Luce di Sincrotrone e Biocristallografia

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1 Luce di Sincrotrone e Biocristallografia Marco Nardini Dip. Scienze Biomolecolari e Biotecnologie CNR-INFM Università di Milano

2 Cos è la Biocristallografia? Tecnica sperimentale basata sul fatto che i raggi X sono diffratti dai cristalli di macromolecole Scopo della Biocristallografia Determinazione della struttura 3D di una macromolecola biologica a risoluzione atomica (ovvero, determinare la posizione x, y, z di ciascun atomo della macromolecola) Oggetto dello studio Sistema reale (non modello) DNA, RNA, proteine, e loro complessi (virus, ribosoma, ) Ribosoma atomi di proteina atomi di RNA

3 Eucarioti citoplasma nucleo DNA Procarioti DNA esone introne mrna TRASCRIZIONE RNA TRASCRIZIONE proteina TRADUZIONE mrna proteina TRADUZIONE ribosoma mrna proteina

4 Le proteine Catalizzatori: pressochè nessuna reazione chimica, negli esseri viventi, avviene senza il controllo di catalizzatori detti enzimi. Gli enzimi sono proteine che aumentano la velocità delle reazioni di almeno un fattore 10 6, e regolano le trasformazioni biochimiche che altrimenti non sarebbero sufficientemente veloci per mantenere la vita. Veicoli di trasporto: molte piccole molecole e/o ioni sono trasportati da proteine: per esempio l ossigeno nel sangue è trasportato dall emoglobina. Canali di trasporto: alcune proteine controllano il passaggio di molecole attraverso le membrane delle cellule e degli organelli.

5 Le proteine Regolatori di funzione: molte proteine possono interagire in maniera estremamente selettiva con altre macromolecole biologiche regolandone la funzionalità. Per esempio le proteine controllano l espressione dei geni. Anticorpi: sono proteine che difendono il nostro organismo da agenti esterni potenzialmente pericolosi. Gli anticorpi sono altamente specifici nel riconoscere come estranei virus, batteri e cellule di altri organismi. Funzione meccanico-strutturale: le proteine sono i principali costituenti dei muscoli (actina, miosina). La pelle e le ossa sono costituite dalla proteina fibrosa collagene, i capelli dalla cheratina, la seta dalla fibrina.

6 Le proteine Ormoni: sono proteine che trasmettono informazioni fra cellule e organi specifici. Per esempio, l insulina. Sistemi recettoriali: la risposta delle cellule nervose a stimoli specifici è mediata da proteine dette recettori.

7 Utilità della Biocristallografia Le strutture 3D di macromolecole consentono di capire i processi biologici e di eseguire studi funzionali a livello di risoluzione atomica (Å) interazioni fra macromolecole studi strutturali-funzionali su enzimi razionalizzazione del drug design sviluppo di farmaci nuovi e più efficaci applicazioni biotecnologiche

8 Le proteine sono polimeri lineari senza ramificazioni costituiti da 20 unità base, gli aminoacidi Catena laterale (20 tipi) Gruppo amminico Gruppo carbossilico Atomo di idrogeno 1 Alanina Ala A R = CH 3 2 Aspartico Asp D R = CH 2 COO - 3 Cisteina Cys C R = CH 2 SH 4 Glicina Gly G R = H Valina Val V R = CH CH 3 CH 3

9 Legame peptidico Catena polipeptidica R i+1 R n R i R i+2 Struttura primaria PRPLVALLDGRDETVEMPILKDVA Le proteine sono molecole che consistono di una o più catene polipeptidiche

10 Struttura secondaria α elica Foglietto β

11 Struttura terziaria C O N S

12 Struttura quaternaria

13 Perchè i raggi X? L uso di radiazione elettromagnetica per visualizzare oggetti richiede che la radiazione abbia una λ paragonabile ai più piccoli dettagli che si vogliono risolvere λ raggi X ~10-10 m prossima alla distanza tra atomi di carbonio legati covalentemente Perchè i cristalli? Un cristallo è formato da un enorme numero di molecole ( ) nella stessa orientazione, cosicchè le onde diffratte si sommano in fase e rendono il segnale di diffrazione totale di intensità misurabile rispetto al rumore di fondo

14 Descrizione dell esperimento cristallografico cristallizzazione raccolta dati di intensità di diffrazione problema della fase Radiazione di Sincrotrone Scattering Anomalo densità elettronica della molecola costruzione del modello molecolare nella densità elettronica sperimentale raffinamento e validazione Protein Data Bank e Structural Genomics

