CORSO INTEGRATO DI GENETICA a.a Genetica molecolare in medicina: Analisi di Mutazioni. Cristina Bombieri 6 novembre 2012

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1 CORSO INTEGRATO DI GENETICA a.a Genetica molecolare in medicina: Analisi di Mutazioni Cristina Bombieri 6 novembre 2012

2 APPLICAZIONI DEI POLIMORFISMI DEL DNA IDENTIFICATORI INDIVIDUALITA Controllo relazioni parentali in fam. con m. mendeliane Genetica di popolazione; studi antropologici ed evolutivi Identificazione individuale Indagini di paternità Sangue periferico, ossa, saliva, capelli Indagini criminalistiche Tracce biologiche (sangue, capelli, sperma, Controllo chimerismo Sangue periferico, midollare Mola idatiforme Sangue periferico, tessuto mola MARCATORI GENETICI saliva, ossa) Analisi di linkage Identificare geni malattia (DMD, HD, CF diagnosi portatore) Mappaggio sia genetico sia fisico ordinam. geni chr det. distanza fisica tra geni

3 Mutazione = variazione della sequenza nucleotidica rispetto ad una sequenza di riferimento -> alterazione ereditabile a carico della struttura primaria del DNA senza alcuna implicazione sul significato funzionale di tale cambiamento Effetti evolutivi = neutra, vantaggiosa, svantaggiosa Mutazione Patologica = produce una consistente alterazione della funzione svolta da un gene, determinando così l insorgenza di una malattia Polimorfismo = mutazione con frequenza >1% nella popolazione

4 Mutazioni patologiche: Conseguenze funzionali La presenza della mutazione può causare: Perdita di funzione: assenza o riduzione della funzione svolta Guadagno di funzione: aumento o creazione di nuova funzione

5 Perché la diagnosi molecolare? Diagnosi di una malattia è un atto clinico Analisi mutazioni serve a: Confermare diagnosi clinica Determinare le mutazioni specifiche per successive analisi nei familiari Diagnosi Pre-Natale Identificazione dei portatori Migliorare conoscenze rapporto genotipo/fenotipo e pato-fisiologia della malattia

6 GENETICA MOLECOLARE IN MEDICINA SVILUPPI SCIENTIFICI Mappatura gene Identificazione gene Classificazione mutazioni patologiche APPLICAZIONI MEDICHE Diagnosi indiretta (linkage) Identificazione mutazioni Diagnosi diretta (mutazione)

7 Metodi per l identificazione di mutazioni: Applicazioni possibili 1) Ricerca diretta di mutazioni: 1a) Ricerca aspecifica di mutazione, ignota o nota: significato funzionale non necessariamente noto -> identificazione nuove mutazioni, screening genetici di popolazioni numerose, (diagnosi di malattia) 1b) Analisi specifica di una mutazione nota: mutazioni patologiche -> diagnosi di malattia; polimorfismi, marcatori DNA -> identificazione individuale (medicina forense, trapianti midollo, ) 2) Analisi di Linkage: identificazione nuovi geni, diagnosi indiretta di malattia

8 Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche 1. Identificare e sequenziare il gene malattia 2. Cercare le mutazioni nel gene 3. Stabilire quali mutazioni sono patologiche 4. Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni 5. Disegnare pannelli popolazione specifici 6. Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di interesse

9 MAPPAGGIO E IDENTIFICAZIONE GENI (per caratteri mendeliani) 1. Mappare il locus o i loci di interesse e ordinarli sul cromosoma Polimorfismi DNA Mappe genetiche e fisiche Linkage e LD 2. Identificazione gene contenuto nella regione candidata Clonaggio funzionale e posizionale Human Genome Project 3. Determinazione della sequenza del gene 4. Confermare il gene candidato: identificare mutazioni patologiche 5. Dimostrare che il gene candidato è legato alla malattia 6. Determinare sequenza e struttura del prodotto genico e collegare funzione del gene alla malattia

10 MAPPAGGIO E IDENTIFICAZIONE GENI (per caratteri mendeliani) 1. Mappare il locus o i loci di interesse e ordinarli sul cromosoma Polimorfismi DNA Mappe genetiche e fisiche Linkage e LD VEDI LEZIONI 29-30: ANALISI DI LINKAGE

