CONTE e RICERCHE di LIEVITI

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3 CONTE e RICERCHE di LIEVITI controllo per contaminanti: totali recuperati in acqua peptonata e seminati su malto lieviti osmofili in diluente (es. glicerolo 18-30%) e mezzo (es. saccarosio 40%) a bassa a w controllo di starters analisi vitalità e funzionalità analisi di dominanza del ceppo inoculato controllo per lieviti selvaggi nel prodotto grezzo da fermentare con lieviti selezionati. mezzo addizionato di lisina Rivitalizzazione di cellule danneggiate (eccesso di sali, zuccheri, riscaldamento, congelamento): incubazione in malt broth 3h a 25 C

4 MUFFE???

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7 MUFFE TIPICHE CRITICHE Xerofile (a w ) termotolleranti (fino a 90 C per 15 ) anaerobiosi-tolleranti tossinogene

8 MUFFE ANALISI ACQUA: filtrazione su membrana 0.45µm e incubazione. limite <10ufc/ml SPEZIE, CEREALI, FARINE, PASTA FRESCA, PRODOTTI DA FORNO, CARNE E SALUMI, PRODOTTI LATTIERO-CASEARI, SUCCHI DI FRUTTA, CONSERVE DI POMODORO, CAFFE, FRUTTA SECCA, MANGIMI ANIMALI: conta ufc o percentuale e analisi per micotossine

9 Valori guida per: muffe lieviti Muffe/lieviti Succhi frutta sciroppi bibite, caffè < 10 Vegetali freschi da consumare crudi pronti per il consumo e insalate della quarta gamma < 200 Generi da forno e paste artigianali < 100 < 100 Generi da forno e paste industriali < 10 Farine < 1000 < 5000 Pasticceria fresca, riso < 500 Burro < Yogurt < 10 < 10 Prosciutti < 100 Spezie, erbe < 1000 Prodotti di gastronomia vari refrigerati < 100

10 percentuale di contaminazione da muffe dopo conta con cella di Howard su materiale setacciato se concentrato dopo diluizione a residuo refrattometrico del 7.5% Interpretazione dei risultati: 30% qualità superiore 40% qualità normale al di sopra inaccettabile

11 Muffe in alimenti per consumo animale 1-5x10 5 CFU/g comuni 70% dei mangimi contaminato da una o più micotossine ma più di 10 6 CFU/g: divengono visibili alimento non appetibile digeribilità e valore nutritivo ridotto tenore lipidico ridotto produzione ridotta per ridotta assunzione maggiore suscettibilità stress e malattie ad alti livelli infestazione alterazioni epatiche, renali e digestive

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14 25% delle derrate mondiali contaminate: Contenuto in aflatossina B1 e fumonisina B1 superiore al limite UE Controllo della filiera per prevenzione

15 sintomi di intossicazione da micotossine negli animali in produzione: ridotta produzione di latte ridotta produttività in generale ridotta produzione di uova qualità inferiore dei prodotti e derivati velocità di crescita minore

16 MICOTOSSINE FAMIGLIA DI CIRCA 100 MOLECOLE Sostanza Aflatossine Tricoteceni Ocratossina A Origine Aspergillus flavus e A. parasiticus Fusarium Penicillium verrucosum A. ochraceus Alimento Mais, noccioline americane, latte, nocciole Cereali e derivati Frumento, orzo, mais, caffè, frutta fresca/secca Alcaloidi ergotinici Claviceps purpurea Segale, orzo, frumento Fumonisine Patulina Zearalenone Fusarium moniliforme P. expansum Fusarium spp. Mais Mele, pere Cereali, olii, amido

17 PRINCIPALI FUNGHI PRODUTTORI DI MICOTOSSINE Asperigillus spp.

18 PRINCIPALI FUNGHI PRODUTTORI DI MICOTOSSINE Fusarium spp.

19 PRINCIPALI FUNGHI PRODUTTORI DI MICOTOSSINE Penicillium spp.

20 EFFETTI: GENOTOSSICO CANCEROGENO MUTAGENICO NEFROTOSSICO TERATOGENO IMMUNOTOSSICO Non inducono risposte immunitarie

21 INTERVALLO DI TEMPERATURE PER LA CRESCITA DI MUFFE TOSSINOGENE Condizioni ambientali ottimali per Aspergillus, Penicillium, Fusarium spp.: crescita: umidità >13% Aw 0.8 temperatura >20 C tossinogenesi: umidità 10-13% Aw temperatura >10 C Min. Ottimale Max. Penicillium verrucosum Aspergillus ochraceus Aspergillus flavus Fusarium moniliforme Substrati vegetali più suscettibili di quelli animali

