Long noncoding RNAs and the genetics of Cancer - Br J Cancer Jun 25;108(12): doi: /bjc Cheetham et al.

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1 Long noncoding RNAs and the genetics of Cancer - Br J Cancer Jun 25;108(12): doi: /bjc Cheetham et al. La combinazione di diversi approcci genome-wide usati nel progetto ENCODE ha stimolato una rivalutazione drammatica del contenuto informativo del genoma umano. Invece di isole di geni codificanti proteine in un mare di DNA spazzatura, è sempre più evidente che la maggior parte del genoma codifica informazioni per la regolazione. Il progetto ENCODE ha recentemente concluso che, sebbene solo ~ 1,2 % del genoma codifica per proteine, almeno il 20% mostra funzione biologica ed oltre l 80% mostra chiare indicazioni di funzioni biochimiche più complesse dell essere responsabili dell organizzazione tridimensionale del genoma.

2 il numero di ncrna aumenta con l'aumento della complessità di un organismo, si ritiene che questi siano responsabili di gran parte della regolazione delle funzioni complesse negli eucarioti superiori sta emergendo un ruolo importante dei longnon-coding RNA (lncrna) nella regolazione genica epigenetica delle cellule di mammifero e non solo! A central role for long non-coding RNA in cancer - Mitra SA et al. - Frontiers in Genetics, 15 Feb 2012, doi: /fgene The long non-coding RNAs: a new (p)layer in the dark matter - Derrien T et al. - Frontiers in Genetics, 09 Jan 2012, doi: /fgene Struggling to let go: a non-coding RNA directs its own extension and destruction - Bernecky e Cramer, EMBO J. (2013) 32,

3 I geni per i piccoli RNA sono presenti nel genoma e possono essere organizzati in tre modi diversi: 1) possono trovarsi raggruppati in alcune regioni genomiche ed essere regolati da un singolo promotore. Questi piccoli RNA vengono trascritti come unico pre-rna che verrà quindi spezzato per formare le forme attive; 2) possono essere generati dagli introni di geni attivamente trascritti. In seguito allo splicing di pre-mrna gli introni possono essere riciclati e usati come repressori dell mrna da cui derivano con un meccanismo di feedback negativo. In questo caso sono regolati dal promotore del gene da cui derivano. 3) Possono anche trovarsi singolarmente sparsi nel genoma regolati da un promotore proprio e non essere parte di un cluster.

4 sirna (Short Interfering RNAs): piccoli RNA a doppia elica di nucleotidi, generati da RNA a doppio filamento molto più lunghi (di solito un singolo RNA ripiegato ad hairpin). Tali RNA mediano il silenziamento genico portando alla degradazione dell RNA messaggero cui sono PERFETTAMENTE complementari, oppure provocano il silenziamento della trascrizione andando a rimodellare la cromatina a livello delle sequenze codificanti i geni cui sono complementari. mirna (MicroRNA): piccoli RNA a singola elica, lunghi nucleotidi codificati nel genoma di molti organismi. Tali RNA non sono però perfettamente complementari alla sequenza dell RNA bersaglio (uno o due mismatch) e di fatto provocano solo un blocco della traduzione senza causare la degradazione dell mrna.

5 sirna e mirna concorrono e regolare l espressione genica e lo stato della cromatina possono avere una differente origine sono trascritti da varie RNA polimerasi da un singolo filamento di DNA oppure da ambedue i filamenti e si trovano nella cellula come RNA a doppia elica. Si formano anche in risposta ad RNA estraneo (virale) ed agiscono interagendo con complementarietà quasi assoluta con i loro target sono codificati da veri e propri geni; i mirna si originano da RNA a singolo filamento che formano strutture secondarie tipo hairpin i mirna regolano l espressione genica a livello post-trascrizionale e generalmente non sono complementari al 100% con i loro target

