Reazione Antigene-Anticorpo

Transcript

1 Ag-Ab

2 Reazione Antigene-Anticorpo Immunocomplesso: reazione dell antigene con il corrispondente anticorpo con formazione di un complesso tenuto insieme da legame chimico, non covalente che si forma tra i residui amminoacidici dell Ag (antigene) e quelli del sito combinato dell anticorpo. Tipi di legame : o Legame idrogeno : atomo di idrogeno è condiviso da due atomi elettronegativi o Legame elettrostatici : attrazione di carice elettriche di segno opposto o Forze di Van der Waals : movimento degli elettroni di una molecola che la inducono a comportarsi in maniera temporanea come un dipolo, attraendole molecole vicine o Legami idrofobici : determinati quando una molecola idrofobica si trova in acqua. Le molecole idrofobiche si aggregano per evitare il solvente.

3 Reazione Antigene-Anticorpo Affinita : somma algebrica delle forze attrattive e repulsive tra antigene ed anticorpo Avidità : insieme delle forze d interazione tra i singoli siti combinatori dell anticorpo e l antigene

4 Immunoprecipitazione Rappresenta la formazione di un complesso tridimensionale detto lattice che determina un precipitato visibile. Può essere utilizzata sia in modo qualitativo che quantitativo

5 Precipitazione quantitativa Si ottiene facendo reagire quantità costanti di anticorpo con quantità crescenti d antigene. La precipitazione è dovuta alla formazione di un reticolo di molecole antigene-anticorpo.

6 Reazione di precipitazione Le reazioni di precipitazione sono utilizzate per evidenziare la presenza dell antigene oppure dell anticorpo. Vengono utilizzati reazioni in mezzi semisolidi (agar) :

7 Immunodiffusione doppia

8 Immunodiffusione doppia Se gli antigeni sono identici : si forma una linea continua del precipitato Se gli antigeni sono diversi : si hanno due linee di precipitato che si incrociano Se l antigene A possiede degli epitopi in comune con l antigene B : si forma una linea di precipitato non continua

9 Immunodiffusione radiale Viene detto anche metodo di Mancini. Usato per la determinazione quantitativa dei livelli delle immunoglobuline e dei componenti del complemento presenti sia nel siero che in altri liquidi. Il metodo consiste : Stratificare l agar in cui è stato aggiunto un antisiero specifico in piastre di petri Si effettuano dei pozzetti Si aggiunge l antigene L antigene diffondendo dà origine ad un alone di precipitazione Il diametro dell alone è proporzionale alla concentrazione dell antigene

10 Immunoelettroforesi Metodo utilizzato per l analisi delle proteine del siero. Essa si basa su una reazione di precipitazione preceduta da una migrazione elettroforetica del siero. Il metodo si basa : Si stratifica l agar su un vetrino porta oggetto Si crea un pozzetto in cui si pone il siero da esaminare Si applica un campo elettrico Le proteine migreranno secondo la loro carica elettrica e la loro mobilità Separate le proteine si pratica un altro pozzetto parallelo al senso di migrazione e vi si aggiunge l antisiero Si lascia diffondere l antisiero Nella zona di incontro tra antigene ed anticorpo si forma la banda di precipitazione

11 Western Blot ( Immunoblot ) Questo metodo viene utilizzato per identificare e caratterizzare gli Ag sia nella ricerca sia nella clinica. Il metodo consiste nel : Separare gli antigeni attraverso l utilizzo di un gel di poliacrilammide Trasferire il gel su una membrana di nitrocellulosa Aggiungere un anticorpo specifico per l Ag ricercato marcato con un marcatore enzimatico L anticorpo si collocherà solo dove la reazione sarà avvenuta permettendo di analizzare con facilità la quantità e la presenza dell Ag In alternativa può essere utilizzato un anticorpo marcato con un tracciante radioattivo.

12 Western Blot ( Immunoblot )

13 Agglutinazione L interazione tra un anticorpo e un antigene corpuscolato ( presente su batteri, eritrociti, leucociti, ecc) determina la formazione di aggregati visibili, definita agglutinazione. L anticorpi in questo caso prenderanno il nome di agglutinine.