22 Modello mais Clima temperato umido prevalenza di Fusarium (Fumonisine, Zearalenone, tricoteceni) Clima caldo mediamente secco prevalenza di Fusarium e presenza di Aspergillus (Fumonisine e tracce di aflatossine) Clima fortemente secco e caldo prevalenza di Aspergillus (forte contaminazione da aflatossine) Estate 2003 Italia e Europa

23 Aspergillus flavus Aflatossina B1, il più potente cancerogeno naturale conosciuto Altre aflatossine (B1, B2, G1, G2) sono prodotte da A. parasiticus

24 Prodotto AFB1 µg/kg AF TOT µg/kg AFM1 µg/kg Arachidi, frutta a guscio e frutta secca destinati al consumo diretto Arachidi, destinati alla cernita Frutta a guscio e frutta secca destinati alla cernita Cereali Cereali destinati alla cernita Granoturco desinato alla cernita Latte crudo Spezie

25 Prodotto AFB1 µg/kg AF TOT µg/kg AFM1 µg/kg Alimenti per l infanzia e alimenti a base di cereali destinati a lattanti e prima infanzia 0,1 - - Alimenti per lattanti e alimenti di proseguimento compresi il latte per lattanti e il latte di proseguimento - - 0,025 Alimenti dietetici a fini medici speciali destinati in modo specifico ai lattanti 0,1-0,025

26 Altri paesi: limiti variabili: da 5 μg/kg su qualsiasi prodotto in Belgio fino a 50 μg/kg in Cina.

27 PATULINA La più importante specie produttrice è Penicillium expansum, che causa marcescenza nelle mele ed altri frutti.

28 Prodotto Patulina µg/kg Succhi di frutta, in particolare di mela, succhi di frutta concentrati e nettare di frutta Bevande spiritose, sidro e altre bevande fermentate derivate da succo di mela Composta a purea di mele 25.0 Succo di mela e altra frutta per l infanzia 10.0

29 OCRATOSSINE Presenti nelle regioni temperate in tutti i cereali e nelle regioni tropicali in caffè e cacao. Prodotte da Aspergillus ochraceus e da Penicillum verrucosum.

30 Prodotto Alimenti per l infanzia e alimenti a base di cereali destinati a lattanti e prima infanzia Alimenti dietetici a fini medici speciali destinati in modo specifico ai lattanti Caffè tostato Caffè solubile Vino e bevande a base di vino Succo d uva e bevande che contengono succo d uva Cereali non lavorati ( compreso il riso e il grano saraceno) Tutti i prodotti derivati dai cereali ( compresi i prodotti lavorati a base di cereali destinati al consumo diretto) Frutti essicati della vite OTA µg/kg 0,5 0, ,0 3,0 10,0

31 ASSUNZIONE DI OCRATOSSINA A (OTA) SULLA BASE DEI DATI EUROPEI Alimenti Cereali Vino rosso Caffè Birra Maiale Uva secca Spezie Pollame Legumi Succo d uva totale Concentrazione media di OTA (mg/kg = ppb) 0,5 0,19 0,9 0,07 0,1 2,8 11 0,03 0,1 1,0 Assunzione di OTA giornaliera totale (ng/kg p. c.)* % 1,90 54,0 0,54 15,0 0,43 12,0 0,27 7,6 0,13 3,7 0,11 3,1 0,09 2,6 0,03 0,9 0,02 0,6 ** ** 3,50 * Peso corporeo di 60 kg; ** dati sui consumi non disponibili

32 QUANTITA MASSIMA GIORNALIERA TOLLERABILE DI OCRATOSSINA A < 5 ng/kg p.c.

33 PRESENZA DI OCRATOSSINA A NEL VINO E NELLA BIRRA Prodotto Campioni No. Incidenza (%) Intervallo (ng/ml) VINO ROSSO VINO ROSE VINO BIANCO VINO DA DESSERT BIRRA ,41-7,63 0,15-2,44 0,09-0,97 0,80-3,85 0,03-0,20

34 Detossificazione durante la fermentazione? I lieviti assorbono OTA (47-70%) I batteri lattici assorbono OTA (8 28%) Caratterizzazione ceppi di lievito capaci di assorbire OTA Utilizzazione lieviti inattivati come agenti detossificanti

35 TRICOTECENI Prodotti da specie di Fusarium in cereali immagazzinati e farine

36 Deossinivalenolo

37 Limiti UE Prodotto Deossinivalenolo μg/kg Cereali non trasformati diversi da grano duro, avena e mais Grano duro e avena non trasformati Mais non trasformato Cereali destinati a consumo diretto Pasta (secca) Pane, pasticceria, biscotti, merende, cereali da colazione Alimenti per bambini e lattanti

