ESPRESSIONE DI ABCB1 IN LINFOCITI T DEL SANGUE PERIFERICO

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1 Cattani Elia Lavoro di diploma Formazione Tecnico in Analisi Biomediche SSS Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno 2006 ESPRESSIONE DI ABCB1 IN LINFOCITI T DEL SANGUE PERIFERICO Lavoro svolto presso: Istituto di Ricerca in Biomedicina, Bellinzona Con la collaborazione di: David Jarrossay, PhD Federica Sallusto, PhD

2 Indice Riassunto, Abstract 3 Introduzione 4 Materiali e metodi 6 Risultati 12 Conclusioni 27 Bibliografia 28 Ringraziamenti 30 Allegato 31 Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 2

3 Riassunto I trasportatori ABC (ATP-Binding Cassette Transporters) sono dei trasportatori di membrana presenti in molti organismi dai batteri all uomo e sono caratterizzati da una sequenza peptidica conservata responsabile del legame e dell idrolisi di ATP (1). Il prototipo dei trasportatori ABC è ABCB1 (chiamato anche MDR o PGP) che conferisce resistenza ai farmaci in tumori multiresistenti. Recentemente è stato dimostrato che ABCB1 è espresso selettivamente su cellule B naive e permette di discriminare queste ultime dalle cellule B memoria e transizionali (2). In questo lavoro si dimostra che il trasportatore ABCB1 é espresso su tutti i subsets di cellule T CD4 +, che la sua espressione diminuisce in risposta ad uno stimolo specifico di attivazione ed aumenta se le cellule vengono tenute in coltura in assenza di stimoli ottimali (3). Inoltre lo studio dimostra che ABCB1 é un marcatore di cellule T H 1, attraverso l analisi della produzione di citochine e con analisi dell espressione di recettori per chemochine. Bloccando ABCB1 si inibisce il rilascio di citochine da parte delle cellule della memoria CD4 +. Ciò suggerisce che il recettore ABCB1 é implicato, direttamente o indirettamente nel processo, o più in generale nell attivazione delle cellule T. Abstract ATP-binding cassette (ABC) transporters are ubiquitously present in most organisms from bacteria to man. They are characterized by a domain responsible for the hydrolysis of ATP. The prototype of ABCBtransporters is ABCB1 (also called MDR or PGP) which confers multidrug-resistance in tumors. Recently, it has been demonstrated that ABCB1 is selectively expressed on naïve B cells, and discriminates naïve B cells from transitional and memory B cells. In this work we show that ABCB1 is expressed on every subset of T CD4+ cells and this expression on naïve CD4+ cells is downregulated by an optimal activation and is upregulated in absence of optimal stimulus. By analyzing the expression of chemokine receptors and the release of cytokines we also demonstrate that ABCB1 is a T H 1 marker. Blocking ABCB1 down-regulated the cytokine release by Memory T CD4 + cells suggesting that this receptor may be implicated directly or indirectly in the cytokine production or more generally in the activation of CD4 T cells. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 3

4 Introduzione I linfociti T e B del sangue comprendono cellule naive (ovvero indifferenziate che non hanno ancora incontrato l antigene) e cellule della memoria (differenziate, in seguito ad una precedente stimolazione antigenica, a cellule in grado di diventare immediatamente effettrici in caso di una seconda stimolazione antigenica). La distinzione tra cellule naive e memoria e la definizione di sottopopolazione di cellule memoria con diverse funzioni è importante nel monitoraggio immunologico dopo vaccinazioni o in patologia. Recenti risultati ottenuti all Istituto di Ricerca in Biomedicina hanno dimostrato che un trasportatore cellulare appartenente alla famiglia ABC (ATP-Binding Cassette Transporters), il cui prototipo è rappresentato dalla molecola ABCB1 o MDR-1 che conferisce resistenza ai farmaci in cellule tumorali, è espresso selettivamente su cellule B naive e permette di discriminare queste ultime dalle cellule B memoria e transizionali (2). L obiettivo del lavoro di diploma qui proposto e quello di analizzare l espressione di ABCB1 su linfociti T CD4 + naive e memoria del sangue periferico (vedi allegato). Per poter identificare le cellule che esprimono il trasportatore ABCB1 si sono usati dei coloranti, MTG o MTO, che entrano liberamente in tutte le cellule e che vengono attivamente espulsi in cellule ABCB1 positive. L attività dei trasportatori può essere bloccata usando degli inibitori come ad esempio il verapamil (aspecifico), l MK571 (specifico per ABCC1) o il PGP-4008 (specifico per ABCB1). Le cellule T CD4 + sono anche dette T Helper (T H ) perché hanno la funzione di aiutare le altre cellule del sistema immunitario grazie alla produzione di citochine o all interazione diretta tra le cellule mediante i loro recettori di superficie. Durante la risposta immunologica le cellule T CD4 + possono ricevere tre tipi di segnale da parte delle cellule dendritiche o altre cellule APC (cellule presentanti l antigene ): 1. L antigene processato viene presentato da una cellula APC su molecole MHC di classe II, per essere riconosciuto da una cellula T CD4 + per mezzo di un recettore per l antigene formato dal TCR (Recettore della cellula T) e dal complesso CD3. In vitro la stimolazione con l antigene delle cellule CD4 + può essere riprodotta incubando le cellule T CD4 + con anticorpi specifici diretti contro la molecola CD3. 2. Costimolazione: il segnale di attivazione per le cellule T CD4 + risulta più forte se oltre al TCR vengono attivati altri recettori, il più importante dei quali é il CD28. Il CD28 viene attivato in vivo dal CD80 e CD86 delle cellule APC. In vitro la situazione si può Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 4

5 riprodurre con anticorpi specifici anti-cd28 in grado di attivare, legandolo, il recettore. 3. Segnale polarizzante: la differenziazione della cellula T CD4 + può essere influenzata dalla cellula APC con la produzione di citochine. Le cellule T H possono essere distinte in 2 principali tipi a seconda delle funzioni che svolgono nella risposta immunitaria, T H 1 e T H 2, le cellule T H 1 sono importanti nelle risposte immunitarie contro microbi intracellulari ed hanno la funzione di aiutare altre cellule T e macrofagi; le cellule T H 2 sono coinvolte nelle risposte contro parassiti e microbi extracellulari ed aiutano le cellule B a produrre anticorpi (T-B-Help). Le cellule T naive si differenziano in T H 1 in presenza di IL-12 ed in T H 2 in presenza di IL-4. Questa caratteristica viene riprodotta in vitro, aggiungendo IL-12 e anticorpi anti-il-4 per stimolare al differenziazione in T H 1, e con aggiunta di IL-4 e anti-il-12 per stimolare la differenziazione in T H 2. Le cellule T H 1 e T H 2 possono essere distinte tra loro grazie all espressione di recettori per chemochine quali CCR5 e CXCR3 (espressi su T H 1) o CCR3, CCR4 e CRTH2 (espresso su T H 2) oppure grazie alla produzione di citochine da parte delle cellule, Le cellule T H 1 producono soprattutto IFN-γ mentre le cellule T H 2 producono soprattutto IL-4 (4-7). In questo lavoro si cerca una relazione tra l espressione di ABCB1 e le cellule T H 1 e T H 2 e si valuta l espressione del trasportatore in diverse condizioni. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 5