6 Formazione dei microrna

7 Formazione dei microrna RISC è l acronimo di : RNA Induced Silencing Complex

8 Sett 2014 I mirna sono importanti modulatori dello sviluppo che, grazie alla loro capacità di silenziare contemporaneamente centinaia di geni bersaglio, hanno ruoli chiave nei grandi cambiamenti di sintesi proteica che si verificano durante la vita della cellula. Nelle cellule staminali ed in quelle progenitrici delle cellule somatiche - come quelle coinvolte nella miogenesi, nella ematopoiesi, nella formazione della pelle e durante lo sviluppo neurale la funzione dei mirna è attentamente regolamentata per promuovere e stabilizzare la scelta del destino della cellula. La loro funzione è regolata a più livelli, inclusa tra cui la trascrizione, la biogenesi, stabilità, disponibilità la loro cooperazione con altri mirna e RNAbinding proteins. Questi meccanismi di regolazione si traducono in una risposta molecolare raffinata che consente la corretta differenziazione e la funzione cellulare.

9 mirna : modulatori dello sviluppo, possono silenziare contemporaneamente centinaia di geni bersaglio Sett 2014

10 Nelle cellule staminali progenitrici delle cellule somatiche ad esempio quelle coinvolte nell ematopoiesi, la funzione dei mirna regola la scelta del destino della cellula CLP, common lymphoid progenitor; CMP, common myeloid progenitor; GMP, granulocyte monocyte progenitor; MEP, megakaryocyte erythroid progenitor. HSPC, haematopoietic stem and progenitor cell.

11 difesa antivirale signalling cellulare regolazione dell'espressione genica potrebbero forse mediare anche l eredità epigenetica transgenerazionale I piccoli RNA in quasi tutti i processi di sviluppo e patologici negli animali la loro disregolazione è associata a molte malattie umane, in particolare al cancro Sett 2014 Lug 2014

12 Sett 2014 I piccoli RNA sono sempre più riconosciuti come molecole regolatrici con la possibilità di trasmettere le informazioni tra cellule, organismi e specie. RNA cellulari funzionano nella difesa antivirale, nel signalling cellulare e nella regolazione dell'espressione genica, e potrebbero forse mediare anche l eredità epigenetica transgenerazionale.

13 Lug 2014 I microrna sono piccoli RNA non codificanti che funzionano come molecole guida nel silenziamento dell'rna. Avendo come target la maggior parte dei trascritti codificanti proteine, i mirna sono coinvolti in quasi tutti i processi di sviluppo e patologici negli animali. La biogenesi dei mirna è sotto stretto controllo spaziale e temporale stretto, e la loro disregolazione è associata a molte malattie umane, in particolare al cancro. Negli animali, i mirna sono lunghi ~22 nucleotidi, e sono prodotti da due RNAsi - Drosha e Dicer. La biogenesi dei mirna è regolata a più livelli, inclusa la trascrizione; la loro processazione dipende da Drosha nel nucleo e da Dicer nel citoplasma; possono essere modificati per RNA editing, metilazione, uridilazione e adenilazione; interagiscono con varie proteine, tra cui le Argonauta. Stanno adesso emergendo anche percorsi non-canonici per la biogenesi di mirna che sono indipendenti di Drosha o Dicer.

14 Molecular biology: Circles reshape the RNA world - Nature Mar 21;495(7441): doi: /nature Kosik KS La versatilità dell RNA sembra illimitata, l'ultima sorpresa sono gli RNA circolari, che funzionano contrastando i mirna la traduzione degli mrna può essere soppressa dal legame sequenza-specifico con i mirna l inibizione da mirna della traduzione può essere soppressa dai circrna che sono in grado di legare molte copie di un mirna, permettendo nuovamente la traduzione dell mrna gli RNA circolari (circrna) sono molto stabili, sono abbastanza conservati ed i loro geni sono molto rappresentati nel genoma

15 gli RNA circolari (circrna) fungono da serbatoi di mirna che legano con affinità maggiore rispetto agli mrna la concentrazione dei mirna è dipendente anche dalla presenza di altri mrna, detti cerna (competitive endogenous RNA), che possono legare gli stessi mirna e quindi competere per la traduzione la pressione selettiva nel corso dell evoluzione, che ha consentito di mantenere conservata la sequenza dei mirna sembra operare anche per le sequenze dei circrna Molecular biology: Circles reshape the RNA world - Nature Mar 21;495(7441): doi: /nature Kosik KS