14 Titolo anticorpale del siero

15 Inibizione dell agglutinazione E un saggio altamente sensibile per evidenziare piccole quantità di Ag ( es. droghe) oppure per determinare se un soggetto è stato esposto ad alcuni virus che causano l agglutinazione dei globuli rossi ( es. rosolia, influenza, ecc) In pratica se nel siero del paziente sono presenti Ab contro un virus, essi reagiranno con questo, quindi il virus non sarà più in grado di agglutinare i globuli rossi aggiunti in un secondo momento Le reazioni d agglutinazione sono utilizzate anche per determinare i gruppi sanguigni di un paziente (emoagglutinazione) oppure per ricercare un anticorpo legato ad un antigene ( test di Coombs).

16 Emoagglutinazione Viene utilizzata per determinare il gruppo sanguigno utilizzando anticorpi anti-a, antib, anti-ab

17 Test di Coombs

18 Test di Coombs diretto I globuli rossi del paziente vengono lavati per allontanare le IgG non legate alla membrana I globuli rossi vengono posti direttamente a contatto con il siero di Coombs Si stabilisce cosi se i globuli rossi sono stati ricoperti in vivo da IgG, come accade nelle malattie emolitiche autoimmuni Test positivo : le emazie agglutinano, significa che gli Ab del coniglio si sono legati agli Ab adesi sulla membrana degli eritrociti.

19 Test di Coombs indiretto Gli eritrociti vengono lavati per rimuovere le IgG non legate alle membrane. Si incubano i globuli rossi del paziente o degli eritrociti compatibili con il siero del paziente e successivamente con il siero di Coombs. Il test viene detto indiretto perche il siero del paziente è incubato con eritrociti normali per far aderire gli eventuali anticorpi anti-eritrocitari. Test positivo : i globuli rossi agglutinano, quindi nel siero testato vi è la presenza di Ab.

20 Immunoflorescenza Permette di legare ad alcuni anticorpi delle sostanze fluorescenti, senza alterarne la capacità di legarsi agli antigeni Le sostanze fluorescenti in questione sono : La fluorosceina La rodamina Le sostanze fluorescenti coniugate agli anticorpi possono evidenziare al microscopio a fluorescenza la presenza di : Antigeni di superficie di cellule viventi in sospensione Antigeni presenti nel citoplasma Antigeni presenti nei nuclei Il metodo viene utilizzato per identificare : fenotipi cellulari i componenti del complemento antigeni tissutali antigeni tumorali batterici virali

21 Esistono due metodi : Immunoflorescenza diretta ed indiretta Metodo diretto : l anticorpo specifico coniugato al fluorocromo si fa direttamente aderire agli antigeni cellulari Metodo indiretto : l anticorpo specifico ( anticorpo primario) non coniugato si fa aderire agli antigeni cellulari, in una seconda fase, si aggiunge un anticorpo anti- anticorpo primario, coniugato con il fluorocromo.

22 FACS ( fluorescence- activated cell sorter ) Si basa sul principio della citometria a flusso. Viene utilizzato un raggio laser e un rivelatore di luce per contare le cellule

23 FACS ( fluorescence- activated cell sorter ) La citometria a flusso si basa sul seguente principio: Un campione, contenente le cellule,è incubato con un Ab monoclonale marcato con un fluorocromo Le cellule che hanno legato ai loro antigeni di membrana l Ab fluorescinato vengono eccitati dal raggio laser ed emettono la luce Il rilevatore della luce misura sia la grandezza sia il numero delle cellule che hanno legato l Ab marcato Un computer analizza questi parametri e crea un diagramma in cui sono riportate il numero delle cellule e la loro tipologia

24 RIA ( saggio radioimmunologico) E una tecnica molto sensibile che può rivelare la presenza di un antigene o di un anticorpo a concentrazioni inferiori a 0,001 pg/ml. Il test RIA si basa sulla competizione tra un antigene radio marcato ed uno non marcato per un anticorpo specifico ad alta affinità. L antigene è marcato generalmente con piccole quantità di un isotopo radioattivo ( per es. I 251 ) che emette raggi gamma ( γ )

25 RIA ( saggio radioimmunologico) Se si vuole determinare la concentrazione di un antigene X, presente nel siero, lo si purifica e lo si marca con I 251 Si allestiscono una serie di provette contenenti una quantità costante d antigene X radiomarcato e di anticorpi anti-antigene X Si aggiunge una quantità crescente del siero in esame, in cui è presente l antigene da testare. L anticorpo si può legare sia all antigene marcato sia all antigene non marcato, quindi i due tipi d antigene competono per legare l anticorpo. Si misura con un contatore gamma la quantità d antigene marcato rimasto in soluzione e quindi per differenza si può determinare la concentrazione di antigene non marcato.

