Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici. Alessandra Pesce Dipartimento di Fisica Università degli Studi di Genova

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1 Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici Alessandra Pesce Dipartimento di Fisica Università degli Studi di Genova

2 Struttura 3D delle proteine Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici

3 Gli amminoacidi Le proteine sono polimeri lineari senza ramificazioni costituiti da 20 unità base, gli amminoacidi. Catena laterale (20 tipi) Gruppo amminico Gruppo carbossilico Atomo di idrogeno Si possono quindi distinguere 3 gruppi di amminoacidi: gruppo R non polare gruppo R polare non carico gruppo R polare carico

4 Il legame peptidico Gli amminoacidi polimerizzano durante la sintesi delle proteine mediante la formazione di legami peptidici. Le proteine sono molecole che consistono di una o più catene polipeptidiche. R i+1 R i+3 R i+5 R i R i+2 R i+4 R i+6

5 Le proteine: livelli di organizzazione strutturale Struttura supersecondaria Domini

6 Struttura primaria..prplvalldgrdetvempilkdvatvafcdaqstqeihe.. Si chiama struttura primaria di una proteina la sequenza degli amminoacidi legati covalentemente la legami peptidici. I 20 amminoacidi possono essere paragonati alle diverse lettere che, combinate in milioni di modi differenti, creano le "parole" e quindi un intero "linguaggio" proteico. In teoria, nel caso delle proteine, una piccola proteina è costituita da una singola catena polipeptidica di circa 100 residui, per cui si avranno = possibili catene polipeptidiche diverse! A seconda della sequenza con cui vengono combinati gli amminoacidi, le diverse proteine che ne risultano svolgono una specifica funzione.

7 Struttura primaria..prplvalldgrdetvempilkdvatvafcdaqstqeihe.. Il numero di amminoacidi varia molto da proteina a proteina (nella maggior parte dei casi compreso fra 100 e 1000) - varietà dovuta al rapporto quantitativo tra i vari amminoacidi ( composizione amminoacidica ) - varietà dovuta all ordine degli amminoacidi lungo la catena ( sequenza )

8 Struttura secondaria..prplvalldgrdetvempilkdvatvafcdaqstqeihe.. filamento β α elica Le strutture secondarie sono disposizioni regolari della catena polipeptidica principale, che vengono classificate senza fare riferimento al tipo di catena laterale degli amminoacidi. Esse sono stabilizzate da interazioni non covalenti. Circa il 70-80% degli amminoacidi delle proteine globulari assume la conformazione regolare tipica di una struttura secondaria. I segmenti di catena polipeptidica che non sono in struttura secondaria assumono la conformazione chiamata loop o random coil, struttura non ripetitiva né regolare,

9 Struttura primaria Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici Struttura secondaria R j+3 R i+3 R R i+2 j+2 R j+1 R i+1 R j R i α elica foglietto β

10 Struttura terziaria Struttura quaternaria

11 La struttura quaternaria Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici

12 La struttura quaternaria Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici

13 Le proteine di membrana globulari fibrose

14 Struttura 3D del Ribosoma Eucarioti citoplasma nucleo DNA Procarioti DNA esone introne mrna TRASCRIZIONE RNA TRASCRIZIONE proteina TRADUZIONE mrna ribosoma mrna proteina TRADUZIONE proteina

15 Struttura 3D del ribosoma ribosoma mrna proteina

16 Biocristallografia a raggi X - metodologia sperimentale in grado di determinare la disposizione degli atomi di una macromolecola biologica presenti in un cristallo analizzando come i raggi X sono diffratti dal cristallo - più precisamente, la biocristallografia a raggi X permette di risalire alla densità elettronica all interno del cristallo, da cui si possono dedurre le posizioni atomiche della macromolecola - le strutture 3D delle macromolecole biologiche permettono di capire come avvengono i processi biologici e le interazioni a livello atomico (cioè come una particolare macromolecola svolge la sua funzione)