11 2. Clonaggio e identificazione del gene malattia

12 Clonaggio posizionale

13 original logical progression of positional cloning Identificare gene conoscendo solo la sua posizione cromosomica approssimativa Enorme lavoro: clonare tutto il genoma in apposite librerie genomiche e screenarle nei soggetti affetti per identificare tutti i possibili geni contenuti nella regione candidata (> regione candidata, > difficoltà!!) : clonati solo ca 50 geni malattia. I primi geni clonati con questo sistema sono stati il gene (oggi lista geni candidati è ottenibile della Distrofia di Duchenne (DMD; 1987) e il gene dai database genomici) delle Fibrosi cistica (CFTR; 1989)

14 Identificazione di un gene mediante modelli animali Se viene identificato un gene nel topo come responsabile di un fenotipo simile a una patologia umana l'omologo umano di tale gene diviene candidato naturale per la patologia umana, anche se non è noto se malattia e gene mappano nella stessa localizzazione cromosomica

15 Clonaggio funzionale

16 CLONAGGIO FUNZIONALE Identificare il gene attraverso la sequenza, anche parziale, della proteina codificata creare cocktail dei possibili oligo codificanti tale sequenza (cercando di usare frammenti ricchi in aa codificati da 1 o 2 codoni Trp, Met, evitando Arg, Leu, Ser codificate da 6 codoni ciascuno) da usare come sonde per screenare library di cdna Oggi possibile confrontare al computer la sequenza della proteina con le sequenze dei geni identificati da HGP

17 Identificazione di geni responsabili di malattie mendeliane IERI OGGI HGP (Human Genome Project) & Exome sequencing (ri-sequenziamento regioni (es. Talassemie) (es. Fibrosi Cistica) (Gelehrter, Collins, Ginsburg; Genetica Medica; Masson 1999) codificanti)

18 Usare un Genome Browser per ottenere la lista di geni contenuti in una regione candidata Schermata del UCSC genome browser ( che mostra i geni inclusi in una regione di 500kb della banda 6p21.1 (esoni = barre verticali; freccie indicano direzione di trascrizione)

19 3. Confermare il gene candidato... Per dimostrare che il gene candidato sia il gene malattia occorre trovare mutazioni causali. Analisi della porzione codificante e delle regioni di splicing del gene candidato in pazienti e in controlli sani, non imparentati, per identificare mutazioni che possono verosimilmente alterare la funzione o l'espressione genica, che devono essere presenti nei pazienti e rare nei controlli sani Sequenza di gdna e se possibile di mrna/cdna per identificare mutazioni introniche (NB mutanti che riducono vitalità RNA possono sfuggire). Se le mutazioni sono rare, occorre analizzare un numero di controlli adeguato per poterne verificare l'effettiva presenza o assenza Studi funzionali in vitro o in modelli animali possono confermare il gene candidato e la patogenicità delle mutazioni identificate

20 4. Determinare la sequenza del gene candidato... Determinare la sequenza in basi e la struttura in esoni e introni del gene candidato Identificare una sequenza normale di riferimento STRUTTURA GENI EUCARIOTI

21 5. Dimostrare che il gene candidato è legato alla malattia Gene deve avere pattern espressione consistente con la malattia (espresso almeno n nei tessuti colpiti dalla patologia e precedentemente o nel momento in cui la patologia si manifesta es difetto tubo neurale gene deve essere espresso appena prima della chiusura del TN, 3a/4a settimana sviluppo embrionale nell'uomo)

22 6. Collegare il gene alla malattia Dimostrare per il gene una appropriata funzione, correlata alla malattia, non è sempre cosa ovvia Talvolta la funzione del gene è chiaramente collegabile alla malattia: Rodopsina e retinite pigmentosa Fibrillina e S. Marfan (difetto tessuto connettivo) Altre volte gene nuovo => riconoscimento di motivi proteici comuni, come domini transmembrana o d. tirosin-kinasici, aiuta a predire la possibile funzione della proteina Nuova funzione deve essere correlata a difetto malattia Canale ionico e sordità (noto che trasporto ionico nell'orecchio interno è critico per udito) Altre volte occorre uno sforzo immaginativo (vedi CF...)

23 Identificazione di mutazioni: le dimensioni del problema Genoma umano (aploide): Cromosoma medio: Gene medio: Mutazione minima: bp bp bp 1 bp

24 Metodi per l identificazione di mutazioni Ricerca ASPECIFICA di mutazione (ignota o nota) Sequenziamento del DNA Screening del gene (DGGE, DHPLC...)