26 ELISA ( enzyme-linked immunosorbent assay) E una tecnica simile al RIA ma è più sicuro è meno costoso Viene utilizzata per evidenziare la reazione antigene -anticorpo Si utilizza un marcatore enzimatico contrariamente al RIA in cui si utilizza un marcatore radioattivo Sono impiegati vari enzimi tra cui : la β-galattosidasi La fosfatasi alcalina La perossidasi di rafano Il test si basa sul fatto che un enzima coniugato ad un anticorpo reagisce con un substrato incolore, detto substarto cromatogenico, e dà origine a un prodotto di reazione colorato. L intensità del colore è proporzionale alla quantità d anticorpo marcato che si lega all antigene.

27 ELISA (metodo indiretto) Viene utilizzato per determinare la quantità di anticorpi. Si basa sul seguente procedimento: In un micropozzetto ricoperto d antigene si aggiunge il campione da analizzare ( siero o un altro campione, in cui è presente l anticorpo da testare, detto Ab primario e lo si lascia reagire con l antigene. Si aggiunge un anticorpo secondario anti-ab primario, coniugato ad un enzima. Si lava via l Ab secondario libero e si aggiunge il substrato per l enzima. La quantità di prodotto di reazione colorato, che si forma, viene valutata mediante speciali lettori spettrofotometrici I lettori spettrofotometrici possono misurare l assorbanza di una piastra a 96 pozzetti.

28 ELISA (metodo indiretto) Il test ELISA è utilizzato anche per determinare la presenza di anticorpi sierici diretti contro il virus dell immunodeficienza umana ( HIV), antigene eziologico dell AIDS. In questo caso le proteine ricombinanti dell involucro e del core dell HIV (Ag) vengono adsorbite nei micropozzetti. E possibile evidenziare la presenza di anticorpi sierici diretti contro l HIV, mediante l ELISA indiretto, entro 6 settimane dall infezione

29 ELISA (a sandwich) Viene utilizzato per determinare la quantità dell antigene. ELISA sandwich : il micropozzetto è ricoperto con l anticorpo primario Viene aggiunto il campione contenente l antigene da misurare Dopo un periodo di incubazione si aggiunge un anticorpo specifico per l antigene coniugato con un enzima. Si lava via l Ab secondario libero e si aggiunge il substrato dell enzima. L intensità del colore è proporzionale alla quantità di anticorpo secondario marcato che si lega all antigene, e quindi alla concentrazione dell Ag.

30 ELISA (competitivo) ELISA competitivo : E un test di inibizione la concentrazione dell Ag è inversamente proporzionale al colore sviluppato. Si incuba l anticorpo primario con il campione contenente l Ag da misurare Si aggiunge la miscela Ag-Ab formatasi ai micropozzetti contenenti l Ag. Maggiore è la quantità di Ag, presente nel campione, minore sarà la quantità di anticorpo primario libero. Si aggiunge l anticorpo secondario, specifico per l Ab primario, coniugato con un enzima. Dopo aver lavato via l Ab secondario si aggiunge il relativo substrato e si misura il prodotto di reazione colorato

31 Complemento E formato da un complesso sistema multifattoriale, costituito da oltre 20 proteine sieriche, che ha la funzione di distruggere i batteri tramite la lisi o la fagocitosi. Soggetti affetti da deficit quantitativo o funzionale del complemento pur avendo livelli normali di Ig, sono particolarmente esposti a ripetute infezioni. Le molecole del complemento si trovano nel sangue o nei liquidi biologici, in forma inattiva finche non sono attivati da microrganismi o altri fattori. Il meccanismo di attivazione è un meccanismo a cascata, in cui il primo elemento agisce sul successivo, rendendolo attivo e quindi capace di agire sull elemento successivo. L attività è localizzata nella zona d innesco con una emivita degli elementi di un millesimo di secondo. Le molecole del complemento sono indicate con una numerazione, che va da C1 al C9, oppure con le lettere maiuscole (B,D,P). I frammenti derivati dalla molecola che ha subito l azione enzimatica dell elemento che lo precede nella cascata, sono indicati con le lettere minuscole (es. C5a, C5b). Il meccanismo terminale dell azione del complemento è la formazione di un complesso litico, detto complesso d attacco alla membrana (MAC), costituito dai fattori che vanno dal C5 al C9.

