ISOLAMENTO DI CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI DALLA PLACENTA E LIQUIDO AMNIOTICO PER LA CURA DELLA FIBROSI CISTICA

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1 ISOLAMENTO DI CELLULE STAMINALI PLURIPOTENTI DALLA PLACENTA E LIQUIDO AMNIOTICO PER LA CURA DELLA FIBROSI CISTICA Dott.ssa Annalucia Carbone Laboratorio di Genetica Molecolare Fondazione IRCCS Policlinico, Mangiagalli, Regina Elena Milano

2 Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator: CFTR 190 mila basi nel braccio lungo del cromosoma 7 la sua dimensione si riduce a 6.5 kb dopo splicing codifica la proteina CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) folding e trasporto verso la membrana apicale delle cellule epiteliali funzione: trasportatore ioni cloro

3 Mutazioni del gene CFTR Cinque classi distinte: I II III IV V mancata sintesi proteica difetto nel trasporto della proteina difetto nella regolazione della proteina difetto nella conduttanza ridotta sintesi proteica

4 La Fibrosi Cistica La più comune malattia genetica potenzialmente letale della razza Caucasica Modalità di trasmissione: Autosomica Recessiva Incidenza in Italia: 1/3000 nascite Frequenza di portatori: 1/20 Età media alla morte: 35 anni

5

6 Fibrosi Cistica: FENOTIPO muco denso: tosse persistente e ricorrenti infezioni polmonari ostruzione del pancreas: cisti e aspetto fibroso denutrizione e steatorrea (eccesso di grassi nelle feci) ostruzione dotti deferenti nel maschio: sterilità il sale secreto dalle ghiandole sudoripare ( raffreddamento) non viene ripreso dall organismo: deposito di sale sulla pelle e carenza all interno dell organismo

7 Fibrosi Cistica: GENOTIPO La F508del è la mutazione più frequente al mondo (prevalenza del 70% dei cromosomi

8 sono conosciute più di 1500 mutazioni nel gene CFTR, molte delle quali sono causa di FC

9 Screening Neonatale della Fibrosi Cistica

10 Ricerca o conferma di affetti Campioni di sangue Estrazione DNA

11 Ricerca di mutazioni Analisi di I livello: kit commerciale che include l analisi delle mutazioni più frequenti che causano FC, nella regione di riferimento del soggetto. La tecnica utilizzata nel nostro laboratorio è il LIPA.

12 Exon 2-3: Exon 3: Intron 4: Exon 4: Intron 5: Exon 6a: Exon 6b: Exon 7: CFTR del2.3(21kb) G85E;394delTT;E60X 621+1G>T; 623+1A>G R117H 711+1G>T,711+5G>A 852del22bp;E217G 991del5 1078delT; R347P; R347H; R334W;R334Q;T338I Exon 8: 1259insA Exon 9: A455E Exon 10: F508del,I507del,I502T Intron 10: G>A Exon11: G452X,G551D,Q552X;R560T; S549R;R553X Intron 12: G>A;1898+3G>A Exon 12: D579G Exon13: 2183AA>G;2184delA 2143delT Intron 14b: G>A Introne 16: G>A, Introne 17a: A>G Exon 17a: 3199del6 Exon17b: L1065P;R1066H; R1070Q Exon 18: D1152H Intron 19: kbC->T; A->G Exon 19: R1162X;3659delC; R1158X Exon20: W1282X;3905insT; G1244E,S1251N Exon 21: N1303K,4016insT Exon 22: G1349D Exon 24: 4382delA

13 Analisi di II livello: scanning di tutti gli esoni e delle regioni limitrofe, riconoscimento di variazioni di sequenza, sequenziamento della specifica regione del gene. Le tecniche più utilizzate sono: Denaturing HighPerformance Liquid Cromatographye(DHPLC) e sequenziamento.

14 Analisi di III livello: ricerca di delezioni e/o di inserzioni; si tratta di indagini molto specialistiche. Si fa ricorso in questo caso all utilizzo del kit Multiplex Ligation Probe Amplification (MLPA) o alla Quantitative Multiplex Polymerase Chain Reactions of Short Fluorescent Fragments wt Mk

15 Progetto Regione Lombardia 2009: Cellule Staminali Strategie di terapia genica della Fibrosi Cistica: vettori di trasferimento: due grandi categorie virali adenovirus e virus associati non virali lipidi cationici SVANTAGGI: bassa efficienza di trasferimento e breve durata dell espressione