17 Applicazioni della Biocristallografia Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici determinazione di strutture non ancora note analisi di mobilità e variazioni conformazionali interazioni proteina-ligando e proteina-proteina (conformazione di legame biologicamente rilevante) studi di meccanismi enzimatici (complessi con cofattori, inibitori, prodotti, analoghi dello stato di transizione,...) drug-design razionale applicazioni biotecnologiche

18 La struttura a doppia elica del DNA ha compiuto 60 anni!

19 Passato, presente e futuro Natura elicoidale della struttura del DNA struttura ad elica spaziatura di 3.4 Å diffrattogramma dei raggi X di fibre di DNA (1953)

20 Passato, presente e futuro La prima struttura proteica determinata con metodi cristallografici è stata la mioglobina di capodoglio (1958) Wilkins Perutz Crick Watson Kendrew Premio Nobel per la Chimica 1962 a M. Perutz (emoglobina) e J. Kendrew (mioglobina) per i loro studi sulla struttura di proteine globulari

21 Passato, presente e futuro

22 Passato, presente e futuro ad oggi la biocristallografia a raggi X è la più prolifica disciplina nell area della biologia strutturale PDB Current Holdings Breakdown Exp. Method Proteins Nucleic Acids Protein/NA Complexes Other Total X-RAY NMR ELECTRON MICROSCOPY HYBRID other Total ~90% delle strutture 3D depositate nella Protein Data Bank (PDB; sono strutture determinate mediante biocristallografia a raggi X

23 Passato, presente e futuro 2010 Genomica strutturale 2000 Luce di sincrotrone Criocristallografia 1990 Crescita del numero di strutture di macromolecole biologiche determinate con la cristallografia a raggi X (a partire dal 1976 ad oggi)

24 Passato, presente e futuro Biologia strutturale determinazione di strutture 3D di specifiche proteine o gruppi di proteine Genomica strutturale determinazione di strutture 3D su scala genomica (es.: genoma umano, di patogeni, ecc.). al contrario della biologia strutturale classica, spesso (ma non sempre) la determinazione della struttura avviene prima della caratterizzazione funzionale della proteina determinazione della funzione sulla base della struttura determinazione di strutture 3D in modo high throughput clonaggio, espressione, purificazione, cristallizzazione, determinazione struttura 3D su larga scala (automazione, radiazione sincrotrone, ecc.)

25 Biocristallografia a raggi X Perché i raggi X? l uso di radiazione elettromagnetica per visualizzare oggetti richiede che la radiazione abbia una lunghezza d onda λ paragonabile ai più piccoli dettagli che si vogliono risolvere R i+1 R n R i R i+2 λ raggi X ~10-10 m (1 Å) ~ distanza tra atomi legati covalentemente

26 Biocristallografia a raggi X Perché i cristalli? un cristallo è formato da un enorme numero di molecole ( ) nella stessa orientazione, cosicché le onde diffratte si sommano in fase e rendono il segnale di diffrazione totale di intensità misurabile rispetto al rumore di fondo

27 Esperimento cristallografico 1) cristallizzazione 2) diffrazione

28 Esperimento cristallografico 3) calcolo densità elettronica 4) costruzione struttura e suo raffinamento 5) validazione e deposizione delle coordinate atomiche della struttura nella banca dati PDB

29 Cristalli proteici elemento di simmetria cristallografica unità asimmetrica cella elementare dimensioni ciascun lato: decine-centinaia µm periodicità del reticolo cristallino > 100 Å contenuto solvente 30% - 80% v/v interazioni non covalenti bassa stabilità meccanica struttura proteina nel cristallo = struttura proteina in soluzione Un cristallo reale presenta una certa mosaicità, indicativa del fatto che le celle elementari non sono perfettamente allineate tra di loro, ma possono assumere una piccola diversa orientazione (max 1-2 ).