32 Complemento

33 Complemento

34

35 Via classica Il primo fattore attivato è C1. Il fattore C1 è costituito da un complesso tri-molecolare di 750 kda legato in maniera non covalente, C1q, C1r, C1s, in un rapporto molare di 1/2/2 (C1qr 2 s 2 ). C1q è una proteina complessa, ricca in idrossiprolina, idrossilisina e glicina che per le sue caratteristiche elettroforetiche presenta delle analogie con le Ig, mentre per la sua struttura amminoacidica ricorda le proteine del collagene. La molecola C1q è costituita da 6 unità ognuna costituita da tre distinte subunità A,B,C E possibile distinguere una parte centrale compatta, che lega C1r e C1 s, ed una struttura più esterna che termina con una forma a calice. La struttura a calice svolge la funzione di riconoscere e legare particolari siti presenti nelle Ig, i quali si evidenziano durante la formazione dell immunocomplesso. La sub-unità C1q si deve legare ai domini C H 2 di almeno due anticorpi IgG adiacenti. La sub-unità C1q si può legare ad un solo anticorpo IgM perche dotato di molti domini C H 3. Esistono 4 sottoclassi di IgG nell uomo ciascuna delle quali ha una differente affinità per C1q. La più affine è IgG3, seguita dall IgG1 e IgG2 mentre l IgG4 non attiva il complemento.

36 Via classica C1s inattivo ha un peso molecolare intorno a 90 kda ed è costituito da una sola catena polipeptidica L attivazione di C1s comporta la formazione di due catene una più grande (a) ed una più piccola (b), in cui si trova il sito enzimatico necessario per l attivazione dei componenti successivi. L attività enzimatica è di tipo serino-esterasi, ed agisce su due substrati C4 e C2 che vengono scissi rispettivamente in C4a e C4b, e in C2a e C2b dando origine al complesso C4b2a, denominato C3 convertasi che ha la capacità di attivare il fattore C3.

37

38 Via classica meccanismi di controllo Le reazioni che caratterizzano la via classica sono soggette al controllo di diverse proteine solubili quali : C1 inibitore ( C1 INH ) : questo fattore agisce su C1, bloccando l attività enzimatica di C1s ( edema angioneurotico, dipende dall assenza di questo fattore) C4bp ( C4 binding protein) : questo fattore si lega al C4b, bloccando la formazione del complesso C4b2a e permettendo, cosi, il legame del fattore H, capace a sua volta di inattivare, oltre che il C3b, anche il C4b. Fattore I : questo fattore inattiva il C3b, formando il C3b inattivo (ic3b). Questi meccanismi sono necessari per mantenere gli effetti dell innesco della cascata del complemento solamente a livello del sito d attivazione.

39 Via alternativa

40 Via alternativa

41 Via lectinica Viene attivata in assenza di Ab. E un meccanismo di difesa aspecifico Viene indicata come MBL, ossia la via della lectina legante il mannosio La sua attivazione dipende dal riconoscimento non specifico di sostanze estranee (carboidrati). Presenta analogie strutturali alla via classica. La MBL è simile al C1q, infatti dopo che si è legata ad un microrganismo si unisce, per formare un complesso attivo, ad un enzima, detto MASP (MBL-associated serine-protease), che è simile al C1r e al C1s della via classica. Il complesso MBL-MASP cliva il C4 e il C2 e porta alla formazione di una C3 convertasi che ha come conseguenza la formazione della C5 convertasi.