15 Cristalli proteici: molecola unità di cella unità asimmetrica elemento di simmetria cristallografica cristallo volume 0.1 mm 3 periodicità del reticolo cristallino > 100 Å contenuto solvente 30% - 80% v/v bassa stabilità meccanica (E stab. < 10 kcal/mol)

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17 Cristallizzazione: procedura trial and error in cui la macromolecola viene lentamente precipitata mediante aggiunta di reagenti che diminuiscono la sua solubilità Variabili chimico-fisiche forza ionica ph temperatura concentrazione macromolecola concentrazione reagenti costante dielettrica del solvente gravità

18 Microgravità: assenza di sedimentazione e di movimenti convettivi (mezzo di crescita più omogeneo) miglior grado di ordine dei cristalli riduzione nucleazione secondaria minore incorporazione di contaminanti nel reticolo cristallino

19 Raccolta dati di intensità di diffrazione:

20 Raccolta dati di intensità di diffrazione: raggi X 2θ I hkl h = 2, k = 1, l = 0 h = 1, k = 3, l = 0 cristallo detector 2d hkl sinθ = nλ (equazione di Bragg)

21 Setup sperimentale in house (λ= Å) : Raggi X Azoto Cristallo Cristallo

22 Setup sperimentale al sincrotrone: λ = Å ( kev) 9.6 < E < 14.5 kev Beamsize µm d max = 0.97 Å

23 Problema della fase:? I hkl ρ(x,y,z)

24 Problema della fase: I hkl F hkl 2 Proprietà dell atomo Proprietà strutturale (posizione) N atomi F hkl = Σ f j exp [2πi (hx j + ky j + lz j )] = F hkl exp (iα hkl ) j= 1 Fattore di struttura Densità elettronica F hkl = ρ(x,y,z) exp [2πi(hx+ky+lz)] dv Vcell 1 ρ(x,y,z) = Σ F hkl exp [-2πi(hx+ky+lz-α hkl )] V hkl π i α P F f 1 f 2 f 3 r non misurabile sperimentalmente

25 Problema della fase: Atomi pesanti Pt Hg MIR (Multiple Isomorphous Replacement) S/MIRAS (Single/Multiple IR with Anomalous Signal) MAD (Multiple Anomalous Dispersion) Sincrotrone Molecular Replacement (MR)

26 Fasatura mediante atomi pesanti: i N atomi F hkl = Σ f j exp [2πi (hx j + ky j + lz j )] = F hkl exp (iα hkl ) j= 1 π α P F P r atomi pesanti cristallo nativo H cristallo derivato (I hkl ) P (I hkl ) PH

27 Fasatura mediante atomi pesanti: MIR i F PH = F P + F H α H F PH F H π α PH α P F P F P, F PH (misurati da diffrazione: I F 2 ) r F H, α H (calcolati da posizione atomo pesante sintesi di Patterson) Funzione di Patterson 1 V + ρ P (u, v, w) = ΣΣΣ F hkl 2 cos 2π(hu+kv+lw) h=- k l ρ P (u, v, w) = ρ(x, y, z) ρ(x+u, y+v, z+w) dv 0 0 0

28 La funzione di Patterson può essere vista come una mappa vettoriale in cui compaiono tutti i vettori inter-atomici spiccati a partire dall origine. Tra gli N 2 picchi nello spazio Patterson, N sono posizionati nell origine, mentre N(N-1) sono fuori dall origine. Spazio Patterson N 2 picchi (N nell origine) Z A Z B

29 Patterson & metodo degli Atomi Pesanti E possibile utilizzare la deconvoluzione della funzione di Patterson per determinare la posizione di alcuni atomi presenti nei cristalli macromolecolari: gli atomi pesanti. Questo perchè gli atomi pesanti hanno numero atomico significativamente più alto degli atomi presenti normalmente nelle proteine, e quindi i picchi di Patterson corrispondenti alle loro distanze interatomiche saranno particolarmente intensi. Inoltre il numero di atomi pesanti legati alla proteina di cui determinare la posizione è piccolo.