16 I tirna, derivati da molecole di RNA tripartite (triplex) relazionate ai trna, inducono il silenziamento genico di un gran numero di geni target La formazione dei tirna structure non richiede il processamento da Dicer per formare piccole molecole di RNA I tirna, lunghi nucleotidi, operano il silenziamento genico in modo totalmente diverso dai sirna dei mammiferi I tirna operano un silenziamento genico più potente di quello mediato dai sirna I tirna sono un nuovo tipo di piccoli RNA che potrebbero essere usati per lo sviluppo di efficienti terapie antivirali ed anticancro Branched, tripartite-interfering RNAs silence multiple target genes with long guide strands - Nucleic Acid Ther Feb;22(1):30-9. doi: /nat Chang et al.

17 Gen 2014 pirna = (piccole molecole di RNA di circa 30 nucleotidi, che legano le proteine Piwi inducendo silenziamento di retrotrasposoni e dei geni durante la formazione dello spermatozoo) La scoperta di milioni di RNA che interagiscono con le proteine PIWI ha rivelato una dimensione affascinante e inaspettata della biologia. Si pensava che la pathway PIWI-piRNA fosse specifica per le cellule germinali, anche se la funzione somatica delle proteine PIWI era stato documentata già da quando sono state scoperte. Studi recenti hanno cominciato a riesplorare questa via nelle cellule somatiche in diversi organismi, in eucarioti particolarmente semplici. Questi studi hanno illustrato le molteplici funzioni nelle cellule somatiche, non solo come silenziamento di trasposoni, ma anche nel riassetto del genoma e nella la programmazione epigenetica, con ruoli biologici nella funzione delle cellule staminali, la rigenerazione di tutto il corpo, la memoria e forse il cancro.

18 tra gli ncrna, i lncrna sono più numerosi e funzionalmente diversi lncrna sono già stati implicati in malattie umane come il cancro e la neurodegenerazione, sottolineando l'importanza di questo settore emergente ruolo dei lncrna nei meccanismi di crescita cellulare, invasione e metastasi possibilità di utilizzare lncrna come biomarcatori diagnostici e prognostici di neoplasie umane A central role for long non-coding RNA in cancer - Mitra SA et al. - Frontiers in Genetics, 15 Feb 2012, doi: /fgene The long non-coding RNAs: a new (p)layer in the dark matter - Derrien T et al. - Frontiers in Genetics, 09 Jan 2012, doi: /fgene Struggling to let go: a non-coding RNA directs its own extension and destruction - Bernecky e Cramer, EMBO J. (2013) 32,

19 Esempi di strutture tridimensionali di lncrna

20 Molto difficile fare previsioni di struttura tridimensionale

21 In vivo genome-wide profiling of RNA secondary structure reveals novel regulatory features - Nature Nov 24. doi: /nature Ding Y, Tang Y, Kwok CK, Zhang Y, Bevilacqua PC, Assmann SM.

22 Espressione differenziale di long non-coding RNA in tre differenti neoplasie umane

23 Associazione di hotair, lncrna trascritto nel dominio Hox C, induce invasione/metastasi nel carcinoma mammario, cambia il fenotipo cellulare, lega enzimi che modificano gli istoni Dati di espressione Dati di prognosi Gupta et al. Nature, 464, , 2010 La distruzione di alcuni lncrnas potrebbe essere importante per produrre nuovi farmaci anticancro

