CORSO DI PATOLOGIA MOLECOLARE. Prof. Andrea Cabibbo

Transcript

1 CORSO DI PATOLOGIA MOLECOLARE Prof. Andrea Cabibbo

2 The central role of p53 in cellular and genetic stability p21 Bax p53 pathway: In a normal cell p53 is inactivated by its negative regulator, mdm2. Upon DNA damage or other stress, various pathways will lead to the dissociation of the p53 and mdm2 complex. Once activated, p53 will either induce a cell cycle arrest to allow repair and survival of the cell or apoptosis to discard the damage cell. How p53 makes this choice is currently unknown.

3 Il circuito regolatorio integrato nelle cellule Hanahan & Weinberg, Cell, 2000

4 La struttura di p53 in forma tetramerica legata al DNA

5 The p53 protein domains 1. N-terminal transcription-activation domain (TAD), also known as activation domain 1 (AD1) which activates transcription factors: residues activation domain 2 (AD2) important for apoptotic activity: residues Proline rich domain important for the apoptotic activity of p53: residues central DNA-binding core domain (DBD). Contains one zinc atom and several arginine amino acids: residues nuclear localization signaling domain, residues homo-oligomerisation domain (OD): residues Tetramerization is essential for the activity of p53 in vivo. 7. C-terminal involved in downregulation of DNA binding of the central domain: residues [6]

6 Mutazioni nel DNA Binding domain Wild-Type (+) Mutant (-) Le mutazioni nel DNA-Binding domain sono normali mutazioni recessive loss of function e sono le mutazioni di p53 piu frequenti

7 Mutazioni nel dominio di oligomerizzazione Wild-Type (+) OD Mutant (-) Le mutazioni nel dominio di omooligomerizzazione (OD) hanno invece un effetto dominante negativo, in quanto le subunità mutate dimerizzano con quelle wild-type, inattivandole.

8 The dominantnegative effect of p53 mutations in the oligomerization domain (OD) Wild-Type (+) OD Mutant (-) +/- Che succede negli eterozigoti in cui uno degli alleli è mutato nel dominio di oligomerizzazione (OD)?

9 The dominantnegative effect of p53 mutations in the oligomerization domain (OD) Wild-Type (+) OD Mutant (-) +/- Abbiamo il 50% di subunità wild-type e il 50% di subunità mutate nell OD

10 The dominantnegative effect of p53 mutations in the oligomerization domain Wild-Type (+) OD Mutant (-) +/- Le subunità mutate nel dominio di oligomerizzazione (OD) eterodimerizzano con le subunità wild-type inattivandole, presumibilmente interferendo con la corretta formazione dei tetrameri. Il risultato e un effetto dominante negativo. La probabilita che si formi un tetramero corretto e di 1/2x1/2x1/2x1/2= 1/16

11 The dominantnegative effect of p53 mutations in the oligomerization domain Wild-Type (+) OD Mutant (-) L eterozigosi per una mutazione nell oligomerization domain di p53 può avere un effetto molto maggiore dell atteso 50% sull attività globale di p53 nella cellula, per via dell effetto dominante-negativo. Per questo motivo, in associazione ad altre mutazioni, una singola mutazione (in eterozigosi) di p53 puo essere un importante contributo allo sviluppo di un clone tumorale.

12 Some additional information on p53 Human p53 is 393 amino acids long and has seven domains: 1. N-terminal transcription-activation domain (TAD), also known as activation domain 1 (AD1) which activates transcription factors: residues activation domain 2 (AD2) important for apoptotic activity: residues Proline rich domain important for the apoptotic activity of p53: residues central DNA-binding core domain (DBD). Contains one zinc atom and several arginine amino acids: residues nuclear localization signaling domain, residues homo-oligomerisation domain (OD): residues Tetramerization is essential for the activity of p53 in vivo. 7. C-terminal involved in downregulation of DNA binding of the central domain: residues [6] Mutations that deactivate p53 in cancer usually occur in the DBD. Most of these mutations destroy the ability of the protein to bind to its target DNA sequences, and thus prevents transcriptional activation of these genes. As such, mutations in the DBD are recessive loss-of-function mutations. Molecules of p53 with mutations in the OD dimerise with wild-type p53, and prevent them from activating transcription. Therefore OD mutations have a dominant negative effect on the function of p53.