38 ZEARALENONE Micotossina estrogenica prodotta da Fusarium graminearum e Fusarium culmorum

39 Zearalenone Limiti UE (1881/2006): μg/kg Cereali non processati tranne mais 100 Mais non trasformato 200 Farine di cereali e crusca cons. diretto 75 Farina di mais, germe, semola, olio cons. diretto 200 Prodotti panetteria, pasticceria, merende pronte 50 Trasformati per lattanti-infanzia 20

40 ALLERTA MERCI - TURCHIA (B)- Segnalazioni dal Sistema di allerta Europeo. - Ministero della Sanità italiano - N 79 Data della segnalazione: 28/11/2000 Merce: Fichi secchi. Produttore o esportatore: SENTAS A. S. -Izmir- Turckey. Importatore o Distributore: UNIFOOD IMPORT A/S -Vallensbaekvej 26- DK 2605 Brondby. Rischio segnalato: Aflatossine superiore ai limiti massimi consentiti. Valori: B1=5,9 ppb; B2=0,6 ppb; G1=1,0 ppb; G2=0,2 ppb; Tot.=7,7 ppb. Luogo delle analisi: Alfred Jorgensen, Laboratorium. Metodo: FT 011,1 (AJL BLK-11, Verified by Vicam Aflatest. 2.2,1). Provvedimento adottato: Proibizione della vendita, ritiro dai Supermercati. N 80 Data della segnalazione: 28/11/2000 Merce: Fichi secchi. Produttore o esportatore: DISPATCHER CEVDET, AKSUT & SONS. Importatore o Distributore: 1) ARMANDO LOPES PAIXAO & FILHOS LTDA, Souds 2365 Torres Novas. 2) UNIARME UNIAO DI ARMEZENISTAS DE MARCEARIA, CRL Rua Joao Chagas, Linda a Velha. Rischio segnalato: Aflatossine superiore ai limiti massimi consentiti. Valori: 1) B1=8,7 ppb; B2=0,7 ppb; G1=3,6 ppb. 2) B1=15,8 ppb; B2=1,5 ppb; G1=3,7 ppb. Luogo delle analisi: Laboratorio Central de qualidade alimentar. Metodo:- Provvedimento adottato: Respingimento alla frontiera. N 81

41 N 85 Data della segnalazione: 14/12/2000 Merce: Pistacchi sgusciati "Gurlic". Produttore o esportatore: ASIM SAMIL AGRICULTURAL PRODUCTS, Gaziantep, Turchia. Importatore o Distributore: LINDIT & SPRUNGL SEESTR. 204 CH-8802 Kilchberg -Svizzera. Rischio segnalato: Aflatossine superiore ai limiti massimi ammissibili. Valori: 1) B1=11,5 ppb; G1=7,5 ppb. 2) B1=34 ppb; G1=6,3ppb. Provvedimento adottato: Respinti allo Speditore austriaco. N 86 Data della segnalazione: 15/12/2000 Merce: Fichi secchi. Produttore o Esportatore: AKTRANS NAKLIUYAT VE LIMITED SIRCHETI, AKDENIZ CAD NO 1 REYENT T & HANI KAT, 7 No /35210 Izmir. Importatore o Distributore: TRANSCER TRANSORMACAO DE CAREAIS S.A. Rua das Casas Queimadas Grijo 4415 Carvalos, Vila Nova de Gaia. Rischio segnalato: Aflatossine. Valori: B1=6,2 ppb; B2=1,0 ppb; G1=1,0 ppb. Metodo: - Luogo delle analisi: Laboratorio Central de Qualidade Alimentar. Provvedimento adottato: Respingimento all'importazione. N 87 Data della segnalazione: 20/12/2000 Merce: Nocciole macinate. Produttore o esportatore: PRODOTTO PRE: PETER PERREI GROB UND Aubenhandel GMBH D Importatore o Distributore: EDEKA ZENTRALE INDUSTRIEGEBIET D Straubfurt.