30 Cristallizzazione procedura empirica in cui una proteina in soluzione viene lentamente fatta precipitare (utilizzando una soluzione precipitante) formando un precipitato cristallino (non amorfo) diminuzione della solubilità della proteina portare la soluzione proteica in condizioni di supersaturazione (nucleazione spontanea)

31 Metodi di cristallizzazione il metodo più utilizzato per la cristallizzazione di proteine è il metodo della diffusione di vapore C PROT proteina soluzione precipitante supersaturazione [ppt] goccia = [ppt] sol prec /2 hanging drop (goccia sospesa) N soluzione precipitante Tempi per ottenere cristalli? sottosaturazione sovrasaturazione (C) C PREC [ppt] goccia = [ppt] sol prec /2 sitting drop (goccia seduta) Variabili chimico-fisiche che influenzano la solubilità della proteina forza ionica (I = ½ Σ i c i z i 2 c = conc. ioni, z = carica ioni) ph temperatura costante dielettrica del solvente concentrazione macromolecola e concentrazione reagenti

32 Biocristallografia Biocristallografia a raggi X Cristallizzazione Proteine integrali di membrana - le proteine integrali di membrana presentano sulla superficie molte zone idrofobiche e per questo non sono solubili in soluzioni acquose - proteine solubilizzate in detergenti (che mimano i lipidi di membrana interagendo con zone superficiali idrofobiche della proteina) - stessi principi di cristallizzazione delle proteine globulari solubili in solventi acquosi - l entità da cristallizzare è proteina + detergente

33 Cristallizzazione Microgravità assenza di sedimentazione e di movimenti convettivi (mezzo di crescita più omogeneo) - miglior grado di ordine dei cristalli - riduzione nucleazione secondaria - minore incorporazione di contaminanti nel reticolo cristallino

34 Consigli utili Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici

35 Consigli utili Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici

36 Biocristallografia Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici Simmetrie cristallografiche Simmetrie cristalline: assi di rotazione (di ordine n = 1, 2, 3, 4, 6) asse di rotazione di ordine 2 asse di rotazione di ordine 3 asse di rotazione di ordine asse di rotazione di ordine 3 Rotazione molecola: 360 /2 = 180 Rotazione molecola : 360 /3 = 120

37 Biocristallografia Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici Simmetrie cristallografiche Simmetrie cristalline piano di riflessione y elicogira (rotazione + traslazione) asse di rotazione di ordine 2 asse di rotazione di ordine 3 x centro di inversione

38 Simmetrie cristallografiche Gruppo spaziale: coesistenza di elementi di simmetria per organizzare la materia in maniera coerente nello spazio. In totale i gruppi spaziali sono 230. Non tutti i 230 gruppi spaziali sono permessi per i cristalli di macromolecole biologiche. Gli unici gruppi spaziali ammessi per cristalli proteici sono quelli esclusivamente con assi di rotazione o elicogire. solo 65 gruppi spaziali (quelli che non cambiano la chiralità degli amminoacidi) sono possibili per le proteine.

39 Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici Raccolta dati di diffrazione Generatore di raggi X Tubo fisso Anodo rotante Anodo di rame generazione raggi X di λ = Å

40 Raccolta dati di diffrazione Generatore di raggi X: setup sperimentale Raggi X Azoto Cristallo Cristallo

41 Raccolta dati di diffrazione Sincrotrone: struttura circolare con anello di decine/centinaia di metri di diametro European Synchrotron Radiaton Facility (ESRF), Grenoble - circolazione di elettroni (o positroni) a velocità relativistiche; - energie delle particelle dell ordine del miliardo di ev (ESRF: 6 GeV); (circonferenza = 844m, E = 6GeV) - bending magnet per guidare le particelle sulla loro orbita; - emissione radiazione, con λ comprese tra raggi γ e visibile, in direzione tangenziale all orbita delle particelle; - selezione raggi X di opportuna λ con un monocromatore.