13 Reverse vaccinology: from genome sequence to vaccine

14 Louis Pasteur e il vaccino della rabbia

15 Strategia pasteuriana classica: utilizzo di microorganismi interi attenuati

16 La risposta immunitaria protettiva e non protettiva Non tutte le componenti (proteine) di un virus o un batterio scatenano una risposta immunitaria in ugual misura. La risposta avviene solo contro alcune delle proteine del microorganismo, quello cosiddette piu immunogeniche. La risposta protettiva poi, quella che intende attivare con un vaccino ad esempio, ha come bersaglio un numero ancora piu ristretto di proteine. La risposta non protettiva e comunque di interesse per i ricercatori e può avere una preziosa valenza diagnostica. Ad esempio la sieropositività per HIV (presenza di anticorpi circolanti contro il virus), pur non conferendo immunità al virus, è evidentemente di fondamentale importanza a fini diagnostici e quindi terapeutici.

17 La risposta immunitaria protettiva e non protettiva Non tutte le componenti (proteine) di un virus o un batterio scatenano una risposta immunitaria in ugual misura. La risposta avviene solo contro alcune delle proteine del microorganismo, quello cosiddette piu immunogeniche. La risposta protettiva poi, quella che intende attivare con un vaccino ad esempio, ha come bersaglio un numero ancora piu ristretto di proteine. La risposta non protettiva e comunque di interesse per i ricercatori e può avere una preziosa valenza diagnostica. Ad esempio la sieropositività per HIV (presenza di anticorpi circolanti contro il virus), pur non conferendo immunità al virus, è evidentemente di fondamentale importanza a fini diagnostici e quindi terapeutici. Diagnostic reagents

18 Epitopi Nell ambito di una proteina in grado di stimolare una risposta immunitaria, non tutte le porzioni della proteina stimolano la risposta, ma solo alcune porzioni dette: EPITOPI Gli epitopi sono tipicamente delle brevi sequenze aminoacidiche di 9-15 aminoacidi presenti in una proteina. Spesso possono essere usati come reagenti immunologici (vaccini/diagnostici/reagenti di laboratorio) anche in forma di peptide purificato, ovvero non nel contesto della proteina intera, ma come sequenza aminoacidica sintetizzata chimicamente in laboratorio, tipicamente da ditte specializzate.

19

20 Epitopi Dunque dato un microorganismo intero, la risposta immunitaria protettiva puo essere di fatto ricondotta ad alcune porzioni molto ben circoscritte (epitopi) di alcune proteine. La sfida della Reverse Vaccinology (vaccinologia inversa) e di identificare gli epitopi, B e/o T, partendo direttamente dalla sequenza del genoma.

21 Solo alcune regioni di una proteina stimolano una risposta immunitaria Proteina

22 Solo alcune regioni di una proteina stimolano una risposta immunitaria Proteina Epitopi B Epitopi T Sequenza lineare di una proteina (linea azzurra) in cui vengono evidenziati gli epitopi B in rosso e gli epitopi T in verde: solo alcune regioni ben circoscritte sono responsabili della risposta immunitaria stimolata da una proteina immunogenica.

23 Model of penicillin-binding protein

24 Model of penicillin-binding protein

25 Solo alcune regioni di una proteina stimolano una risposta immunitaria Genoma/Proteoma

26 Solo alcune regioni di una proteina stimolano una risposta immunitaria Genoma/Proteoma Epitopi B Epitopi T

27 Solo alcune regioni di una proteina stimolano una risposta immunitaria Genoma/Proteoma Reverse Vaccinology Epitopi B Epitopi T

28 Reverse Vaccinology: targeting the immunome Microorganismo (sequenza genomica) Immunoma Epitopi T Epitopi B

29 EPITOPI B

30

31 Predizione di EPITOPI B Sequenza di una proteina? Predizione di epitopi B

32 Predizione di EPITOPI B Sequenza di una proteina Metodi Bioinformatici Metodo sperimentale high throughput: genomic phage display libraries Predizione di epitopi B

33 Predizione di EPITOPI B: metodi Bioinformatici Predizioni di idrofilicità/idrofobicità sulla sequenza primaria Metodi basati sulla conoscenza della struttura tridimensionale della proteina

34 Predizione di EPITOPI B: metodi Bioinformatici Predizioni di idrofilicità/idrofobicità basate sulla sequenza primaria

35

36 Predizione di EPITOPI B: metodi Bioinformatici Predizioni di idrofilicità/idrofobicità basate sulla sequenza primaria

37 Predizione di EPITOPI B: metodi Bioinformatici Predizioni basate sulla struttura: Gli epitopi B sono localizzati nelle regioni delle proteine visibili dell esterno, ovvero nelle regioni della proteina maggiormente esposte al solvente. Avendo la struttura di una proteina determinata tramite cristallografia, o un modello tridimensionale costruito mediante tecniche bioinformatiche di Molecular Modeling, e possibile assegnare ad ogni singolo aminoacido della proteina uno score di esposizione al solvente. E possibile, per un peptide, computare il suo score di esposizione come media degli scores degli aminoacidi che lo compongono. Quindi, dati tutti i possibili peptidi di una proteina, e possibile rankarli (classificarli) dal piu esposto al solvente al meno esposto al solvente.