6 Materiali e metodi Isolamento delle cellule mononucleate (PBMC) a partire da Buffy Coat I Buffy Coat, un concentrato di leucociti che si ottiene centrifugando il sangue intero anticoagulato, sono forniti dai centri trasfusionali della Croce Rossa di Lugano o di Basilea, hanno un volume compreso tra 60 e 80 ml. Il buffy coat viene diluito fino a raggiungere un volume di 180 ml con RPMI Complete Medium (RPMI 1640 Medium con 25 mm Hepes, GIBCO Invitrogen, Paislex, Scozia, cat ). In sei tubi vengono pipettati 13 ml di Lymphocyte Separation Medium (LSM, 9,4 g di Diatrizoato di sodio e 6,2 g di Ficoll per 100ml, MP Biomedicals LLC, Thuringer Strasse 15, Eschwege, Germania, cat 50494) ai quali vengono aggiunti 30 ml della soluzione ottenuta diluendo il Buffy Coat, pipettando delicatamente evitando che il Buffy Coat diluito si mescoli con il LSM (8-10). I 6 tubi vengono centrifugati per 30 min a 2000 rpm a 18 C (con bassa accelerazione e decelerazione). Le fasi contenenti le cellule mononucleate vengono aspirate e unite in un nuovo tubo, le cellule vengono lavate due volte con Washing Medium (RPMI complete con 1% di FCS [Fetal Calf Serum, GIBCO Invitrogen, cat ]). Isolamento di linfociti T CD4 I linfociti T CD4 + vengono isolati a partire da PBMC con il metodo MACS (MAgnetic Cell Sorting) CD4 MicroBeads (CD4 MicroBeads Human, Miltenyi Biotech Gmbh, Bergisch Gladbach, Germania, cat ). Le cellule vengono incubate con un anticorpo specifico anti-cd4 ad una concentrazione di 2.5 µg/ml marcato con particelle magnetiche per 20 min a 4 C, dopo un lavaggio le cellule vengono passate in una colonna posta all interno di un magnete. Le cellule legate dall anticorpo marcato magneticamente rimangono nella colonna e vengono eluite in seguito. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 6

7 Colorazione con Mitotrackers per espressione di trasportatori ABC Le cellule CD4 + vengono colorate con un anticorpo specifico anti- CD45RA-PE (Monoclonal Antibody CD45RA-PE, Immunotech, cat. 1834) ad una concentrazione di 2.5 µg/ml incubate 20 min a 4 C e poi lavate 2 volte con Washing Medium. Le cellule vengono incubate a 37 C in RPMI 10% FCS per 20 minuti con aggiunta di MTG ad una concentrazione di 100 nm (Mito Tracker Green FM, Molecular Probes, cat. M7514), in 3 condizioni diverse: senza inibitori e con 2 inibitori specifici. Come inibitori specifici si sono usati MK571 (Alexis Biochemicals, Lausen CH, cat M005) ad una concentrazione di 25 nm per inibire specificamente ABCC1 e PGP-4008 (Alexis, cat: M002) ad una concentrazione di 10 nm per inibire specificamente ABCB1. Dopo incubazione le cellule vengono lavate con Washing Medium e quindi risospese in PBS (PBS privo di CaCl 2 e MgCl 2, GIBCO Invitrogen, cat ) con 1% FCS e analizzate al citofluorimetro. Stimolazione di cellule Naive CD4 + e analisi dell espressione di ABCB1 Le cellule naive CD4 + sono ottenute a partire da Buffy coat con gradiente di Ficoll e CD4 MACS, colorate con anti-cd45ra-apc (APCanti-human CD45RA, BD Pharmingen, cat ) in PBS 1%FCS ad una concentrazione di 2.5 µg/ml, e sortate con FACSAria. Le cellule sono poi risospese ad una concentrazione di 10 6 cellule/ml. Le cellule vengono attivate in piastra con pozzetti ricoperti di anticorpi specifici, preparati in precedenza mettendo 50 µl di soluzione di anticorpi in PBS ( PBS con Cacl2 e MgCl2, GIBCO Invitrogen, cat ). Le cellule sono attivate in 2 modi diversi, con anti-cd3 (clone TR66) o con anti CD3 e Anti CD28 (BD Pharmingen, cat ), per diversi tempi. In ogni pozzetto vengono aggiunti 200 µl di sospensione cellulare, la piastra viene messa a 37 C e in tempi diversi viene effettuata la colorazione con MTG, con l aggiunta di 10 µl di soluzione di biglie (6x10 5 beads/ml, 6000 beads, SPHERO Rainbow Calibration Particles, BD Biosciences Pharmingen, cat ) viene contato il numero di cellule vive, contando 1500 beads. Ogni volta vengono contate le cellule vive e analizzata l espressione di ABCB1. Le cellule sono analizzate al tempo 0, dopo 4, 24, 48, 72 e 144 ore. Le cellule dopo attivazione vengono tenute in coltura a 37 C in RPMI 10% FCS ed analizzate contemporaneamente alle altre in modo da seguire l espressione di ABCB1 una volta cessato lo stimolo. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 7