25 Fonti DNA Il DNA può essere ottenuto da qualsiasi cellula nucleata dell'organismo VILLI CORIALI AMNIOCITI SALIVA SANGUE DNA CAPELLI COLTURE CELLULARI ALTRI TESSUTI MIDOLLO OSSEO PCR Reazione a Catena della Polimerasi DNA stampo datp, dctp, dgtp, dttp Taq polymerase, Mg++ Nuovo filamento DNA polimerasi Primer DNA stampo Primer Nuovo filamento

26 Analisi della Sequenza del DNA Sequenza Normale (esone 12, gene CFTR) 1885G>T; GAA>TAA Glu > Stop Mutazione: E585X

27 Analisi con gradiente denaturante (DGGE: Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) La Temperatura di melting (Tm) di una molecola di ALLELE NORMALE ALLELE MUTATO G A T DNA dipendente strettamente dalla sua sequenza. C Frammenti di DNA che differiscono ancheper un Denaturazione, mix, rinaturazione singolonucleotide hanno diversa Tm. Negli eterozigoti possono formarsi molecole ibride, costituite dall unione di un filamento normale e da un filamento mutato, che hanno Tm più bassa per la presenza dell appaiamento errato nel sito della G T MOLECOLE ETERODUPLICI A C G C MOLECOLE OMODUPLICI A T mutazione. Concentrazione crescente di denaturanti L elettroforesi in gradiente denaturante separa le molecole di DNA in funzione della diversa Tm. E così possibile identificare DNA normali e mutati perchè si arresteranno ad una diversa altezza nel gel ETERODUPLICI OMODUPLICI N/N N/M M/M GEL A GRADIENTE DENATURANTE

28 Analisi DGGE dell esone 19 del gene CFTR eteroduplici - omoduplici Mutato Normale Corsie 1, 2, 4, 8, 9: DNA che non presentano mutazioni in questo esone Corsie 3, 5, 7: DNA con mutazioni in questo esone (da caratterizzare con sequenziamento) Corsia 6: controllo positivo (eterozigote I1237V)

29 DHPLC: Denaturing High Performance Liquide Chromatography

30 Ricerca di mutazioni con DHPLC eteroduplici omoduplici eteroduplici omoduplici WT M

31 Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche 1) Identificare e sequenziare il gene malattia 2) Cercare le mutazioni nel gene 3) Stabilire quali mutazioni sono patologiche 4) Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni 5) Disegnare pannelli popolazione specifici 6) Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di interesse

32 Principali criteri per classificare una mutazione come causa di malattia: Correlazione con il fenotipo: la mutazione è presente negli affetti, molto rara o assente nella popolazione generale Studi funzionali, in-vitro o in-vivo, dimostrano che la mutazione causa alterazione o assenza della funzione codificata dal gene La mutazione causa una grave alterazione della struttura proteica (delezioni, inserzioni, stop, frameshift, alterazioni di splicing )

33 Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche 1) Identificare e sequenziare il gene malattia 2) Cercare le mutazioni nel gene 3) Identificare quali mutazioni sono patologiche 4) Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni 5) Disegnare pannelli di mutazioni popolazione-specifici 6) Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di interesse

34 Analisi della frequenza e della distribuzione geografica delle mutazioni Ricerca aspecifica delle mutazioni nei geni di almeno pazienti Analisi di pazienti appartenenti a popolazioni/gruppi etnici diversi Selezionare le mutazioni causa di malattia tra tutte quelle identificate Stabilire il pannello di mutazioni da analizzare in modo da coprire la maggior percentuale possibile di alleli patologici in ogni popolazione/gruppo etnico

35 Pannello Mutazioni CF per Veneto e Sardegna Mutazione F508del R1162X T338I G542X 2183AA/G N1303K G1244E 711+5G/A G/A altre TOT Sardegna n. % Veneto n % / /225 90

36 Pannello Mutazioni CF per Veneto e Trentino AA: analisi gene CFTR in 180 pazienti (360 geni) Mutazione Frequenza % Freq. Cumulativa % F508del 47,6 47,6 R1162X 9,8 57,3 2183AA->G 9,3 66,7 N1303K 4,0 70,7 G542X, 711+5G->A 2,7 76, G->A 2,2 78,2 G85E, R553X, altre2 1,3 83,6 0,9 e 0,4 86,7 Altre 5 Totale (16 mutazioni) 86,7 Hum. Genet. 1995; 95:397