24 HOTAIR Tumori mammari primari e metastasi. Tumori del colon retto e metastasi epatiche. UCA1 urothelial carcinoma associated 1 Tumore della vescica, del colon, della cervice uterina e del polmone PRNCR1 (prostate cancer non-coding RNA 1) MALAT1, HULC SPRY4-IT1 lncrna-heih (High Expression In HCC) Cancro della prostata Carcinoma epatocellulare Coinvolto nel melanoma umano Promuove la progressione tumorale nel carcinoma epatocellulare UCA1 regola la progressione del ciclo cellulare nel cancro della vescica Yang C, Li X, Wang Y, Zhao L, Chen W. Long non-coding RNA UCA1 regulated cell cycle distribution via CREB through PI3-K dependent pathway in bladder carcinoma cells. Gene ANRIL è in qualche modo legato a malattie cardiovascolari, aneurismi intracranici, tumori in genere, diabete di tipo 2, periodontiti, malattia di Alzheimer, endometriosi, fragilità nell anziano, glaucoma. Congrains A, Kamide K, Katsuya T, Yasuda O, Oguro R, Yamamoto K, Ohishi M, Rakugi H. CVD-associated non-coding RNA, ANRIL, modulates expression of atherogenic pathways in VSMC. Biochem Biophys Res Commun. 2012

25 I long non-coding RNA: sono trascritti dalla RNA polimerasi II, talvolta dalla III presentano promotori come i geni che codificano per proteine molti sono soggetti a splicing la loro sintesi è regolata da fattori di trascrizione la loro sintesi è generalmente correlata ai pattern di espressione di geni

26 In questi ultimi mesi stanno venendo alla luce un gran numero di funzioni complesse che sono svolte da long non-coding RNA

27 lncrna sfruttano la potenza di appaiamento delle basi per legare selettivamente ed agire su altri acidi nucleici ruolo centrale dell'rna nell evoluzione umana e nell ontogenesi Mag 2014

28 Mag 2014 Gli RNA non codificanti (ncrna) realizzano una notevole varietà di funzioni biologiche. Regolano l'espressione genica a livello della trascrizione, del processamento dell'rna, e della traduzione. Proteggono i genomi da acidi nucleici estranei. Possono guidare la sintesi del DNA o il riarrangiamento del genoma. La maggior parte dei ncrna operano come complessi RNA-proteine, tra cui i ribosomi, le snrnp, le snornp, le telomerasi, i microrna, e i lncrnas. Praticamente tutti i ncrna sfruttano la potenza di appaiamento delle basi per legare selettivamente ed agire su altri acidi nucleici.

29 Mag 2014 L'evidenza suggerisce che l'rna non è solo un messaggero tra DNA e proteine, ma è anche coinvolto nella regolazione della organizzazione del genoma e nell'espressione genica, che è sempre più elaborata negli organismi complessi. La regolazione da RNA sembra funzionare a molti livelli; in particolare, svolge un ruolo importante nei processi epigenetici che controllano il differenziamento e lo sviluppo. Queste scoperte suggeriscono un ruolo centrale per l'rna nell evoluzione umana e nella ontogenesi.

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32 Mag 2014 Sono stati scoperti un gran numero di lunghi RNA non codificanti lunghi (lncrna). Questi nuovi ed enigmatici giocatori nel complesso ambito della trascrizione sono codificati da una parte significativa del genoma, ma le loro funzioni sono per lo più sconosciute. Le prime scoperte supportavano il paradigma in cui lncrna regolavano la trascrizione tramite la modulazione della cromatina, ma nuove funzioni stanno costantemente emergendo. Data la versatilità biochimica dell RNA, i lncrna possono essere utilizzati per vari compiti, tra cui la regolazione post-trascrizionale, l organizzazione di complessi proteici, il signalling cellulacellula e la regolazione allosterica delle proteine.

33 Sono noti molti lncrna, codificati da una parte significativa del genoma, con funzione poco sconosciuta. Quelli con funzione nota regolano la trascrizione attraverso modulazione della cromatina, altri sono utilizzati per la regolazione post-trascrizionale, organizzazione di complessi proteici, signalling cellulacellula, regolazione allosterica delle proteine. (a) L RNA è adatto per interagire in modo specifico; per riconoscere un acido nucleico target basta l appaiamento di piccole sequenze (6 nucleotidi). Per riconoscere in modo specifico una singola base di un acido nucleico, una proteina ha bisogno di un motivo di almeno 35 aminoacidi (105 coppie di basi della sequenza genomica); (b) un RNA si può piegare in complesse strutture tridimensionali che possono specificatamente legarsi a vari ligandi, comprese piccole molecole e peptidi; RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts - Nat Rev Mol Cell Biol Oct 9. doi: /nrm Geisler S, Coller J.