8 Analisi dell espressione di recettori per chemochine. Le cellule CD4 + vengono risospese ad una concentrazione di 10 6 cellule/ml, Vengono pipettati 100 µl di sospensione in 8 pozzetti in una piastra, 4 per le colorazioni con anticorpi specifici per chemochine e 4 come controlli negativi. Dopo centrifugazione le cellule vengono risospese nella soluzione di PBS 1% FCS con l anticorpo anti-recettore per chemochine ad una concentrazione di 2.5 µg/ml. Le cellule sono colorate rispettivamente con anti-cxcr3-pe (PE-anti-human-CD183 (CXCR3), BD Pharmingen, cat ), anti-ccr5-pe (PE-antihuman-CCR5, R&D System, Minneapolis, cat. FAB155P), anti-crth2 (clone BM16, coniugato con biotina) e anti-ccr7-pe (PE-anti-human- CCR7, R&D System, cat. FAB197P), dopo un incubazione di 20 min a 4 C le cellule vengono lavate, nel pozzetto della colorazione con anti- CRTH2 viene aggiunta streptavidina coniugata con PE (Streptavidin- PE, Molecular Probes, cat ) ad una concentrazione di 2.5 µg/ml, incubate per altre 20 min a 4 C. Alla fine delle colorazioni le cellule vengono lavate 2 volte con PBS 1% FCS e risospese in 50 µl di PBS 1% FCS per essere analizzate al citofluorimetro. Colorazione intracellulare per produzione di citochine ex vivo Le cellule CD4 + sono isolate a partire da Buffy Coat su gradiente di Ficoll e con il metodo CD4 MicroBeads. Le cellule CD4 sono poi colorate con MTG, dopo lavaggio sono colorate con anticorpo anti- CD45RA-PE ad una concentrazione di 2.5 µg/ml, dopo 2 lavaggi con Washing Medium risospese in PBS 1% FCS. Le cellule vengono separate con FACSAria in 4 popolazioni: naive MTG+, naive MTG-, memory MTG+ e memory MTG-. Le quattro popolazioni cellulari vengono risospese ad una concentrazione di 10 6 cellule/ml, in una piastra vengono pipettati 2 volte 200 µl di ogni sospensione, un pozzetto verrà attivato e l altro fungerà da controllo negativo. Le cellule vengono attivate in RPMI 10% FCS con PMA (1-metoxi-2- propilacetato, Invitrogen, cat ) ad una concentrazione di 10-7 M e ionomicina (Invitrogen, cat ) ad una concentrazione di 1 µg/ml per 2 ore, poi viene aggiunta Brefeldina A (BFA, Invitrogen, cat ) ad una concentrazione di 10 µg/ml ed incubate per altre 2 ore. Le cellule vengono poi lavate 2 volte con PBS 1% FCS vengono aggiunti 50 µl di soluzione di fissaggio di formaldeide (fix solution, Becton Dickinson, cat KZ ) e incubate 15 min a 4 C, le cellule vengono poi lavate 2 volte con soluzione permeabilizzante (Perm/Wash, Becton Dickinson, cat KZ), le cellule sono poi colorate con anticorpi specifici anticitochine: anti-il-4 (PE-anti-human Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 8

9 IL-4, BD Pharmingen, cat ) e anti-ifn-γ (APC-anti-human IFNγ, BD Pharmingen, cat ), entrambi ad una concentrazione di 0.2 µg/ml, ed incubati per 30 min a 4 C. Dopo 2 lavaggi con Soluzione permeabilizzante le cellule sono risospese in PBS 1% FCS ed analizzate al citofluorimetro (11-12). Beads Array per produzione di citochine Le quattro popolazioni sortate (naive MTG-, naive MTG+, memory MTG- e memory MTG+) sono attivate in piastra in 4 pozzetti diversi ricoperti di anticorpi specifici, preparata in precedenza mettendo 50 µl di soluzione di anticorpi anti-cd3 (clone TR66) e anti-cd28 (BD Pharmingen, cat ) in PBS ad una concentrazione di 2 µg/ml ( PBS con Cacl2 e MgCl2, GIBCO Invitrogen, cat ) e lasciate a 4 C per una notte. Le cellule vengono incubate in RPMI 10% FCS per 48 ore a 37 C, dopo incubazione il sovranatante viene separato dalle e cellule e vi viene analizzata la concentrazione di IL-4 e IFN-γ µl con il metodo Beads Array (Becton Dickinson) al citofluorimetro. Viene preparata una serie di 8 standard a partire da una soluzione con concentrazione di IL-4 e di IFN-γ di 5000 pg/ml con una diluizione seriale 1:2. A 50 µl di sovranatante o standard vengono aggiunti 50 µl di capture beads solution, ottenuta miscelando 4 µl di Biglie anti-il-4 (BD CBA Human-IL-4 Capture Bead A5, Becton Dickinson, cat ) e 4 µl di Biglie anti-ifnγ (BD CBA Human-IFNγ Capture Bead E7, Becton Dickinson, cat ) e 992 µl di wash Buffer (BD CBA Wash Buffer, Becton Dickinson, cat ). Dopo incubazione di 1 ora a TA vengono aggiunti 50 µl di detection reagent preparato con 992 µl di wash Buffer, 4 µl di anti-il-4-pe (Human IL-4 PE Detection Reagent, Becton Dickinson, cat ) e 4 µl di anti-ifn-γ-pe (Human IFN-γ PE Detection Reagent, Becton Dickinson, cat ) ed incubate per 2 ore a TA e al riparo dalla luce. Le biglie vengono poi lavate con 150 µl di Wash Buffer e risospese in 150 µl di Wash Buffer per essere poi analizzate al citofluorimetro. Colorazione intracellulare per produzione di citochine in vitro Le cellule CD4 + sono colorate con anticorpi specifici anti-cd45ra-fitc (Monoclonal Antibody CD45RA-FITC, Immunotech, cat. 0584) ad una concentrazione di 2.5 µg/ml. Al FACSAria (Becton Dickinson) vengono sortate le cellule naive (CD45RA + ). Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 9