30 Fasatura mediante atomi pesanti: MIR i i Protein F PH F H π F P r F P -F H r F PH Protein + Heavy atom 2 soluzioni per la fase di F P

31 Fasatura mediante atomi pesanti: MIR i i π F P F H2 F PH2 r π F PH2 -F H2 α P -F H F P F P r F PH Protein + Heavy atom 2

32 Nei casi reali, un atomo pesante può variare di poco l ampiezza del fattore di struttura. Inoltre, il calcolo di FH è spesso molto approssimato sia a causa di una deconvoluzione approssimata della differenza di Patterson isomorfa, sia a causa di fenomeni di non-isomorfismo. Il risultato di queste approssimazioni sperimentali e di calcolo è che i cerchi di Harker non si intersecano in un singolo punto e si ha una certa incertezza nella assegnazione della fase.

33 Praticamente, maggiore è il numero dei derivati di cui si raccolgono dati di diffrazione isomorfi alla nativa, maggiore è la probabilità di ottenere una stima ragionevolmente accurata da attribuire ai fattori di struttura. La ρ(x,y,z) migliore non è quella che associa a ciascun F P hkl (cioè F hkl ) la fase α P più probabile α(best) hkl + 1 ρ(x,y,z) = Σ Σ Σ m [F hkl e -α(best) hkl ] e -2πi(hx+ky+lz) V h=- k l m = figura di merito 0 m 1

34 Scattering Anomalo : Raggio X (λ absorption edge) H cristallo derivato f anomalo (θ,λ) = f 0 (θ)+ f (λ) + i f (λ) f 0 f f " f 0 f ' L ampiezza di scattering f anomalo contiene un termine reale, f 0, relativo alla diffusione Thompson da elettrone libero e funzione del solo angolo di diffrazione θ, e due termini f, f dipendenti dalla lunghezza d onda della radiazione incidente ma non dall angolo di diffrazione θ.

35 Fasatura mediante atomi pesanti: Scattering anomalo f(θ,λ) = f 0 (θ ) + f '(λ) + if "(λ) ƒ (E) = ƒ (Ε) = mc 4πe 2 ħ Eµ a (E) 2 π Ε ƒ (Ε ) (Ε 2 Ε 2 ) dε non vale più la legge di Friedel F hkl = F hkl, φ hkl =-φ hkl I hkl I hkl

36 Fasatura mediante atomi pesanti: SIRAS i i F H+ (+) hkl F PH+ F H+ F PH+ F H F H- π F PH F H F P+ π F PH F P F PH- F P-FH r r (-) hkl F PH F PH- F H-

37 Fasatura mediante atomi pesanti: SIRAS i F H+ i F PH+ F H F H- π i F PH F P F PH- r F PH- π F H+ F H- F P r F H+ F H+ F H F H- F PH+ π F PH F P F H- r

38 Fasatura mediante atomi pesanti: SIRAS In media, le differenze isomorfe (F PH F P ) sono maggiori rispetto alle differenze anomale (F PH+ F PH- ) (F PH F P ) deriva da misure su cristalli diversi errori di non isomorfismo, non presenti in (F PH+ F PH- )

39 Fasatura mediante atomi pesanti: MAD f(λ) = f 0 + f(λ) + if "(λ) λ1) fha il suo minimo (massima differenza dispersiva) F λ (hkl) = F λ1 (h) - F λ3 (h) F dove F λ (h) = λ (h) + F λ (-h) 2 λ2) f " ha il suo massimo (massima differenza coppie di Bijvoet) λ3 λ3 λ3) remota, dove f e f " sono piccole (>1000 ev da λ2)

40 Fasatura mediante atomi pesanti: MAD Atomi pesanti - soaking o cocristallizzazione - incorporazione naturale Se Se-metionina Fe Un solo cristallo è richiesto Radiazione X a λ variabile (λ stabile) Crio-cristallografia (T 100 K)

41 Molecular Replacement: Proteina I hkl F hkl 2 Prerequisito: modello proteina modello atomico da cui possono essere calcolate fasi approssimate Densità elettronica 1 ρ(x,y,z) = Σ F hkl exp [-2πi(hx+ky+lz-α hkl )] V hkl fasi approssimate

42 Molecular Replacement: determinazione di un modello adeguato (allineamento di sequenze) Proteina...YKTQAGKTVDYINAAIGG----SADGAGL.. Modello...YQTQASKTVDYITAALAGSRNVSADAAGL.. * *** ****** ** * *** *** l omologia strutturale correla col livello di identità in sequenza (MR se almeno 30% identità)