34 lncrnas regolano la trascrizione attraverso vari meccanismi: (a-c) lunghi RNA non codificanti (lncrna) possono modulare la cromatina sia in modo trascrizione-indipendente (parte a) che in modo trascrizione - dipendente (parti b e c). I lncrna possono legare uno o più complessi che modificano la cromatina ed indirizzare la loro attività su loci specifici di DNA (parte a). A seconda della natura degli enzimi legati, le modificazioni della cromatina mediate da un lncrna possono attivare o reprimere l espressione genica. I complessi che modificano la cromatina legati al dominio C-terminale (CTD) della Pol II possono modificare la cromatina durante la trascrizione del lncrna (parte b). La trascrizione di lncrna può anche provocare un rimodellamento della cromatina che può sia favorire che inibire il legame di fattori di regolazione (parte c). A seconda della natura dei fattori che legano durante il rimodellamento, l'espressione genica può risultare attivata o no. RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts - Nat Rev Mol Cell Biol Oct 9. doi: /nrm Geisler S, Coller J.

35 L RNA è adatto per una espressione transiente in quanto la trascrizione (e maturazione) genera RNA completamente funzionali che possono essere degradati rapidamente.

36 RNA è malleabile e più tollerante alle mutazioni anche delle regioni responsabili del riconoscimento del target eventi RNA-dipendenti possono essere ereditari

37 (a) piccoli lncrna nucleolari (sno-lncrna) generati dal locus 15q11-q13 legano e modulano l'attività del fattore di splicing alternativo FOX2, e questo può inibire lo splicing mediato da FOX2; (b) i ribonucleocomplessi 1 (RNC1) contenenti lncrna si legano a Dicer per inibire il processamento di piccoli RNA; RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts - Nat Rev Mol Cell Biol Oct 9. doi: /nrm Geisler S, Coller J.

38 (c) il lncrna gadd7 lega e modula la capacità di TDP43 (TAR DNA-binding protein 43) di avere come target ed elaborare specifici mrna; (d) i lncrna possono agire come impalcature per organizzare diversi complessi macromolecolari; RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts - Nat Rev Mol Cell Biol Oct 9. doi: /nrm Geisler S, Coller J.

39 (e) come cargo di esosomi che mediano il trasferimento di materiale tra cellule, RNA shuttle esosomali (exrna) possono agire come molecole di signalling durante la comunicazione cellula-cellula; il cargo degli esosomi include mrna, mirna e lncrna; (f) I lncrna espressi dalle regioni promotore di geni che codificano per gli anticorpi formano un loop R (ripiegamento) per portare i promotori alla ricombinazione mediante reclutamento di adenosina deaminasi ( AID). RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts - Nat Rev Mol Cell Biol Oct 9. doi: /nrm Geisler S, Coller J.

40 (d-g) i lncrna possono modulare sia il macchinario generale della trascrizione (parti d ed e) che fattori regolatori specifici (parti f e g). I lncrna possono legare direttamente la Pol II per inibire la trascrizione (parte d). La formazione di strutture triplex lncrna -DNA può anche inibire l'assemblaggio del complesso di pre-inizio trascrizione (parte e). I lncrna si possono ripiegare in strutture che mimano siti che legano il DNA (a sinistra) o che inibiscono o aumentano l'attività di specifici fattori di trascrizione (a destra, parte f). I lncrnas possono anche regolare l'espressione genica legando specifici fattori di trasporto per inibire la localizzazione nucleare di specifici fattori di trascrizione (parte g). RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts - Nat Rev Mol Cell Biol Oct 9. doi: /nrm Geisler S, Coller J.