10 Le cellule così separate sono lavate in PBS, colorate con CFSE ad una concentrazione di 0.5 µm in PBS per 8 min a TA, poi lavate 2 volte con RPMI 10 % FCS e risospese ad una concentrazione di 10 6 cellule/ml. Separatamente delle cellule dendritiche provenienti da un altro donatore sono attivate per 3 ore con LPS (lipopolisaccaridi, E. Coli 0111:B4 LPS, Invitrogen, cat. tlrl-pelps) ad una concentrazione di 100 ng/ml in RPMI 10% FCS. Dopo un lavaggio sono risospese anch esse a 10 6 cellule/ml. In una piastra vengono pipettati 200 µl di sospensione cellulari sortate e 40 µl di cellule dendritiche (rapporto 5:1) per l attivazione delle cellule T. Le cellule sono messe in diverse condizioni: Controllo senza aggiunte Condizioni T H 1; con aggiunta di IL-12 (Recombinant Human IL- 12, BD Pharmingen, cat ) ad una concentrazione di 10 ng/ml e anti-il4 (Purified Human anti-il-42, BD Pharmingen, cat ) ad una concentrazione di 2 µg/ml. Condizioni T H 2; con aggiunta di IL-4 (Recombinant Human IL-4, BD Pharmingen, cat ) ad una concentrazione di 10 ng/ml e anti-il12 (Purified Human anti-il-12, BD Pharmingen, cat ) ad una concentrazione di 2 µg/ml. Le cellule sono incubate per 5 giorni. Dopo incubazione le cellule sono sottoposte a colorazione intracellulare per l analisi della produzione di citochine e una colorazione con MTO (Mito cracker Orange, CMTMRos, Molecular Probes, cat. M-7510). Le cellule vengono separate in 4 porzioni, attivate con PMA 10-7 M e ionomicina 1 µg/ml per 1.5 ore, poi viene aggiunta BFA 10 µg/ml ed incubate altre 1.5 ore. Durante gli ultimi 20 min viene aggiunto MTO ad una concentrazione di 50 nm. Alla metà delle cellule viene aggiunto Verapamil (Verapamil hydrochloride, Sigma, cat. V4629) ad una concentrazione di 50 µm per inibire ABCB1 e fungere quindi da controllo positivo (13). Le cellule vengono lavate 2 volte con PBS 1% FCS, vengono fissate per 15 min con fix solution in ghiaccio, le cellule vengono poi lavate 2 volte con soluzione permeabilizzante (Permeabilisation Buffer), poi nei diversi pozzetti vengono colorate con anticorpi specifici anti-citochine: anti-il-4 (APC-anti-human IL-4, BD Pharmingen, cat ) o anti- IFN-γ (APC-anti-human IFN-γ, BD Pharmingen, cat ), entrambi ad una concentrazione di 0.2 µg/ml, ed incubati per 30 min a 4 C. Dopo 2 lavaggi con soluzione permeabilizzante le cellule sono risospese in PBS 1% FCS ed analizzate al citofluorimetro. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 10

11 Analisi della produzione di citochine da parte di cellule della memoria con inibizione di trasportatori ABC Le cellule della memoria CD4 + sono ottenute a partire da Buffy Coat con gradiente di Ficoll e CD4 MACS. Le cellule CD4 + sono poi colorate con anti-cd45ra-apc (APC-anti-human CD45RA, BD Pharmingen, cat ) ed al sorter sono isolate le cellule negative. Le cellule della memoria vengono risospese ad una concentrazione di 10 6 cellule/ml ed in ogni pozzetto vengono pipettati 100 µl di sospensione cellulare. Le cellule sono attivate con PMA 10-7 M e ionomicina 1 µg/ml per 2 ore in diverse condizioni. un controllo negativo (senza PMA e ionomicina) e un controllo positivo. Negli altri pozzetti viene aggiunto un inibitore per trasportatori ABC, rispettivamente: Verapamil (Verapamil hydrochloride, Sigma, cat. V4629) ad una concentrazione di 50 µm, Ciclosporina A (Ciclosporine, Bedford Labs, Bedford OH USA, cat ) ad una concentrazione di 25 µm, e PGP in 3 diverse concentrazioni 5, 10 e 20 nm (Alexis, cat M002). Dopo 2 ore le cellule vengono separate dal sovranatante e nel sovranatante viene misurata la concentrazione di IL-2, IL-4 e IFN-γ con il metodo Beads Array (già descritto sopra). Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 11

12 Risultati e discussione Colorazione con MTG per espressione di ABCB1 Il colorante MTG permea liberamente le cellule attraversandone la membrana ed è espulso da trasportatori ABC, per accertarne la presenza su linfociti T CD4 +, le cellule ottenute da buffy coat con gradiente di Ficoll e purificazione con CD4 Microbeads, sono state risospese in RPMI 10% FCS, un mezzo in cui possono svolgere in vitro le loro normali funzioni, e vi è stato aggiunto il colorante MTG. Dopo un lavaggio per togliere il colorante in eccesso le cellule che non esprimono un trasportatore ABC in grado di espellere il colorante risultano positive all analisi al citofluorimetro, mentre quelle che esprimono un trasportatore ABC risultano negative. Per identificare il subset cellulare che esprime il trasportatore ABC le cellule sono state colorate con CD45RA-PE per identificare le cellule T naive (CD45RA + ) e memory (CD45RA - ). Le cellule sono state colorate in 3 condizioni diverse: solo con MTG, o con l aggiunta di un inibitore specifico per trasportatori ABC, con MK571 per inibire specificamente ABCC1 e con PGP-4008 per inibire specificamente ABCB1. L analisi al citoflurimetro ha permesso di evidenziare due subset in tutte e due le popolazioni, la percentuale di cellule naive che esprimono un trasportatore in grado di espellere il colorante è risultata essere del 17%, mentre la percentuale di cellule della memoria che esprimono un trasportatore ABC è risultata essere del 15%. Con l uso di inibitori, solo PGP-4008 (specifico per ABCB1) é stato in grado di inibire l espulsione del colorante, mentre MK571 (specifico per ABCBC1 non é stato in grado di inibirla. Questo indica che il trasportatore ABC espresso su linfociti T CD4 + é ABCB1 (Figura 1). Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 12

13 A B MTG (FL1) Controllo PGP-4008 MK571 C Percentuale di cellule MTG - (ABCB1 + ) Controllo MK571 PGP-4008 naive memory Figura 1. Espressione funzionale di ABCB1 in cellule CD4. Inibizione con PGP-4008 (verde), con MK571 (blu) e senza inibitori (rosso) su cellule CD4 + della memoria (A) e naive (B) e percentuale di cellule MTG - (ABCB1 + ) con l uso dei diversi inibitori (C). Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 13

14 Stimolazione di cellule Naive CD4 e analisi dell espressione di ABCB1 Le cellule naive CD4 sono isolate grazie alla colorazione con anticorpi specifici anti-cd45ra-apc a partire da Buffy Coat dopo purificazione con CD4 MACS, vengono attivate in coltura in piastra in due modi diversi: con anti-cd3 o con anti-cd3 e anti-cd28, le cellule vengono attivate per tempi diversi (4, 24, 48 e 72 ore) e dopo attivazione tenute in coltura in RPMI 10% FCS e sempre analizzate ai tempi seguenti per seguire l espressione di ABCB1. Il numero di cellule presenti in ogni pozzetto viene misurato con l aggiunta di Beads, il numero delle cellule è riferito a 1500 biglie, in quanto non si vuole seguire il numero effettivo di cellule presenti in ogni pozzetto, ma la variazione del loro numero nel tempo. L espressione di ABCB1 è misurata con colorazione con MTG. Dai risultati si può vedere come il numero di cellule non aumenti dopo attivazione con solo anti-cd3 (Figura 2A), lo stimolo non è sufficientemente forte, ma aumenti in modo significativo con l attivazione con anti-cd3 e anti-cd28 (Figura 2B), dove lo stimolo è sufficientemente forte. L espressione di ABCB1 non varia in modo significativo dopo attivazione con anti-cd3 (Figura 3A). All attivazione con anti-cd3 e anti CD28 (Figura 3B)si può però notare come l espressione di ABCB1 (quindi la percentuale di cellule MTG-) diminuisca dopo un attivazione di almeno 24 ore, si può notare come la percentuale di cellule MTG negative passi da più del 90% fino a circa il 50%. Se le cellule vengono poi tenute in coltura la percentuale di cellule negative ritorna a salire. Quindi l espressione di ABCB1 diminuisce se le cellule ricevono uno stimolo specifico all attivazione e aumenta se le cellule vengono tenute in coltura in assenza di stimoli ottimali. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 14