38 Predizione di EPITOPI B: metodi Bioinformatici Identificazione di reagenti diagnostici per l ulcera di buruli

39 Mycobacterium ulcerans Etiologic agent of Buruli Ulcer disease It causes a necrotic skin and disability Is the third most common mycobacterial infection after tuberculosis and leprosy

40 RESULTS Proteins distribution of Mycobacterium ulcerans Extracellular proteins Lipoproteins Cell Wall proteins Proteins 1 transmembrane helix Proteins 3 transmembrane helices Cytoplasmic Data from Manuela Giombini and Anna Tramontano

41 RESULTS Class Total Models extracellular proteins lipoproteins Models Proteins Models Proteins Extracellular proteins Lipoproteins

42 per ogni possibile peptide (ad esempio quindicimero) viene calcolato il grado di esposizione al solvente. I peptidi piu esposti hanno il potenziale di contenere gli epitopi B della proteina in esame. Sequenza di una proteina Tutti i possibili peptidi di una data dimensione Etc Tutti i possibili peptidi quindicimeri: etc, come se facessi scorrere una finestra di dimensione fissa (in qs caso di 15 aminoacidi, in inglese: sliding window, finestra che scorre) sulla sequenza, scalando ogni volta di 1 aminoacido

43 Model of penicillin-binding protein

44 Model of penicillin-binding protein , primo peptide piu esposto

45 Model of penicillin-binding protein , secondo peptide piu esposto

46 Model of penicillin-binding protein , terzo peptide piu esposto

47 Selezione di reagenti diagnostici per l ulcera di buruli M. ulcerans: 4160 proteine totali Di cui extracellulari: 489 Di cui si puo fare un modello strutturale: 116 Da ognuno dei 116 modelli, testare i 5 peptidi piu esposti al solvente: 116 x 5 = 580 peptidi da testare con sieri di pazienti affetti da ulcera di buruli per identificare peptidi che reagiscano specificamente con sieri di pazienti infetti e non con sieri di persone sane. Tali peptidi saranno dei potenziali reagenti diagnostici per l ulcera di buruli (su questo progetto i lavori sono in corso).

48 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries

49 Le proteine si possono esprimere, avendo a disposizione il gene corrispondente Espressione attraverso traduzione in vitro Espressione in batterio (clonaggio in plamide batterico sotto promotore batterico) Una proteina puo essere espressa come tale, o come proteina di fusione con un altra proteina (vedi 2 hybrid system per selezione interattori) Altri sistemi di espressione

50 Solo alcune regioni di una proteina stimolano una risposta immunitaria Genoma/Proteoma Epitopi B

51 Genoma del microorganismo di interesse Un qualche sistema di espressione Ampia rappresentazione di FRAMMENTI PROTEICI che vada a coprire tutto il proteoma

52 Genoma del microorganismo di interesse Un qualche sistema di espressione Ampia rappresentazione di FRAMMENTI PROTEICI che vada a coprire tutto il proteoma Anticorpi da sieri di persone sane Anticorpi da sieri di persone malate/infette Colonne di immunocromatografia di affinità Selezione dei frammenti proteici che reagiscono specificamente con gli anticorpi da sieri di persone malate: potenziali diagnostici o vaccini

53 Break?

54 Batteri (in verde) in una cellula umana

55 Un batteriofago in procinto di infettare un batterio Kui Wang, Bioimaging Laboratory, Delaware Biotechnology Institute.