16 Cellule staminali embrionali: cellule pluripotenti capaci di differenziare in epitelio di vari organi, dando origine a diversi tipi cellulari. VANTAGGI: se le cellule staminali, introdotte mediante trapianto, si annidassero nelle nicchie staminali del tessuto respiratorio, allora avremmo anche la possibilità che la riparazione del danno genetico e cellulare sia definitiva

17 Le Cellule Staminali: fonti da adulto: cellule staminali ottenute da midollo osseo SVANTAGGI: bassa efficienza di differenziamento, dovuta probabilmente alla mancanza di sensibilità delle tecniche attualmente in uso embrionali: hanno una elevatissima plasticità o capacità di differenziare in diversi tipi cellulari e in diversi tessuti SVANTAGGI: ma devono superare un vaglio di ordine etico per il loro utilizzo in vivo

18 da sangue di cordone ombelicale: da questa fonte è possibile isolare una popolazione di cellule mesenchimali capaci di differenziare in epitelio respiratorio da liquido amniotico: ancora una fonte di cellule pluripotenti, di cui è nota in letteratura la capacità di generare diversi tipi cellulari Le fonti di cellule staminali post-natali hanno una maggiore plasticità rispetto alle cellule staminali midollari, e questo aspetto è di importanza fondamentale per la cura di tutte quelle malattie genetiche, come la FC, che colpiscono diversi organi

19 Pricipali obiettivi del progetto 1. caratterizzazione fenotipica di cellule staminali pluripotenti ottenute da amnios e liquido amniotico di origine umana; 2. valutazione in vitro delle capacità di differenziamento di cellule staminali in epitelio respiratorio e in colangiociti; 3. valutazione in vivo delle capacità di homing e di differenziamento di cellule staminali umane in epitelio respiratorio e colangiociti nel contesto degli organi murini; 4. valutazione delle capacità terapeutiche della somministrazione di cellule staminali umane in topi FC opportunamente condizionati.

20 Materiali e metodi: 1) Sorgenti e isolamento cellulare: le cellule staminali pluripotenti saranno estratte da placente e da liquido amniotico ottenuti da parti, previo consenso informato; dopo dissociazione enzimatica della membrana amniotica, le cellule verranno centrifugate per 10 minuti a 200xg e poi risospese e piastrate in DMEM addizionato con 10% fetal bovine serum (FBS), 1% amminoacidi, 10% glutammina, 1% penicillina/streptomicina, 0,2% 2mercaptoetanolo ed EGF

21 Placenta al primo split

22 Placenta al secondo split

23 Placenta al terzo split

24 CD49 la caratterizzazione cellulare comprenderà valutazioni: - citometriche, - microscopiche - biomolecolari CD19 espressione di marker di staminalità e di linea specifici quali: CD13, CD29, CD34, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD133, CD271, CXCR4, OCT-4, SSEA4, CK7, CK18, CK19 e CFTR

25

26 RT-PCR QUANTITATIVA 2 RN A RN A M 1 Step: 1) Estrazione dell RNA dalle cellule staminali prelevate ai vari split e messe in Trizol 28S 18S

27 2) Retrotrascrizione dell RNA in cdna Oligo d(t) Random esameri Primer specifico per il gene 3) Amplificazione del cdna tramite PCR Tradizionale reazione multiciclica suddivisa in 3 fasi: Denaturazione,Annealing,Estensione 4) Separazione elettroforetica dei prodotti di PCR (ampliconi) Gli ampliconi sono ottenuti dopo uno specifico numero di cicli di amplificazione Vengono fatti migrare su un gel di agarosio

28 Perché la Real-Time? Misura l amplificazione in tempo reale durante la fase esponenziale della PCR, quando cioè l efficienza di amplificazione è influenzata minimamente dalle variabili di reazione In questo modo si ottengono risultati più accurati rispetto alla PCR tradizionale

29 Materiali e metodi: 1) Sorgenti e isolamento cellulare: le cellule staminali pluripotenti saranno estratte da placente e da liquido amniotico ottenuti da parti, previo consenso informato; dopo dissociazione enzimatica della membrana amniotica, le cellule verranno centrifugate per 10 minuti a 200xg e poi risospese e piastrate in DMEM addizionato con 10% fetal bovine serum (FBS), 1% amminoacidi, 10% glutammina, 1% penicillina/streptomicina, 0,2% 2mercaptoetanolo ed EGF 2) Differenziazione in epitelio respiratorio e colangiociti

30 Risultati attesi Caratterizzazione completa delle cellule staminali estratte da amnios e liquido amniotico. Determinazione delle condizioni ottimali per il differenziamento morfologico e funzionale in epitelio polmonare e in colangiociti in coltura.

31 Un immenso grazie a tutti voi per l attenzione

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