15 A attivazione con CD no cellule vive h CD3 24h CD3 48h CD3 72h CD3 no stimolo ore B attivazione con CD3 CD no cellule vive h CD3/28 24h CD3/28 48h CD3/28 72h CD3/28 no stimolo ore Figura 2. Sopravvivenza cellulare dopo attivazione. Le cellule naive sono sortate e messe in coltura con anticorpi anti-cd3 (A) o anti-cd3 e anti-cd28 (B), il numero di cellule viene misurato con aggiunta di biglie e quantificate per 1500 biglie. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 15

16 A attivazione con CD % neg cells nessun 4h CD3 24h CD3 48h CD3 72h CD ore B attivazione con CD3 CD % negative cells nessun 4h CD3/28 24h CD3/28 48h CD3/28 72h CD3/ ore Figura 3. Espressione di ABCB1 dopo attivazione. Le cellule naive sono sortate e messe in coltura con anticorpi anti-cd3 (A) o anti-cd3 e anti-cd28 (B), l espressione di ABCB1 è misurata grazie a colorazione con MTG, nel grafico è riportato il numero di cellule MTG negative e che quindi esprimono ABCB1. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 16

17 Analisi dell espressione di recettori per chemochine Per ulteriori analisi dell espressione di ABCB1 su cellule T CD4 + si é cercato di correlare la sua espressione con l espressione di recettori per chemochine. Nell esperimento le cellule CD4 + sono state colorate con MTG e di seguito con anticorpi specifici anti-cd45ra-apc per distinguerle in Naive e Memory e in quattro pozzetti diversi con anticorpi specifici antirecettori per chemochine: anti-ccr7, anti-cxcr3, anti-ccr5 tutti coniugati con PE e con anti-crth2-biotina cui ha seguito una colorazione con streptavidina-pe. Le cellule sono state poi analizzate al citofluorimetro per valutare l espressione dei recettori nelle varie popolazioni (Figura 4). Le cellule naive si possono dividere in due popolazioni con la colorazione con MTG, tutte le cellule esprimono CCR7 e non esprimono altri recettori di quelli analizzati (risultati non mostrati). Le cellule della memoria hanno dato invece i seguenti risultati: le cellule MTG positive (che quindi non esprimono ABCB1) sono risultate essere in maggioranza CCR7 positive (Central Memory) mentre le cellule MTG negative (che quindi esprimono ABCB1) sono risultate essere in maggioranza CCR7 negative (Effector Memory). Quindi il trasportatore ABCB1 è espresso principalmente su Effector Memory e in minor quantità su Central Memory (12). Le cellule MTG negative esprimono in maggioranza CXCR3 (77%) rispetto alle cellule MTG positive (45%). CCR5 é espresso in percentuale maggiore sulle cellule MTG negative. Le uniche cellule che esprimono CRTH2 sono risultate essere MTG positive. CXCR3 e CCR5 sono espressi preferenzialmente su celllule T H 1 (14-17) mentre CRTH2 é espresso selettivamente su T H 2 (18). I risultati di questo esperimento suggeriscono che ABCB1 sia espresso preferibilmente su cellule T H 1. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 17

18 MTG CXCR CCR CRTH CCR Figura 4. Espressione di recettori per chemochine su cellule della memoria CD4 +. Doppia colorazione di cellule T CD4 totali, selezionando le cellule CD45RA -, mostrando la colorazione con MTG contro diversi recettori per chemochine. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 18

19 Colorazione intracellulare per produzione di citochine ex vivo Per confermare il risultato ottenuto con i recettori per chemochine, é stata presa in considerazione la produzione di citochine da parte dei diversi subsets di cellule T CD4 +. Le cellule CD4 + vengono sortate in quattro popolazioni: naive e memory MTG negative e positive, in modo da poterle attivare separatamente con PMA e ionomicina per 2 ore. Vengono poi incubate con BFA per altre due ore in modo da bloccare il rilascio delle citochine. Le cellule vengono poi fissate con una soluzione di formaldeide e colorate con anticorpi specifici anti-il4-pe e anti-ifn-γ-apc in una soluzione di saponina che rende la membrana della cellula permeabile agli anticorpi, che possono penetrare all interno della cellula e colorare le citochine prodotte. Le cellule sono poi analizzate al citofluorimetro (Figura 5A). Le cellule naive non producono, in pratica, IL-4 e IFN-γ nelle condizioni usate nell esperimento. Le cellule della memoria invece producono diverse citochine. Delle cellule della memoria MTG positive (che non esprimono ABCB1) il 18.5% producono di IFN-γ, il 15% producono IL-4 e il 3.9% producono sia IL-4 che IFN-γ. Delle cellule della memoria MTG negative (che esprimono ABCB1) il 56.3% delle cellule producono IFNγ, il 4% sia IFNγ che IL-4 e solo l 1.4% IL-4. Come mostrato nei grafici (figura 5B) le cellule della memoria MTG positive (M+) producono molta IL-4 e poco IFN-γ, mentre le cellule della memoria MTG negative (M-) producono meno IL-4 ma più IFN-γ. Questo risultato conferma quelli ottenuti con l espressione dei recettori per chemochine e suggerisce nuovamente che ABCB1 é espresso di preferenza su cellule T H 1. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 19

20 A Memory MTG + Memory MTG Naive MTG + Naive MTG IFNγ- APC IL-4-PE B IL4 IFNg % M + M - N + N - % M + M - N + N - Figura 5. Produzione di citochine da parte di subset di cellule T CD4 +. (A) Le cellule CD4 naive e memory sono sortate grazie a colorazione con MTG e poi analizzate per espressione di IL-4 e IFN-γ. (B) Percentuale di cellule positive per IL-4 e IFN-γ nelle cellule naive MTG + e MTG - (N+ e N-) e memory MTG + e MTG - (M+ e M-). Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 20