42 Formazione del complesso d attacco alla membrana ( MAC ) La C5 convertasi provoca la scissione del C5 in C5a e C5b. La C5a liberato contribuisce con le sue capacità anafilattiche e chemiotattiche alla risposta infiammatoria locale La C5b si lega al C6 e al C7 per formare il complesso C5b-7, che presentano la capacità di legarsi alle membrane biologiche. Il complesso C5b-7 lega una molecola del fattore C8 e circa 10 molecole di C9, formando il complesso d attacco alla membrana (MAC), il C5b-9. Il complesso d attacco alla membrana (MAC) ha attività litica sulle membrane, causando la formazione di pori di circa 10 nm di diametro Attraverso i pori avviene il passaggio d acqua e di Sali che portano alla lisi osmotica della cellula o del microrganismo. La proteina S si lega al complesso C5b-9, la quale blocca l attività di lisi e quindi regola l attività biologica del MAC.

43 Fattori regolatori Esistono molecole di membrana ad attività regolatoria tra cui: fattore accellerante il decadimento ( DAF) e la proteina cofattore di membrana (MCP), che agiscono sulla C3 convertasi della via classia e della via alternativa. fattore di restrizione omologa (HRF) e l inibitore di membrana della reazione di lisi (MIRL/CD59), che lega il complesso C5b-8 e blocca il legame del C9 alle cellule autologhe.

44 Anticorpi Monoclonali

45 Struttura e funzione degli anticorpi Quando un antigene entra nell'organismo, esso stimola una risposta immunitaria. Il principale elemento di questa risposta comprende l'attivazione di linfociti B selezionati per produrre anticorpi capaci di legare l'antigene (immunità umorale). Il legame con l'anticorpo può ridurre/inattivare l'attività biologica dell'antigene (specialmente se si tratta di una tossina), ed inoltre "marca" l'antigene per la distruzione da parte di altri elementi del sistema immunitario. Un dato anticorpo si legherà solo ad una specifica regione dell'antigene, detta epitopo. La maggior parte degli antigeni che si trovano in natura (proteine, virus, batteri) contengono centinaia, se non migliaia di differenti epitopi. Un tipico epitopo sulla superficie di una proteina comprende da cinque a sette residui amminoacidici.

46 Struttura e funzione degli anticorpi Una molecola di anticorpo (immunoglobulina) è costituita da due catene proteiche "leggere" (L) identiche e da due, anch'esse identiche, catene proteiche "pesanti" (H), tenute insieme tutte sia da legami a idrogeno sia da ponti bisolfuro esattamente localizzati. Le regioni N-terminali delle catene L e H formano in ciascun anticorpo il sito di riconoscimento dell'antigene. I siti che riconoscono e fissano gli antigeni sono costituiti da tre regioni determinanti la complementarietà (CDR) collocate nell'ambito delle regioni variabili (VH e VL) alle estremità N delle due catene H e delle due catene L. Le CDR costituiscono la parte della molecola anticorpale che presenta la massima variabilità della sequenza amminoacidica. Oltre alle regioni variabili (VH e VL), ogni catena L contiene una regione, o dominio, costante (CL), e ogni catena H ha tre regioni, o domini, costanti (CH1, CH2, CH3). Digerendo gli anticorpi con l'enzima papaina, si liberano tre frammenti: due identici (Fab)-ognuno dei quali contiene una catena L intatta congiunta da ponte bisolfuro alle regioni CL e CH1 della catena H- e uno diverso (Fc), il quale consta di due frammenti di catena H, ognuno contenente i domini CH2 e CH3, congiunti da un legame bisolfuro. Il frammento Fab conserva l'attività legante l'antigene.

47 Struttura e funzione degli anticorpi Una volta avvenuto il legame antigene-anticorpo, in una molecola anticorpale intatta la porzione Fc suscita parecchie risposte immunitarie: Si attiva la cascata del complemento. I componenti di questo sistema disgregano le membrane cellulari, attivano i fagociti e generano segnali per mobilizzare altri componenti del sistema di risposta immunitaria. Prende corpo la citotossicità cellulo-mediata anticorpo-dipendente (ADCC) provocata dal legame tra la porzione Fc dell'anticorpo e il recettore Fc di una cellula ADCC effettrice. In seguito al legame tra la regione Fab e un antigene solubile la porzione Fc di un anticorpo si può fissare sui recettori Fc delle cellule fagocitiche, che inglobano e distruggono il complesso anticorpo-antigene.