37 Le tappe dell'analisi molecolare per le malattie genetiche 1) Identificare e sequenziare il gene malattia 2) Cercare le mutazioni nel gene 3) Identificare quali mutazioni sono patologiche 4) Determinare se esiste una distribuzione geografica/etnica delle mutazioni 5) Disegnare pannelli popolazione specifici 6) Selezionare i metodi di analisi più adatti alla ricerca delle mutazioni di interesse

38 Metodi per l identificazione di mutazioni Analisi SPECIFICA di una mutazione nota Restrizione Enzimatica OLA RDB/ASO

39 Analisi di Restrizione (RE) ALLELE T (esempio, NORMALE) ALLELE G (esempio, MUTATO) EcoR I EcoR I TACGTAGAGAATTCTCATCG TACGTAGAG TACGTAGAGAAGTCTCATCG AATTCTCATCG omozigote TT eterozigote TG omozigote GG

40 Esempi di Analisi di Restrizione M M bp 165 bp Analisi della mutazione N1303K (gene CFTR: 4041C>G) la mutazione crea un sito di restrizione per l enzima DdeI (CTNA G) (+ presenza della mutazione; - mutazione assente; M=marcatore peso molecolare)

41 REVERSE DOT BLOT: ibridazione inversa degli acidi nucleici DNA N (normale) sonda N DNA M (mutato) sonda M 1 sonda N sonda M 2 N a C g t G c a T g t A c sonda N M 3 sonda M omozigote MM eterzigote NM omozigote NN

42 RDB MULTIPLO analisi mutazioni Fibrosi Cistica (gene CFTR) STRIP A Normale F508del G542X 394delTT eteroz. R117H S1251N STRIP B sonde mutate sonde mutate sonde normali sonde normali

43 Test di legame degli oligonucleotidi (OLA, Oligonucleotide Ligation Assay) sonda mutata sonda normale Marcatore fluorescente A C sonda comune G T DNA mutato DNA normale sonda comune sonda normale sonda mutata sonda comune DNA mutato DNA normale DNA-Ligasi Prodotto OLA normale DNA-Ligasi Prodotto OLA normale Prodotto OLA mutato Prodotto OLA mutato normale dimensioni crescenti eterozigote dimensioni crescenti mutato dimensioni crescenti

44 OLA: analisi multipla mutazioni Fibrosi Cistica F508del omozigote eterozigote composto G85E / W1282X

45 CRITERI DI SCELTA Malattia in oggetto Mutazioni causali della patologia in questione Affidabilità del metodo o del kit commerciale specificità, sensibilità, accuratezza, riproducibilità Tipo di test richiesto (prenatale, portatore, ecc) Strumentazione disponibile nel laboratorio Rapporto costi/benefici test economico Rapidità, laboriosità, semplicità Validità clinica del test (capacità di predire clinical outcome: dipende da sensibilità test, Copertura del pannello mutazioni, penetranza mutazioni) Test specifici o aspecifici? Nuove tecnologie Automatizzabile /uso strumentazione costosa Adattabile a molte mutazioni, possibilità di multiplex

46 FONTI DI ERRORE Errore dell operatore Scambi di campioni Falsa paternità Presenza di altre mutazioni/polimorfismi nell amplificato esaminato Poca specificità del metodo Condizioni di analisi poco specifiche Regioni omologhe, pseudogeni Nuove mutazioni Eterogeneità genetica Scelta mutazioni da analizzare

47 Diagnosi di malattie genetiche mediante analisi del DNA a) Analisi di mutazioni note nel soggetto (RE; RDB/ASO; OLA): Analisi diretta/specifica delle mutazioni Deve essere nota la sequenza del gene Devono essere nota l alterazione molecolare delle mutazioni da analizzare Deve essere noto quali mutazioni geniche sono causa di malattia Caratteristiche di un buon sistema di analisi: rapido, economico, multiplo b) Ricerca di mutazioni in un gene (Sequenziamento del DNA, DGGE, DHPLC): Deve essere nota la sequenza del gene Identifica sia mutazioni nuove che note; patologiche che non patologiche Solo il sequenziamento consente di caratterizzare il difetto molecolare Consentono analisi più rapida di un gene quando si hanno molti individui in esame Screening di popolazione: identifica quali e quante mutazioni sono presenti c) Analisi di Linkage (identificazione nuovi geni, diagnosi indiretta di malattia) Deve essere nota la localizzazione cromosomica del gene Deve essere disponibile la famiglia del probando e il DNA di almeno un familiare prossimo che sia affetto Devono essere disponibili marcatori informativi molto vicini al gene interessat o