazione; tra questi il tipo I è maggiormente presente in Sicilia anche se in misura minore si riscontra anche il tipo II. Le due forme presentano un fenotipo differente: il tipo II risulta essere più grave, con un fenotipo a metà fra un α + ed un α 0 e questo perché alla delezione è sempre associata una delezione di 2nt (AC) a monte del codone d inizio che diminuisce l efficienza di traduzione del gene. 13
La controparte della delezione α 3.7 è la formazione di un allele con due geni alpha ed un gene alpha ibrido chiamata ααα anti 3.7 ; questa condizione è particolarmente importante in caso di coeredità con un determinante β talassemico, in quanto non fa altro che aumentare lo sbilancio delle catene α/β. Nella a 4.2 si ha l eliminazione dell intero gene α 2 e rimane soltanto un gene α 1 ; la controparte è la condizione di ααα anti 4.2. Delezione - a 3.7 Delezione-a 4.2 / aaa anti 3.7 aaa anti 4.2 Dr.ssa a 2 / -a 3.7 Dr.ssa a 1 -a 4.2 Le delezioni lunghe che eliminano due geni α determinano un fenotipo da α 0 ; si possono formare per rotture cromosomiche o per ricombinazione errata fra regioni omologhe e non omologhe. Alcuni esempi di delezioni lunghe presenti nel Mediterraneo sono: -(α) 20,5, la α --MED, la α --CAL. Alcuni Esempi di fenotipi da alpha-thalassemia di tipo delezionale: RBC HB HCT MCV MCH MCHC RDW A 2 4.94 13.7 40.8 82.6 27.7 33.5 13.1 2.9 5.14 13.7 41.8 81.5 26.7 32.7 13.9 2.7 6.23 14.6 45.1 72.3 23.4 32.4 14.4 2.5 5.45 13.5 40.9 74.9 24.8 33.1 14.5 2.3% 5.59 12.3 38.5 68.8 22.1 32.1 14.2 2.7 6.39 13.3 40.4 63.0 20.7 32.9 13.8 2.4 genotipo: a 3.7 /aa a 4.2 /aa a 3.7 I /a 3.7 I -(AC)a 3.7 II /aa a -- MED /aa a -20.5 /aa Mutazioni puntiformi: Includono sostituzioni di un singolo nucleotide, piccole delezioni o inserzioni; possono coinvolgere la sequenza codificante, regioni regolatrici o di segnale non tradotte o aree critiche la cui integrità è importante per un corretto processamento dell mrna. La maggior parte coinvolgono il gene α 2 (286 contro 250 in α 1 ), in accordo con l espressione dominante di quest ultimo rispetto ad α 1. Alcuni esempi di mutazioni puntiformi presenti nel Mediterraneo sono: α 2 NcoI, α 2 HphI, α 1 NcoI, α 2 SaudiArabia. 14
HphI La mutazione α 2 consiste in una piccola delezione di 5nt che inattiva il sito corretto di splicing attivandone un secondo all interno dell esone I; viene inoltre obliterato un sito di restrizione per l enzima HphI Altre mutazioni che causano difetti di maturazione sono quelle che colpiscono il sito di PolyA, determinando un mrna più lungo della norma; un esempio è α SaudiArabia 2 che presenta un fenotipo α +/0 in quanto, non essendoci un successivo terminatore, la trascrizione potrebbe raggiungere il successivo gene α 1 interferendo anche con la normale espressione di quest ultimo. Ci sono poi mutazioni che determinano difetti di traduzione come quelle che colpiscono il codone di termine 142 (α ConstantSpring 2 ) ed altre che causano instabilità post-traduzionale. Altre ancora possono generare delle varianti. Alcuni Esempi di fenotipi da alpha-thalassemia di tipo puntiforme: RBC HB HCT MCV MCH MCHC RDW A 2 5.65 14.4 43.7 77.3 25.5 33.0 14.1 2.6 5.55 13.5 41.3 74.0 24.2 32.6 14.2 2.7 4.93 13.0 39.7 80.4 26.4 32.8 13.7 2.4% 4.42 11.6 33.3 75.3 26.2 34.8 14.0 2.8% 6.07 15.2 46.4 76.4 25.0 32.8 15.5 2.5% genotipo: a HphI a/aa a NcoI a/aa a CS a/aa aa Bernalda /aa a SaudiArabia a/aa E da notare che vi sono alcune forme di Alpha Talassemia, molto rare, che risultano essere associate a Ritardo Mentale. Una di queste è l ATR-16, trovata in pochissimi casi come mutazione ex novo o come mutazione ereditata da un portatore che la presentava in maniera bilanciata. La patologia è causata dalla rottura telomerica del braccio corto del cromosom6, coinvolgendo così il cluster alpha globinico ed anche altri geni coinvolti nel corretto sviluppo mentale. Un altra forma di alpha talassemia associata anche questa con Ritardo Mentale è l ATR-, causata però da una alterazione nel cromosoma q13.3 che colpisce il gene ATR; il prodotto del gene è probabilmente una proteina coinvolta nella regolazione genica, ma la sua esatta funzione è ancora oggetto di studio. Forse la proteina ATR fa parte di un complesso di rimodellamento della cromatina, favorendone il passaggio alla forma attiva in maniera diretta o indiretta. 15