48 Struttura e funzione degli anticorpi

49 Principi alla base della produzione di Anticorpi monoclonali Ogni specifico anticorpo, che riconosce uno specifico epitopo, è prodotto da uno specifico linfocita B. L'isolamento e la coltura in vitro di una cellula capace di produrre un singolo anticorpo rappresenta una fonte di anticorpi monoclonali (monospecifici). Tuttavia i linfociti B, quando sono coltivati in vitro, muoiono dopo brevissimo tempo, e quindi non possono essere una fonte per la produzione a lungo termine di anticorpi. La tecnologia dell'anticorpo monoclonale comprende l'isolamento di questi linfociti B, e la loro successiva fusione con cellule trasformate (cellule mielomatose). Molte delle risultanti cellule ibride manterranno l'immortalità, oltre a produrre grandi quantità dell'anticorpo monospecifico.

50 Principi alla base della produzione di Anticorpi monoclonali La tecnica degli ibridomi può servire quindi a mantenere una scorta continua di anticorpo monospecifico puro, e l'obiettivo attuale consiste nel progettare e produrre anticorpi monoclinali umani dotati tanto di specifiche proprietà immunoterapiche quanto di bassa immunogenicità potenziale.

51 PREPARATI DI ANTICORPI POLICLONALI I preparati di anticorpi policlonali sono stati usati per decine di anni per indurre immunizzazione passiva contro malattie infettive e altri agenti dannosi, in particolare tossine (es.antisiero equino contro l'infezione da Corynebacterium diphteriae). I preparati di anticorpi sono generalmente somministrati per iniezione endovenosa. Mentre questo fornisce un'immediata protezione immunitaria, l'effetto è transitorio, e di solito persiste per sole due o tre settimane (per esempio finché gli anticorpi non sono escreti). L'immunizzazione passiva può essere usata come profilassi (es. somministrazione di anticorpi diretti contro tossine di serpenti a persone che debbano viaggiare in luoghi dove tali serpenti si trovino comunemente) o come terapia (es. somministrazione di anticorpi antiveleno immediatamente dopo il morso di un serpente).

52 Preparazione di un antisiero I preparati di anticorpi usati per indurre immunità passiva possono essere ottenuti da fonti animali o umane. I preparati di origine animale sono in genere chiamati "antisieri", mentre quelli di origine umana sono detti "immunoglobuline". In entrambi i casi gli anticorpi predominanti sono le IgG. Gli antisieri sono generalmente prodotti per mezzo dell'immunizzazione di animali sani con appropriati antigeni. Piccoli campioni di sangue sono successivamente prelevati dall'animale e su questi si fa un'analisi quantitativa della presenza degli anticorpi desiderati (enzyme-linked immunosorbent assay - ELISA). Il sangue viene raccolto usando una tecnica aseptica all'interno di contenitori sterili (in presenza di eparina o altro anticoagulante). La frazione anticorpale viene quindi purificata dal siero per mezzo di successive precipitazioni (etanolo e ammonio solfato) o di cromatografia ad alta risoluzione. Dopo questa purificazione si determina il titolo degli anticorpi, solitamente per mezzo di saggi biologici o immunologici. Spesso si aggiungono stabilizzanti come NaCl (0.9% w/v) o glicina (2-3% w/v).

53 Preparazione di un antisiero Preparati di anticorpi policlonali di origine umana o animale usati per indurre immunità passiva contro specifici agenti biologici

54 Preparazione di un antisiero Gli antisieri si sono dimostrati preziosi nel trattamento di molte patologie, ma possono anche indurre particolari effetti indesiderati, tra cui è particolarmente degna di nota la loro capacità di indurre reazioni di ipersensibilità, le quali possono arrivare fino allo shock anafilattico con la morte del paziente. I preparati di anticorpi policlonali in uso terapeutico possono essere raggruppati secondo il loro target in: Anticorpi diretti contro specifici patogeni microbici o virali Anticorpi diretti contro tossine microbiche Anticorpi diretti contro il veleno di ragni e serpenti (antiveleno)

55 ANTICORPI MONOCLONALI La tecnologia degli anticorpi monoclonali si è sviluppata negli anni '70, quando Kohler e Milstein riuscirono a fondere cellule mielomatose immortali con linfociti B produttrici di anticorpi. Una parte degli ibridi ottenuti risultava essere stabile, con caratteristiche cancerose e capace di produrre anticorpi. Queste cellule, dette ibridomi, rappresentavano dunque una inesauribile fonte di anticorpi monospecifici (monoclonali).