56 Altri approcci basati su Genomic Peptide Libraries PHAGE DISPLAY

57 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries piii pviii Phage genome pviii proteins piii gene pviii gene piii proteins

58 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries piii Fusione di un peptide al gene piii pviii Phage genome Porzione di una proteina eucariotica (peptide di aa) pviii proteins piii gene pviii gene piii proteins with peptide fusion

59 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries piii pviii Fusione di un peptide al gene pviii Phage genome pviii proteins with peptide fusion piii gene pviii gene piii proteins

60 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries Genoma del fago Enzima di restrizione + Frammento codificante per un peptide

61 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries piii pviii Fusione di un peptide al gene pviii Phage genome pviii proteins with peptide fusion piii gene pviii gene piii proteins

62 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries Genoma del fago Enzima di restrizione + Frammento codificante per un peptide

63 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries piii pviii Fusione di un peptide al gene pviii Phage genome pviii proteins with peptide fusion piii gene pviii gene piii proteins

64 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries Genoma del fago Enzima di restrizione + Frammenti codificanti per peptidi diversi

65 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries

66 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries Genoma del fago Enzima di restrizione + Frammenti codificanti per peptidi diversi

67 A peptide library displayed on phage: Phage Display Libraries Questa si chiama una libreria fagica, in quanto rappresenta una vera e propria collezione di frammenti proteici (peptidi, ognuno rappresentato da un clone fagico). Ad ogni frammento è attaccata una etichetta con su scritta la sua sequenza (l etichetta è la parte codificante per il peptide esposto nel genoma del fago, facilmente sequenziabile e quindi leggibile con un primer ad hoc).

68 Genoma del microorganismo di interesse Un qualche sistema di espressione Ampia rappresentazione di FRAMMENTI PROTEICI che vada a coprire tutto il proteoma

69 Predizione di EPITOPI B: genomic phage display libraries Genoma del microorganismo di interesse (batterio o virus) Frammentazione meccanica + Clonaggio dei frammenti nel genoma fagico come fusione con pviii o piii

70 A genomic peptide library displayed on phage: Phage Display Libraries

71 Anticorpi da sieri di persone sane Anticorpi da sieri di persone malate/infette Libreria fagica da DNA genomico del microorganismo di interesse, che rappresenta in sostanza una ampia rappresentazione di frammenti proteici dal microorganismo Selezione dei fagi che reagiscono specificamente con gli anticorpi da sieri di persone malate: potenziali diagnostici o vaccini

72 Commento alla slide precedente Si effettua una prima scrematura della libreria fagica con sieri di persone sane, per togliere i cloni fagici che reagiscono con anticorpi non di interesse. Ovvero si toglie il background di cloni fagici aspecifici che rimangono intrappolati dalla colonna (colonna con anticorpi verdi in figura). In questa prima colonna, i cloni che rimangono dentro sono quelli da eliminare perché aspecifici. Poi si passano i fagi che hanno passato questo primo filtro su una seconda colonna contente siero da pazienti infetti, e dunque anticorpi contro il microorganismo infettivo di cui ci stiamo occupando. I cloni fagici che reagiscono (legano) questi anticorpi sono quelli che ci interessano. Conterranno peptidi del microorganismo in grado di reagire specificamente con anticorpi contro il microorganismo, ovvero epitopi B di nostro interesse per lo sviluppo di vaccini o diagnostici.

73 Ottenuto un fago e facilissimo risalire alla sequenza del peptide corrispondente, basta sequenziare un pezzettino piccolo del genoma fagico pviii proteins with peptide fusion piii gene piii proteins Primer (oligonucleotide) per sequenziamento del peptide esposto sul fago. Con un solo primer, sempre lo stesso, posso sequenziare qualsiasi inserto (peptide di fusione) su qualsiasi clone fagico risultante ad esempio da una procedura di selezione su colonne con anticorpi immobilizzati.

74 Nella pratica vengono effettuati 2-3 cicli di arricchimento/amplificazione per selezionare i fagi specifici PHAGE DISPLAY

75 Altri approcci basati su Genomic Peptide Libraries PHAGE DISPLAY

76 Genomic peptide libraries Questi approcci sono ideali per isolare epitopi B attraverso l utilizzo di sieri di pazienti. Sono meno adatti alla selezione di epitopi T, per i quali e preferibile usare metodologie di predizione in silico Con opportune variazioni ed in linea di principio, sistemi di selezione di librerie di phage display possono essere utilizzate per isolare vaccini per patologie delle quali non e noto l agente infettivo (utilizzo di librerie combinatoriali sintetiche unito all utilizzo di sieri di pazienti)

77 EPITOPI T

78 Predizione di EPITOPI T Sequenza di una proteina? Predizione di epitopi T

79 I vari passaggi coinvolti nel processamento delle proteine e l esposizione dei peptidi in membrana in associazione a molecole di MHC Processamento (taglio) ad opera del proteasoma Trasporto dei peptidi nel reticolo endoplasmatico ad opera dei trasportatori TAP Associazione

80

81 Il complesso MHC-peptide

82