42 N 91 Data della segnalazione: 15/12/2000 Merce: " Balcerez" (Miscela di frutta secca e miele, con parti di pistacchi, arachidi, nocciole, noci e mandorle in miele). Produttore o Esportatore: YENI AKSU BAL LTD. STI IKITELLI CAD. Imsan Sanay Setisi B, Blok NO, 1 Ikitelliist. Importatore o Distributore:-. Rischio segnalato: Elevati livelli di aflatossine. Valori: Contenuto in Aflatossine nella frutta secca: 1) B1=23,6 ppb; B2=3,0 ppb; G1=< 0,6 ppb; G2= < 0,6 ppb. 2) B1=42,8 ppb; B2=5,0 ppb; G1=< 0,6 ppb; G2= < 0,6 ppb. 3) B1=85,5 ppb; B2=8,8 ppb; G1=< 12,7 ppb; G2= < 0,6 ppb. 4) B1=126,1 ppb; B2=12,0 ppb; G1=1,1 ppb; G2= < 0,6 ppb. Contenuto in Aflatossine nella miscela: 1) B1=19,3 ppb; B2=2,5 ppb; G1=< 0,6 ppb; G2= < 0,6 ppb. 2) B1=20,6 ppb; B2=2,4 ppb; G1=< 0,6 ppb; G2= < 0,6 ppb. 3) B1=72,0 ppb; B2=7,4 ppb; G1=< 10,7 ppb; G2= < 0,6 ppb. 4) B1=113,0 ppb; B2=10,7 ppb; G1=1,0 ppb; G2= < 0,6 ppb. Metodo: Purificazione in colonna per immunoaffinità, seguito da HPLC. Luogo delle analisi:-. Provvedimento adottato: Sequestro e distruzione della merce.

43 TEST RAPIDI: metodi immunoenzimatici, rivelazione tramite lettura spettrofotometrica o fluorimetrica: non consentono di discriminare metaboliti simili TEST ELISA: saggio immunoenzimatico che prevede semplice preparazione del campione TEST FLUORIMETRICO: lettura della fluorescenza (naturale o indotta) su estratto purificato in colonne ad immunoaffinità

44 METODI CROMATOGRAFICI: determinazione quantitativa e qualitativa dei metaboliti campione purificato (macinato, omogeneizzato, purificato mediante estrazione in fase liquida, solida o per immunoaffinità) discriminazione univoca dei metaboliti rilevazione <0.001mg/kg HPLC o GC con rivelatore in fluorescenza o collegato allo spettrometro di massa

45 Le micotossine nella catena Alimentare Fattori Biologici Piante suscettibili Funghi Tossigenici + Fattori Ambientali Temperatura Danni Meccanici Insetti Uccelli Roditori + Fattori tecnologici Metodi di Raccolta Livello di Maturazione Fase di Stoccaggio Temperatura Umidità Contaminazione crociata Uomo Animali

46 aratura Preparazione per semina, concimazione e diserbo Strategie di controllo: Acquisto seme semina GAPs e GMPs irrigazione Trattamento insetticida HACCP raccolta Stoccaggio pre-essiccamento essiccamento Stoccaggio post essiccamento trasporto Stoccagio in azienda

47 Fattori biologici che influenzano la crescita dei funghi tossigenici e la sintesi di micotossine nei prodotti, in preraccolta e in post-raccolta. in campo alla raccolta in magazzino Interazione con la pianta parassitismo stress della pianta nutrizione minerale traslocazione delle tossine Tossigenicità del fungo - specificità - variabilità - instabilità Insetti vettori -- Interazione tra micoflora -- Autoriscaldamento -- --

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49 POSSIBILI STRATEGIE DI CONTROLLO DOPO LA RACCOLTA E DURANTE LE FASI DI CONSERVAZIONE E TRASPORTO METODI FISICI DI PREVENZIONE controllo temperatura controllo umidità aerazione ambiente pastorizzazione irradiazione atmosfera controllata METODI CHIMICI DI PREVENZIONE utilizzo consentito di almeno 30 differenti sostanze fra cui: acidi grassi volatili acido formico acido propionico acido iso-butirrico acido sorbico

50 METODI DI DETOSSIFICAZIONE MECCANICI Eliminazione di semi infetti (USA e Australia per arachidi) non utilizzabile per cereali o per eliminare aflatossine Macinazione del grano riduce di poco i livelli di aflatossine non riduce i livelli di zearalenone e di tricoteceni TERMICI Aflatossine trattamento minimo 200 C Zearalenone resiste ai processi di cottura tradizionale Sistema che può ridurre i valori nutrizionali dell'alimento IRRADIAZIONE Esposizione alla luce ultravioletta riduce sensibilmente il livello di aflatossine, raggi gamma poco utilizzata sinora ESTRAZIONE CON SOLVENTI Si possono estrarre le aflatossine con solventi organici (acetone e/o alcool) ma perdita di caratteristiche organolettiche e nutrizionali Costo del processo tecnologico

51 METODI CHIMICI Trattamenti acidi Soluzioni di acidi forti poco applicabili su larga scala aflatossine B 2 e G 2 sono resistenti Trattamenti ossidativi Ipoclorito di sodio utilizzato in laboratorio è poco applicabili su larga scala Acqua ossigenata può essere utilizzata per le aflatossine nelle arachidi Trattamento con bisolfito utilizzato con H 2 S per la degradazione delle aflatossine e della patulina Trattamenti alcalini Ammoniaca riduce il livello di aflatossine del 99%