21 Beads Array per produzione di citochine Per confermare ulteriormente la produzione di citochine da parte dei subsets di csllule T CD4+, si é misurato il rilascio di citochine da parte delle cellule precedentemente sortate in naive e memory, MTG negative e positive. Sono state dapprima attivate in piastra con anticorpi anti- CD3 e anti-cd28. La piastra é stata preparata in precedenza mettendo in ogni pozzetto 50 µl di soluzione di anticorpi in PBS con CaCl 2 e MgCl 2 con una concentrazione di ogni anticorpo di 2 µg/ml. La piastra viene tenuta a 4 C per una notte, durante la quale gli anticorpi aderiscono alla parete dei pozzetti. Dopo un lavaggio con RPMI 10% FCS vengono messe le sospensioni cellulari. Le cellule vengono incubate per 48 ore in modo che abbiano il tempo di attivarsi. Dopo 48 ore il sovranatante viene separato dalle cellule per il test Bead Array, detto anche ELISA in citometria. Grazie a delle biglie ricoperte di anticorpi specifici per citochine si può misurare, mediante una serie di standards, la concentrazione di diverse citochine. Le diverse biglie hanno una fluorescenza intrinseca di diversa intensità (FL3) che ne permette la discriminazione, gli anticorpi di cui sono ricoperte legano la citochine ed un secondo anticorpo coniugato con PE lega la citochine con una reazione a sandwich. L intensità della fluorescenza in FL2 è direttamente proporzionale alla concentrazione delle citochine nel sovranatante. La concentrazione di IL-4 nel sovranatante delle cellule naive è risultata non misurabile, per le cellule memory MTG + è risultata essere di 6552 pg/ml, per le cellule memory MTG - è risultata essere 284 pg/ml. La concentrazione di IFN-γ nel sovranatante delle cellule naive MTG + è risultata non misurabile, per le cellule naive MTG - è risultata essere 551 pg/ml, per le cellule memory MTG + è risultata essere di pg/ml, per le cellule memory MTG - è risultata essere pg/ml. (Figura 6). Come si vede dai grafici le cellule MTG + producono più IL-4 e meno IFN-γ rispetto alle cellule della memoria MTG -.Questo risultato conferma i risultati fino a qui ottenuti, rinforzando le evidenze precedenti che ABCB1 sia espresso preferibilmente su cellule T H 1. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 21

22 IL4 IFNg M+ M- N+ N- 0 M+ M- N+ N- Figura 6. Bead Array per produzione di citochine. Le cellule CD4 sono sortate in memory MTG+ e MTG- e naive MTG+ e MTG-, mediante colorazione con MTG e anti-cd45ra-pe. Le cellule sono poi attivate in piastra con anti-cd3 e anti-cd28 per 48 ore. Il grafico riporta la concentrazione (in pg/ml) di IL-4 e IFNγ misurata al citofluorimetro con il metodo Beads Array (BD). Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 22

23 Colorazione intracellulare per produzione di citochine in vitro. Dopo gli esperimenti ex-vivo (attivazione con anticorpi anti-cd3 e anti- CD28 e attivazioni con PMA e ionomicina) si é voluta analizzare la produzione di citochine in una situazione che meglio rispecchia quella fisiologica. Per l esperimento vengono usate cellule naive per vedere se con il priming delle cellule dendritiche prolifereranno cellule ABCB1 + che produrranno grandi quantità di IFN-γ. Dalle cellule CD4 + sono state isolate le cellule naive con colorazione con anticorpi specifici anti-cd45ra-fitc. Le cellule isolate al FACSAria sono colorate con CFSE, un colorante che si fissa a proteine citoplasmatiche e che permette di seguire le divisioni cellulari. Infatti una cellula con una data intensità di colorazione CFSE darà luogo, dopo divisione a due cellule con intensità di colorazione dimezzata e così via. Le cellule naive vengono attivate con cellule dendritiche provenienti da un donatore diverso attivate per 3 ore con lipopolisaccaridi. In ogni pozzetto vengono messe 200'000 CD4 + e 40'000 cellule dendritiche, in tre condizioni diverse: da una parte con aggiunta di IL-4 e anti IL-12 per stimolare la differenziazione di cellule T H 2 e bloccare la differenziazione delle T H 1 e dall altra con aggiunta di IL-12 e anti-il4 per stimolare la differenziazione di cellule T H 1 e bloccare la differenziazione di T H 2 e nella terza condizione senza aggiunta di citochine come controllo. Le cellule vengono tenute in coltura in queste condizioni per 5 giorni e poi vengono attivate con PMA e ionomicina per 1,5 ore, poi vi si aggiunge BFA per altre 1,5 ore e per gli ultimi 20 minuti di stimolazione le cellule sono divise in 2 e viene aggiunto MTO e ad una serie verapamil per inibire ABCB1 e fare quindi da controllo positivo, dopo lavaggio e fissazione le cellule vengono ulteriormente separate in due porzioni e colorate con due anticorpi specifici anti-il4 e anti-ifnγ entrambi coniugati con APC in soluzione di saponina per colorazione intracellulare e infine analizzate al citofluorimetro. Con la colorazione CFSE (FL1) vengono selezionate le cellule che sono state attivate dalle celllule dendritiche e che quindi hanno cominciato a proliferare, di queste si guarda poi MTO (FL2) contro la citochina (FL4). Le cellule Naive hanno prodotto IFN-γ nel 93% delle cellule in condizioni T H 1 e queste sono soprattutto MTG- (86% delle cellule) mentre in condizioni T H 2 le cellule non hanno prodotto IFN-γ, le cellule Naive non hanno in queste condizioni prodotto IL-4 (Figura 7). Quindi l esperimento ci fornisce un ulteriore conferma dell evidenza che ABCB1 sembra essere espresso di preferenza su cellule T H 1. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 23

24 Controllo Condizioni TH1 Condizioni TH IFNγ APC IL-4- APC MTO (FL2) Figura 7. Produzione di citochine dopo stimolazione in vitro su cellule Naive. Le cellule naive sono state sortate a partire da cellule CD4 totali, colorate con CFSE e messe in coltura con cellule dendritiche di un diverso donatore. Nel grafico sono riportate la produzione di IL-4 e IFNg da parte delle cellule che hanno ricevuto il priming da parte delle cellule dendritiche. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 24