43 Molecular Replacement: Creazione del cristallo virtuale e posizionamento (uso della funzione di Patterson) in esso del modello tratto dal PDB (eventualmente modificato sulla base dell allineamento di sequenze) Calcolo dei fattori di struttura derivati dal modello F hkl in modulo e fase ( F hkl e α hkl ) Calcolo della densità elettronica approssimata usando i fattori di struttura ibridi F hkl = F hkl e iαhkl ) 1 V hkl oss calc ρ(x,y,z) = Σ ( F hkl e -iα hkl ) e -2πi(hx+ky+lz)

44 Molecular Replacement: proteina omologa modello proteina stessa proteina in forma nativa (studi di mutanti o complessi) modello mutante complesso parte di una proteina multidominio modello I III II

45 Cristalli Data collection Fasi approssimate MR, MIRAS, SIRAS, MAD ρ (x,y,z) Raffinamento Modello molecolare Validazione e PDB

46 Costruzione modello atomico - catena principale (scheletro C α ) - catene laterali - molecole solvente Raffinamento cristallografico processo iterativo di correzione del modello tale da minimizzare: C = Q +ku Q = Σ w hkl (F hkl,o F hkl,c ) 2 hkl angoli di legame U = Σ 1/2 k b,j (b j,c b j,o ) 2 + Σ 1/2 k τ,j (τ j,c τ j,o ) 2 + j lunghezza legami j + Σ k φ [1 + cos (nφ j δ)] + Σ [(Ar -12 ) ij + (Br -6 ) ij ] j angoli di torsione van der Waals ij

47 Validazione modello Σ F - accordo fra modello e dati sperimentali ( R-factor = obs - F calc ) Σ F obs - stereochimica delle strutture macromolecolari - contatti/interazioni fra residui vicini spazialmente File formato PDB CRYST P ATOM 1 CB SER ATOM 2 OG SER ATOM 3 C SER ATOM 4 O SER ATOM 5 N SER ATOM 6 CA SER ATOM 7 N THR ATOM 8 CA THR ATOM 9 CB THR ATOM 10 OG1 THR ATOM 11 CG2 THR ATOM 12 C THR ATOM 13 O THR ATOM 2166 HOH WAT ATOM 2167 HOH WAT ATOM 2168 HOH WAT END

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50 Structural Genomics Obiettivo: Target proteici: Mezzi tecnici: Finalità: - determinare il maggior numero possibile di strutture proteiche in high throughput mode - sviluppo di nuove tecnologie - disseminazione di conoscenza (training) - tutti gli open reading frames che codificano i geni presenti nei genomi di vari organismi - proteine di specifici percorsi metabolici - proteine associate a specifici stati patologici - automazione di cristallizzazione e raccolta dati - radiazione di sincrotrone (MAD, Se-Met) - completo campionamento di tutti i fold proteici - funzione sulla base di omologie strutturali non identificabili in base alla sequenza primaria (applicazioni biomedico-tecnologiche)

51 Structural Genomics Structural Proteomics In Europe - SPINE 5th EC Framework Programme Quality of Life and Management of Living Resources Project n QLG2-CT core labs + vari laboratori satellite Inizio: 1 ottobre 2003 Obiettivo: 50 strutture nel primo anno, 500 alla fine dei 3 anni Targets: - patogeni batterici (M. tuberculosis) - patogeni virali (Herpesviridae, enterovirus, epatite C,..) - proteine umane e loro complessi coinvolti in cancro e malattie neuro-degenerative

52 Structural Genomics Vizier VIral enzymes InvolvEd in Replication is funded by the 6th Framework Programme of the European Commission under the reference LSHG-CT ground-breaking impact on the identification of potential new drug targets against RNA viruses through comprehensive structural characterization of the replicative machinery (polymerases, helicases, capping enzymes, NTPases, and proteases as well as ancillary replicative proteins) of a carefully selected and diverse set of viruses (including strains of medical interest). - RNA viruses include more than 350 different major human pathogens and most of the etiological agents of emerging diseases: viruses of gastroenteritis, measles, influenza, dengue fever, enteroviruses and encephalitis, hepatitis C virus. - the SARS outbreak has dramatically demonstrated how high could be the economic cost of an epidemic caused by an emerging virus. - threat of bio-terrorism, which lists some deadly RNA viruses in its arsenal.

53 VIZIER project is structured into 5 interacting scientific sections: (i) bioinformatics, for genome annotation, target selection and data integration; (ii) virus production and genome sequencing; (iii) HTP protein production ( targets); (iv) HTP crystallization and structural determination and (v) target validation, to assess the function of enzymes and design strategies for virus inhibition. New tools for protein production and distributed X-ray crystallography will be developed and validated.

54 Robot per la cristallizzazione