56 Formazione e selezione delle cellule ibride Il primo passo della produzione di una linea cellulare ibrida che produca un unico anticorpo è l'inoculazione, nel topo o nel ratto, dell'antigene contro il quale si desidera venga prodotto l'anticorpo. Dopo parecchie inoculazioni e in capo ad un periodo di alcune settimane, si saggiano gli animali per stabilire se hanno o meno sviluppato la risposta immunitaria. In caso affermativo essi vengono uccisi e se ne asporta la milza (che ospita i linfociti, le cellule che producono gli anticorpi), la si lava e trita, e si agita poi dolcemente per liberare le singole cellule, alcune delle quali saranno cellule B produttrici di anticorpi. Si mescola la sospensione di cellule spleniche con una sospensione di cellule di cellule mielomatose geneticamente prive dell'enzima ipoxantina-guaninafosforibosil-transferasi (HGPRT -). La miscela delle sospensioni cellulari viene mescolata con glicole polietilenico al 35% per alcuni minuti e successivamente trasferita a un mezzo di coltura contenente ipoxantina, amminopterina e timidina (mezzo HAT).

57 Formazione e selezione delle cellule ibride Il trattamento con polietilenglicole facilita la fusione tra le cellule, ma anche così gli eventi di fusione sono rari e casuali. Nella miscela esisteranno alla fine: cellule mielomatose cellule spleniche cellule di fusione mieloma-milza cellule di fusione mieloma-mieloma cellule di fusione milza-milza. Il mezzo HAT, invece, permette la crescita delle sole cellule di fusione mieloma-milza, perché nessun'altra è in grado di proliferarvi. Le cellule spleniche e quelle di fusione milza-milza non sono in grado di crescere in alcun mezzo. Le cellule mielomatose e quelle di fusione mieloma-mieloma, del tipo HGPRT - non sono in grado di utilizzare l'ipoxantina come precursore per la biosintesi delle purine guanina e adenina, che sono, naturalmente, essenziali alla sintesi degli acidi nucleici. Esse dispongono però di un percorso alternativo, naturale, per sintetizzare le purine, che si serve dell'enzima diidrofolato-riduttasi. E' per questo che si comprende nel mezzo l'amminopterina, che inibisce appunto l'attività della diidrofolato-riduttasi. In definitiva le cellule HGPRT - mielomatose e di fusione mieloma-mieloma non sono capaci di sintetizzare nel mezzo HAT le purine e, di conseguenza, periscono.

58 Formazione e selezione delle cellule ibride Quanto alle cellule di fusione milza-mieloma, esse sopravvivono nel mezzo HAT perché le cellule di milza contribuiscono con l'hgprt funzionale, che può utilizzare l'ipoxantina esogena del mezzo anche quando la produzione di purine affidata alla diidrofolato-riduttasi sia bloccata dall'amminopterina, e perché, inoltre, sono attive le funzioni della divisione cellulare delle cellule mielomatose. Si fornisce la timidina per superare il blocco della produzione di pirimidine causato dall'inibizione della diidrofolato-riduttasi ad opera dell'amminopterina. Da 10 a 14 giorni circa dopo il trattamento di fusione nel mezzo HAT saranno sopravvissute solamente, crescendovi, le cellule di fusione milza-mieloma. Tali cellule vengono allora distribuite nei pozzetti delle piastre da microdosaggio e fatte crescere in mezzo di coltura completo senza HAT.

59 Identificazione di specifiche linee cellulari ibride produttrici di anticorpi Il compito successivo consiste nell'identificare le cellule ibride che producono anticorpi contro l'antigene immunizzante. Uno dei procedimenti comuni di selezione utilizza il mezzo di coltura, che contiene gli anticorpi secreti. Lo si raccoglie dai pozzetti che contengono cellule in crescita e lo si aggiunge nel pozzetto di un'altra piastra da microdosaggio preliminarmente rivestita con l'antigene bersaglio. Se il mezzo di coltura contiene un anticorpo (anticorpo primario) che riconosce un epitopo dell'antigene vi si legherà, e i successivi lavaggi non lo allontaneranno. Ai pozzetti della piastra si aggiunge un secondo anticorpo (anticorpo secondario) specifico degli anticorpi murini (di topo): si legherà a qualsiasi anticorpo primario fissato sull'antigene. Prima di adoperarlo nell'immunodosaggio si coniuga il secondo anticorpo con un enzima che trasforma un substrato incolore in un composto colorato. La presenza di colorazione in uno dei pozzetti dimostrerà che il mezzo di coltura conteneva un anticorpo specifico per l'antigene.