25 Analisi della produzione di citochine da parte di cellule della memoria con inibizione di trasportatori ABC Per evidenziare se il trasportatore ABCB1 ha un influsso sul rilascio di citochine da parte delle cellule CD4 +, le cellule CD4 + totali sono colorate con anticorpi specifici anti-cd45ra-apc ed al sorter sono state isolate le cellule negative, le cellule della memoria. Per mettere in evidenza la partecipazione del trasportatore ABCB1 nel rilascio di citochine da parte delle cellule, le stesse vengono attivate con PMA e ionomicina per 2 ore in presenza o assenza di inibitori dei trasportatori ABC (Verapamil, Ciclosporina e PGP 4008). Dopo l attivazione il sovranatante viene separato dalle cellule ed in esso si é misurata la concentrazione di IL-2, IL-4 e IFNγ. Per controllare la sopravvivenza le cellule sono state risospese in PBS 1% FCS e con l aggiunta di biglie si é valutata la concentrazione di cellule presenti (figura 8 A). Il grafico dimostra che glil inibitori non hanno indotto morte cellulare nelle concentrazioni utilizzate. La percentuale di inibizione riportata nei grafici (figura 8 BCD) é stata calcolata in base alla concentrazione misurata nel controllo positivo, sottraendo ad ogni campione la concentrazione di citochina misurata nel controllo negativo e normalizzandola con il numero di cellule vive (calcolate grazie all aggiunta di biglie). La produzione di citochine da parte delle cellule della memoria é risultata essere influenzata dall attività dei trasportatori ABC. Come si vede dai grafici, la produzione di citochine risulta essere inferiore con l uso di inibitori, l inibitore più efficace risulta essere la ciclosporina (oltre a bloccare i trasportatori ABC inibisce anche la trascrizione dei geni codificanti per le citochine (19)), anche Verapamil inibisce la secrezione delle citochine analizzate, anche se in modo minore rispetto alla ciclosporina. L inibitore specifico per ABCB1 (PGP 4008) inibisce anch esso la liberazione di tutte le citochine analizzate, anche se in modo meno efficace, inoltre si può notare un effetto dose-dipendente, in quanto se si diminuisce la concentrazione di inibitore la secrezione di citochine aumenta. Questo indica un coinvolgimento del trasportatore ABCB1 nel rilascio di citochine da parte delle cellule della memoria. E possibile ipotizzare che anche se non implicato direttamente nel rilascio delle citochine analizzate ABCB1 regola l attività di altri trasportatori implicati nel rilascio di citochine. Alcuni trasportatori ABC sono infatti noti per regolare altri trasportatori con diverse funzioni (20). Inoltre non é escluso che i trasportatori ABC siano coinvolti, in maniera più generale, nell attivazione delle cellule T. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 25

26 A Numero di cellule con inibitore PGP in diverse concentrazioni numero di cellule PGP Verapamil (50 µm) CsA (25 µm) Concentrazione (nm) B Percentuale di inibizione del rilascio di IL-2 % di inibizione Concentrazione (nm) PGP Verapamil (50 µm) CsA (25 µm) C Percentuale di inibizione del rilascio di IL-4 % di inibizione Concentrazione (nm) IL-4 Verapamil (50 µm) CsA (25 µm) D Percentuale di inibizione del rilascio di IFNγ % di inibizione Concentrazione (nm) IFNg Verapamil (50 µm) CsA (25 µm) Figura 6. Rilascio di citochine da parte di cellule della memoria con inibitori per trasportatori ABC. Le cellule della memoria sono state attivate con PMA e ionomicina per 2 ore. Le cellule sono state contate grazie all aggiunta di biglie (A). Nel sovranatante sono state misurate IL- 2, IL-4 e IFNγ (B, C e D) con il metodo Beads Array (BD). Il rilascio di citochine risulta inibito con l uso di inibitori per trasportatori ABC aspecifici, Verapamil e CsA, e con PGP 4008 specifico per ABCB1 che mostra un effetto dipendente dalla dose. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 26

27 Conclusioni Il trasportatore ABCB1 è espresso su ogni subset di cellule CD4. Questo si è dimostrato grazie all uso di inibitori specifici di trasportatori ABC. L espressione di ABCB1 può variare a seconda delle condizioni in cui si trovano le cellule, in questo lavoro si è visto che l espressione di ABCB1 su cellule T Naive diminuisce quando le cellule ricevono uno stimolo specifico di attivazione dato da anticorpi anti-cd3 e anti-cd28 e che l espressione del trasportatore ritorna ai valori iniziali se le cellule vengono successivamente tenute in coltura in assenza di stimoli. Quindi l espressione del trasportatore ABCB1 viene indotta se le cellule vengono tenute in coltura o attivate con solo anti-cd3, l espressione di ABCB1 viene invece inibita se le cellule ricevono uno stimolo di attivazione dato da anticorpi anti-cd3 e anti-cd28. Il trasportatore potrebbe essere un marcatore di stress, visto che le cellule in coltura senza stimolo sufficientemente forte di attivazione subiscono una forma di stress. Le cellule che esprimono ABCB1 sono risultate essere arricchite in cellule T H 1 e le cellule che non esprimono ABCB1 sono risultate essere arricchite in cellule T H 2. Questo è stato dimostrato grazie all espressione di recettori che caratterizzano le due sottopopolazioni, in particolare CCR5, che è espresso su cellule T H 1, espresso su cellule ABCB1 positive mentre CRTH2, specifico per T H 2 é espresso solamente su cellule ABCB1 negative. Gli stessi risultati si sono ottenuti con gli esperimenti per la produzione di citochine, sia con colorazione intracellulare che con Beads Array, si è dimostrato come le cellule che esprimono ABCB1 producano grandi quantità di IFNγ e minori quantità di IL-4 rispetto alle cellule che non esprimono ABCB1. Questo concorda nel dire che le cellule che esprimono ABCB1 sono prevalentemente di tipo T H 1 e le cellule che non esprimono ABCB1 sono prevalentemente T H 2. I dati quindi suggeriscono che l espressione del trasportatore ABCB1 sia parte del programma di differenziazione in T H 1. I dati ottenuti dimostrano anche che il trasportatore ABCB1 é coinvolto nel rilascio di citochine da parte delle cellule T della memoria. Non é chiaro però in che modo esso sia coinvolto. Probabilmente ABCB1 é coinvolto indirettamente nel rilascio di queste citochine, regolando l attività del trasportatore direttamente responsabile per il loro rilascio o, in modo più generale, l attivazione delle cellule T. Nel futuro si dovrà determinare più specificamente in quale processo cellulare delle cellule T CD4 + sono implicati i trasportatori ABC. Si può già affermare, in ogni caso, che non hanno funzioni esclusivamente di trasporto di sostanze attraverso la membrana cellulare. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 27