41 lncrnas regolano la trascrizione attraverso vari meccanismi: (a-c) lunghi RNA non codificanti (lncrna) possono modulare la cromatina sia in modo trascrizione-indipendente (parte a) che in modo trascrizione - dipendente (parti b e c). I lncrna possono legare uno o più complessi che modificano la cromatina ed indirizzare la loro attività su loci specifici di DNA (parte a). A seconda della natura degli enzimi legati, le modificazioni della cromatina mediate da un lncrna possono attivare o reprimere l espressione genica. I complessi che modificano la cromatina legati al dominio C-terminale (CTD) della Pol II possono modificare la cromatina durante la trascrizione del lncrna (parte b). La trascrizione di lncrna può anche provocare un rimodellamento della cromatina che può sia favorire che inibire il legame di fattori di regolazione (parte c). A seconda della natura dei fattori che legano durante il rimodellamento, l'espressione genica può risultare attivata o no. RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts - Nat Rev Mol Cell Biol Oct 9. doi: /nrm Geisler S, Coller J.

42 (d-g) i lncrna possono modulare sia il macchinario generale della trascrizione (parti d ed e) che fattori regolatori specifici (parti f e g). I lncrna possono legare direttamente la Pol II per inibire la trascrizione (parte d). La formazione di strutture triplex lncrna -DNA può anche inibire l'assemblaggio del complesso di pre-inizio trascrizione (parte e). I lncrna si possono ripiegare in strutture che mimano siti che legano il DNA (a sinistra) o che inibiscono o aumentano l'attività di specifici fattori di trascrizione (a destra, parte f). I lncrnas possono anche regolare l'espressione genica legando specifici fattori di trasporto per inibire la localizzazione nucleare di specifici fattori di trascrizione (parte g). RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts - Nat Rev Mol Cell Biol Oct 9. doi: /nrm Geisler S, Coller J.

43 Figura: influenza dei lncrna nel processamento e nella regolazione posttrascrizionale degli mrna: (a,b) i long non coding RNA (lncrna) possono modulare il processamento degli mrna. I pattern di splicing possono essere influenzati da lncrna che si legano con il pre-mrna (parte a). Per esempio lo splicing del primo introne del pre-mrna del gene MYC del neuroblastoma è impedito da un trascritto naturale antisenso. I lncrna antisenso che legano un mrna possono dirigerne l editing, forse attraverso l'associazione del duplex con gli ADAR ( adenosina deaminasi che agisce sull RNA), enzimi che catalizzano la conversione dell'adenosina in inosina negli RNA a doppio filamento (parte b); (c) possono up-regolare la traduzione attraverso l'associazione con la regione 5' di un mrna; RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts - Nat Rev Mol Cell Biol Oct 9. doi: /nrm Geisler S, Coller J.

44 (d-f) i lncrna contenenti sequenze Alu si possono legare con gli elementi Alu presenti nella regione 3' non tradotta (UTR) di un mrna, ed il tratto di RNA a doppia elica che si forma può attivare un percorso di degradazione dell mrna molecolarmente simile al decadimento mediato da nonsenso (parte d). LncRNA possono mascherare i siti di legame per mirna su un mrna target per bloccare il silenziamento indotto dal mirna attraverso la formazione di un RISC (RNA-induced silencing complex) (parte e). LncRNA lineari o circolari possono funzionare come esche per sequestrare mirna dai loro mrna target (parte f). RNA in unexpected places: long non-coding RNA functions in diverse cellular contexts - Nat Rev Mol Cell Biol Oct 9. doi: /nrm Geisler S, Coller J.

45 Gen 2014 Il numero di specie di lncrna aumenta nei genomi di organismi evolutivamente complessi, il che sottolinea l'importanza dei livelli di controllo da RNA nell evoluzione degli organismi pluricellulari. In questa review, descriviamo la funzione di lncrna nei processi di sviluppo, come ad esempio nella compensazione del dosaggio, nell imprinting genomico, nel differenziamento cellulare e nella organogenesi, con particolare attenzione allo sviluppo dei mammiferi.

46 Figura 3: Controllo della Pluripotenza

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