Vengono riportate anche forme di alpha talassemia con HbH acquisite in associazione con disordini mieloproliferativi (ATDMS); sono presenti in un registro internazionale 68 casi accertati in cui la presenza della alpha talassemia è non ereditata, presente soltanto dal momento della comparsa della neoplasia ematologica, e con una presenza di corpi di Heinz all interno degli eritrociti. Frequenze dell Alpha Talassemia Nel mondo questa forma di talassemia è particolarmente presente in Asia e soprattutto in Cina, Giappone ed in tutto il bacino della Melanesia. Nel Mediterraneo così come la β tal, è molto presente in Sardegna con dati riportati del 35%, ed anche in Sicilia la sua percentuale affianca in valore quella della β tal. Dall analisi dei dati ottenuti dagli studi dell Hb effettuati nel laboratorio di Diagnosi Prenatale Talassemia Az.Osp V.Cervello, la percentuale risulta circa del 7% e la mutazione più frequente in assoluto è la forma di α + talassemia data dalla delezione α 3.7 (73.2%). Cipro* 8,0 % 10,0 % Grecia* 20% 25% Sud Est Asiatico 35,0 % Portogallo* 26,5% 47% Melanesia Africa Paesi Mediterranei 15,0 % 7,0 % 13,3 % Sardegna Meridionale* Lazio* Sicilia Bianco Silvestroni: Le Talassemie (1998) 5,2% 6,9% 4,0% 3,4% 2,3% 2,3% 1,5% 1,2% 73,2% alpha-3,7 alpha2 HphI alpha-- MED alpha alpha2 NcoI alpha2 S.A alpha-- 20,5 alpha-- CAL alpha-4,2 16
Analisi Molecolare per Alpha Talassemia Il portatore di alpha-tal presenta un fenotipo simile a quello di una carenza marziale per cui, la prima cosa da fare è escludere una anemia da ferro. In seguito si valuta il fenotipo e l eventuale presenza di una picco variante in HPLC; in quest ultimo caso, è necessaria l analisi di sequenza dei geni globinici (se si conosce già orientativamente a quale mutazione potrebbe essere associato il picco ci si indirizza prima sul gene sospetto). Dato che le delezioni sono le mutazioni più frequenti, sono queste le prime ad essere ricercate per mezzo della GAP-PCR. Naturalmente, il fenotipo può far orientare verso la delezione da ricercare; in caso di un fenotipo da α + la prima mutazione da ricercare deve essere la α 3.7 e, a seguire, la α 4.2. La sequenza genica è sempre consigliata, ma in caso non fosse possibile farla, è consigliabile ricercare le mutazioni puntiformi più frequenti come α 2 NcoI ed α 2 HphI. Per un fenotipo da α 0, l analisi va orientata verso sia le delezioni corte, che potrebbero essere in omozigosi, che verso le lunghe come le α 20.5 ed la α --MED ; non vanno escluse le mutazioni puntiformi che potrebbero essere presenti in omozigosi. Attenzione un fenotipo da α 0 potrebbe, tuttavia, nascondere una β talassemia associata ad una δ talassemia, che riduce il valore dell HbA 2. In ogni caso, in presenza di una diagnosi dubbia l analisi familiare potrebbe essere di aiuto. Letture Consigliate: D.R.Higgs et al. A Review of the molecular geneticsof the Human α globin gene cluster. Blood 1989;73: 1081-1104. L.F. Bernini and C.L. Harteveld; Baillière s Clinical Haematology 1998; 53-90. Foglietta et al. Detection of a-globin gene disorderes by a simple PCR methodology. Haematologic996; 81:387- D.H.K. Chui et al. Hemoglobin H : not necessarily a benign disorder. Blood 2003; 101: 791-800. D.P. Steensnma, R.J. Gibbons and D.R. Higgs. Acquired α thalassemia in association with myelodysplastic syndrome and other hematologic malignancies. Blood 2005;105:443-452. 17