60 Identificazione di specifiche linee cellulari ibride produttrici di anticorpi I pozzetti della piastra da microdosaggio originale il cui mezzo fornisce all'immunodosaggio risposta positiva (colorazione) possono contenere una miscela di cellule di fusione. Tali cellule perciò vengono diluite con mezzo di coltura e inoculate in pozzetti vergini, onde impiantare linee cellulari da cellule individuali (cloni). Dopo avere coltivato i cloni se ne saggia il mezzo nuovamente per stabilire quali linee cellulari (ibridomi) producano molecole di anticorpi monoclonali atte a riconoscere l'antigene bersaglio. Se si isola più di un ibridoma specifico si effettuano ulteriori saggi per stabilire se i diversi cloni producano anticorpi contro il medesimo determinante antigenico. Ciascun clone produttore di anticorpi monoclonali può essere mantenuto in coltura più o meno indefinitamente, inoltre si possono congelare i campioni in azoto liquido per potere disporre in seguito di una fonte di cellule.

61 Produzione di un anticorpo monoclonale (Mab)

62 Identificazione di specifiche linee cellulari ibride produttrici di anticorpi La produzione degli anticorpi monoclonali può essere anche condotta mediante iniezione degli ibridomi nella cavità peritoneale di ratti, che servono dunque da camera di fermentazione vivente. Crescendo, le cellule di ibridoma trapiantate producono anticorpi. Molti dei primi preparati di anticorpi monoclonali venivano prodotti in questo modo, tra questi OKT-3, il primo anticorpo monoclonale approvato per l'uso terapeutico dalla Food and Drug Administration. Questo metodo presenta però degli svantaggi quali l'alto costo e il fatto che il prodotto sia contaminato da significativi livelli di varie proteine murine. La rimozione delle cellule dal mezzo contenente gli anticorpi è portata a termine mediante centrifugazione o filtrazione, e normalmente si fa anche una ultrafiltrazione per concentrare il filtrato, che viene poi sottoposto a diverse purificazioni di tipo cromatografico A seconda dell'utilizzo previsto, l'anticorpo può poi essere coniugato a specifiche molecole "segnale" (es. radionuclidi o tossine). Alla fine vengono aggiunti al prodotto degli agenti stabilizzanti come tamponi, glicina o anche albumina. Il prodotto viene poi liofilizzato e venduto confezionato in atmosfera di gas inerte.

63 Produzione di anticorpi monoclonali mediante coltura di cellule animali

64 Applicazioni terapeutiche degli anticorpi monoclonali L'incomparabile specificità degli anticorpi monoclonali, unita alla loro relativamente facile produzione e alla possibilità di averne scorte pressoché inesauribili, li rende interessanti strumenti in campo biochimico. In campo terapeutico essi rappresentano di gran lunga la più grande categoria di sostanze biofarmaceutiche attualmente in studio, e centinaia di queste preparazioni si trovano correntemente sotto sperimentazione pre-clinica e clinica. Negli anni '80 si è focalizzata l'attenzione sul loro uso sia come agenti traccianti (diagnostica per immagini) o come diretti agenti terapeutici. I primi studi sono stati concentrati sul cancro, ma i preparati di anticorpi monoclonali vengono oggi usati in una gran varietà di campi della medicina.

65 Applicazioni cliniche degli anticorpi monoclonali in commercio Immunizzazione passiva Diagnostica per immagini (es. cancro, malattie infettive, patologie cardiovascolari) Terapia del cancro e delle patologie cardiovascolari Prevenzione della reazione immunitaria di rigetto nei trapianti di organi Diagnosi di gravidanza e di malattie a trasmissione sessuale Purificazione di prodotti industriali Rilevazione di molecole in tracce nei prodotti alimentari, agricoli e industriali