28 Bibliografia 1. Thomas Efferth, The human ATP-Binding Cassette transporter genes: from the bench to the bedside, Current Molecular Medicine 2001, 1, Stefan Wirths and Antonio Lanzavecchia, ABCB1 transporter discriminates human resting naive B cells from cycling transitional and memory B cells, Eur. J. Immunol. 2005, 105, James I. Elliott, Selina Raguz and Christofer F. Higgins, Multidrug transporter activity in lymphocytes, British Journal of Pharmacology 2004, 143, Kenneth M. Murphy and Steven L. Reiner, The lineage decisions of helper T cells, Nature 2002, 1, Kim Bottomly, T cells and dendritic cells get intimate, Science 1999, 283, E. Gemmell, GJ. Seymour, Cytokines and T cell switching, Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 1994, 5, A. langerkamp, M. Messi, A. Lanzavecchia, F. Sallusto, Kinetics of dendritic cell activation impacting on priming of TH1, TH2 and unpolarized cells, Nature Immun. 2000, 1, Böyum A., Separation of white blood cells, Nature 1964, 204, Böyum A., Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood, Scand. J. Clin. Lab. Invest 1968, 21 Suppl. 97, Kay H. D., A new procedure to overlay diluted blood on Ficoll- Hypack gradients, J. Immunol. Meth. 1980, 39, Pala, Tracy Hussel and Peter J. M. Openshaw, Flow cytometric measurement of intracellular cytokines, J. of Immunological Methods 2000, 243, Federica Sallusto, Danielle Lenig, Reinhold Förster, Martin Lipp and Antonio Lanzavecchia, Two subsets of memory T lymphocyte with distinct homing potentials and effector functions, Nature 1999, 401, Raphael J. Röbe and Stephan Grissmer, Block of the lymphocyte channel mkv1.3 by the phenylalkylamine verapamil: kinetic aspects of block and disruption of accumulation of block by a single point mutation, British Journal of Pharmacology 2000, 131, L. Rivino, M. Messi, D. Jarrossay, A. Lanzavecchia, F. Sallusto and J. Geginat, Chemokine receptors expression identifies pre-t helper (Th)1, pre-th2, and nonpolarized cells among human CD4+ central memory cells, J. Exp. Med. 2004, 200, Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 28

29 15. F. Sallusto, D. Lenig, C. R. Mackay, A. Lanzavecchia, Flexible program of chemokine receptor expression on human polarized T helper 1 and 2 lymphocytes, J. Exp. Med. 1998, 187, A. Zingoni, H. Soto, J. A. Hedrick, A. Stoppacciaro, C. T. Storlazzi, F. Sinigaglia, D. D Ambrosio, A. O Garra, D. Robinson, M. Rocchi, The chemokine receptor CCR8 is preferentially expressed in Th2 but not in Th1 cells, J. Immunol. 1998, 161, F. Sallusto, C. R. Mackay, A. Lanzavecchia, Selective expression of the eotaxin receptor CCR3 by human T helper 2 cells, Science 1997, 277, K. Nagata, K. Tanaka, K. Ogawa, K. Kemmotsu, T. Imai, O. Yoshie, H. Abe, K. Tada, M. Nakamura, K. Sugamura and S. Takano, Selective expression of a novel surface molecule by human TH2 cells in vivo, J. Immunol. 1999, 162, S. Ho, N. Clipstone, L. Timmerman, J. Northrop, I. Graef, D. Fiorentino, J. Nourse, G. R. Crabtree, The mechanism of action of cyclosporin A and FK506, Clin. Immunol. Immunopathol. 1996, 80, C. F. Higgins, The ABC of channel regulation, Cell 1995, 82, Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 29

30 Ringraziamenti Vorrei ringraziare coloro che mi hanno aiutato in questo lavoro. In primo luogo ringrazio il direttore dell Istituto di Ricerca in Biomedicina, il professor Antonio Lanzavecchia, per avermi permesso di svolgere il mio stage di formazione e quindi il lavoro di diploma in un laboratorio all avanguardia nella ricerca. Ringrazio Federica Sallusto per avermi seguito nello svolgimento del mio lavoro e David Jarrossay per il continuo contributo. Ringrazio i docenti che mi hanno aiutato dal lato metodologico, Daniela Marcacci il direttore Andrea Boffini. Inoltre Susan Gilbert per la parte in inglese. Ringrazio Elena per l aiuto nella stesura del lavoro e le correzioni delle bozze. Jole e Sara per la lettura delle bozze. Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 30

31 Allegato: I trasportatori ABC La membrana cellulare separa il reparto intracellulare da quello extracellulare, le sue funzioni principali sono definire I confini della cellula e mantenere l omeostasi. Le membrane cellulari hanno tutte la stessa struttura: due strati lipidici che formano un doppio strato con un interno idrofobico e due superfici idrofile. A causa della sua parte interna idrofobica, la membrana cellulare funge da barriera per la maggioranza delle sostanze polari. Per questo le cellule hanno dovuto trovare il modo di trasportare le sostanze organiche idrosolubili attraverso la membrana in modo da importare nutrienti essenziali, esportare prodotti di scarto del metabolismo e regolare la concentrazione intracellulare di ioni. Il trasporto di ioni inorganici e sostanze organiche idrosolubili di piccole dimensioni attraverso il doppio strato lipidico é svolto da proteine di membrana specializzate, ognuna delle quali é responsabile del trasporto di uno ione specifico o di una molecola specifica (o un piccolo gruppo di molecole molto simili tra loro). Ci sono due classi principali di proteine di membrana che sono responsabili del trasporto di sostanze attraverso la membrana: proteine canale, che formano un poro idrofilo e permettono il libero passaggio di sostanze inorganiche e proteine carrier che hanno parti mobili per spostare molecole specifiche da una parte all altra della membrana. Le proteine carrier legano il soluto specifico e compiono una serie di cambiamenti nelle loro conformazione in modo da spostare il soluto attraverso la membrana, il processo di trasporto può essere attivo o passivo, quando il movimento avviene nella direzione del gradiente elettrochimico il processo è passivo e non necessita di energia, quando il processo avviene invece nel senso contrario al gradiente elettrochimico il processo è attivo e necessita quindi di energia. Il trasporto attivo è sempre mediato da carrier e necessita di energia fornita dall idrolisi di ATP (Figura 1). Le proteine carrier possono trasportare le sostanze in diversi modi, quelle che trasportano un singolo soluto da una parte all altra sono chiamate uniporters, altre proteine possono trasportare simultaneamente due soluti, nella stessa direzione (symport) o nelle due diverse direzioni (antiport) (Figura 2) Espressione di ABCB1 in linfociti T del sangue periferico 31