42 Raccolta dati di diffrazione Sincrotrone: setup sperimentale λ = Å ( kev); 9.6 kev < E < 14.5 kev; beamsize mm; d max = 0.97 Å

43 Raccolta dati di diffrazione Vantaggi utilizzo luce di sincrotrone Raggi X ad elevata intensità - intensità volte maggiori dei raggi X generati con l anodo rotante - raccolta dati su cristalli piccoli oppure di grandi complessi molecolari - tempi ridotti delle raccolte dati (minuti/ore rispetto a giorni) λ variabile - scattering anomalo

44 Raccolta dati di diffrazione h k l I σ eccetera...

45 Il problema della fase I hkl = k λ 3 F hkl 2 I 0 V crist /V 2 cell il fattore di struttura F hkl è un vettore che rappresenta in modulo (F hkl ) e fase (φ hkl ) l onda diffratta F hkl può essere espresso come somma degli N contributi dei singoli atomi j- esimi presenti nella cella cristallina N atomi F hkl = Σ f j exp [2πi (hx j + ky j + lz j )] = F hkl exp (iα hkl ) j = 1 proprietà dell atomo proprietà strutturale (posizione) il fattore di scattering atomico f j dipende dal numero di elettroni presenti nell atomo j non misurabile sperimentalmente Densità elettronica 1 ρ(x,y,z) = Σ F hkl exp (iα hkl ) exp [-2πi(hx+ky+lz)] V hkl

46 Problema della fase I hkl = k λ 3 F hkl 2 I 0 V crist /V 2 cell N atomi F hkl = Σ f j exp [2πi (hx j + ky j + lz j )] = F hkl exp (iα hkl ) j = 1 1 ρ(x,y,z) = Σ F hkl exp (iα hkl ) exp [-2πi(hx+ky+lz)] V hkl?

47 Soluzione del problema della fase I hkl = k λ 3 F hkl 2 I 0 V crist /V 2 cell N atomi F hkl = Σ f j exp [2πi (hx j + ky j + lz j )] = F hkl exp (iα hkl ) j = 1 1 ρ(x,y,z) = Σ F hkl exp (iα hkl ) exp [-2πi(hx+ky+lz)] V hkl a) metodo delle Sostituzioni Molecolari (Molecular Replacement) Prerequisito: struttura 3D (identificata sulla base di identità di sequenza) da cui possono essere calcolate fasi approssimate α hkl b) metodo delle Sostituzioni Isomorfe (Atomi Pesanti) Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici legame specifico alla proteina di atomi pesanti (Z molto superiore a quello di C, O, N, S). Tipicamente si usano Hg, Pt, U identificazione loro posizione nella cella elementare del cristallo calcolo fasi approssimate α hkl

48 Densità elettronica Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici

49 Costruzione del modello atomico catena polipeptidica principale catene laterali molecole solvente, ligandi, ecc. Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici

50 Raffinamento cristallografico Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici processo iterativo di aggiustamento delle coordinate degli atomi della struttura in modo tale che ci sia il miglior accordo possibile tra i fattori di struttura calcolati a partire dalla struttura costruita e quelli osservati sperimentalmente. La funzione da minimizzare è: C = Q + ku dove Q = Σ w hkl (F hkl,o F hkl,c ) 2 hkl angoli di legame U = Σ 1/2 k b,j (b j,c b j,o ) 2 + Σ 1/2 k τ,j (τ j,c τ j,o ) 2 + j j j lunghezza legami + Σ k φ [1 + cos (nφ j δ)] + Σ [(Br -12 ) ij + (Ar -6 ) ij ] j ij j angoli di torsione van der Waals

51 Raffinamento cristallografico Validazione struttura - accordo fra struttura 3D costruita e dati sperimentali: fattore R e R-free Σ hkl F hkl oss - F hkl calc R = ( 100) Σ hkl F hkl oss - stereochimica della struttura: Ramachandran plot

52 Il procedimento biocristallografico Biologia in 3D: proteine ed acidi nucleici Cristalli Diffrazione Fasi approssimate: Molecular Replacement Atomi Pesanti ρ (x,y,z) Raffinamento Struttura 3D Validazione e PDB

53 Protein Data Bank file.pdb CRYST P ATOM 1 CB SER ATOM 2 OG SER ATOM 3 C SER ATOM 4 O SER ATOM 5 N SER ATOM 6 CA SER ATOM 7 N THR ATOM 8 CA THR ATOM 9 CB THR ATOM 10 OG1 THR ATOM 11 CG2 THR ATOM 12 C THR ATOM 13 O THR ATOM 2166 HOH WAT ATOM 2167 HOH WAT ATOM 2168 HOH WAT END x y z occ. B