TERAPIA ANTISENSO DEL DIFETTO DI FATTORE V DELLA COAGULAZIONE. Elisabetta Castoldi

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1 TERAPIA ANTISENSO DEL DIFETTO DI FATTORE V DELLA COAGULAZIONE Elisabetta Castoldi Department of Biochemistry Maastricht University (The Netherlands)

2 DICHIARAZIONE Relatore: Elisabetta Castoldi Posizione di dipendente in aziende con interessi commerciali in campo sanitario: NIENTE DA DICHIARARE Consulenza ad aziende con interessi commerciali in campo sanitario: Fondi per la ricerca da aziende con interessi commerciali in campo sanitario: NIENTE DA DICHIARARE NIENTE DA DICHIARARE Partecipazione ad Advisory Board: NIENTE DA DICHIARARE Titolarietà di brevetti in compartecipazione ad aziende con interessi commerciali in campo sanitario: NIENTE DA DICHIARARE Partecipazioni azionarie in aziende con interessi commerciali in campo sanitario: Altro: NIENTE DA DICHIARARE NIENTE DA DICHIARARE

3 Fattore V della coagulazione (FV) Glicoproteina prodotta nel fegato Presente nel plasma (80%) e nelle piastrine (20%) Cofattore essenziale nella conversione della protrombina a trombina La completa assenza di FV non è compatibile con la vita (cf. topi knockout), ma la quantità minima necessaria per la sopravvivenza è estremamente bassa (<1%)

4 Difetto di FV Disordine emorragico raro (1:10 6 ) Tendenza al sanguinamento variabile da lieve a severa Trattamento e profilassi: plasma e/o concentrati piastrinici Ereditarietà autosomica recessiva Mutazioni nel gene F5 (150 descritte) Missense/nonsense (66%) Small ins-dels (21%) Splicing (11%) Gross rearrangements (2%) Source: Human Genome Mutation Database (accessed April 2014)

5 Patient FV:Ag FV:C Bleeding symptoms Mutation Consequences Female baby Parents distantly related 8% <1% Umbilical bleeding Gum bleeding EX G/T (homozygous) Activation cryptic splice site 35-nt deletion in mature mrna Recurrent CNS bleeding PTC Iranian male, 19 years Consanguineous parents 0.5% <1% Mucosal bleeding Recurrent haemarthrosis IVS19 +3 A/T (homozygous) Skipping of exon 19 FV synthesis but no secretion Haematuria Chinese male, 37 years Consanguineous parents 7.2% 1.6% Gingival bleeding Post-operative haemorrhage IVS8-2 A/G (homozygous) Activation cryptic splice site Inclusion 8 additional a.a. Intracranial haemorrhage Chinese male, 18 years - 2%??? IVS8-2 A/G (homozygous) Activation cryptic splice site Inclusion 8 additional a.a. Slovenian male - <1% Gastro-intestinal bleeding Joint & muscle bleeding Intracranial bleeding IVS18-12 T/A (homozygous) Activation cryptic splice site 10-nt insertion in mature mrna 0.1% mrna spliced correctly Iranian female Consanguineous parents 6% 5% Epistaxis IVS8 +6 T/C (homozygous) Skipping of exon 8 NMD of mrna Italian male, 33 years <1% <1% Spontaneous haemothorax Intracranial haemorrhage (2x) IVS A>G (homozygous) Inclusion of intronic pseudo-exon with in-frame stop codon Italian male, 54 years 0.1% <1% Died of intracranial bleeding IVS21 +1 G/A (comp. heteroz.) Activation cryptic splice site NMD of mrna Austrian female, 31 years - 3% Muscle haematomas Gastro-intestinal bleeding Macrohaematuria Chinese male, 2 years 1.6% 1.1% Bleeding after mouth injury Epistaxis Soth-African male newborn - 1% Persistent bleeding at heel prick Bleeding post-circumcision Umbilical bleeding IVS24 +1_+4del (comp. heteroz.) IVS16-1 G>T (comp. heteroz.) IVS12 +5 G>A (comp. heteroz.) Activation cryptic splice site FV synthesis but no secretion Skipping of exon 17 Skipping of exon 12 (91.5%) Activation of cryptic donor splice site in intron 12 (6.8%)

6 Terapia antisenso dell RNA Uso di molecule antisenso per ripristinare lo splicing corretto di trascritti contenenti mutazioni di splicing Oligonucleotidi sintetici con varie strutture chimiche Piccoli RNA nucleari ingegnerizzati (U1snRNA, U7snRNA) Promuovere l uso di segnali di splicing corretti indeboliti da mutazione (U1snRNA) Nascondere segnali di splicing incorretti introdotti per mutazione (oligonucleotidi, U7snRNA)

7 Il nostro paziente Maschio caucasico di 35 anni Storia di sanguinamento severo (2 emorragie intracraniche) FV plasmatico e piastrinico al di sotto della soglia di detection PPP + PL PRP PRP + collagene Controllo Paziente Castoldi et al. JTH 2011

8 Analisi genetica Controllo +268 AA Paziente +268 GG ACAGC IVS A CAG G TAAGT Esone 8 Pseudo-esone Introne 8 Esone 9 Sito donatore di splicing Sito accettore di splicing Sito donatore di splicing Sito accettore di splicing Normale (A) Mutato (G) NNSPLICE ND SpliceView ND Human Splicing Finder Castoldi et al. JTH 2011

9 Effetto della mutazione F5 IVS8 +268A>G mrna normale Esone 8 Esone 9 Esone 10 Esone 11 F5 8F-11R (470 bp) Splicing normale Pre-mRNA Esone 8 Introne 8 Esone 9 Introne 9 Esone 10 Introne 10 Esone 11 Codone di STOP! Splicing aberrante Pseudoesone Esone 11 mrna aberrante Esone 8 Esone 9 Esone 10 F5 8F-11R (581 bp) C P B 581 bp 470 bp Possiamo correggere questo difetto di splicing con la terapia antisenso? Castoldi et al. JTH 2011

10 Scopo dello studio Disegnare molecole antisenso dirette contro il sito donatore di splicing introdotto dalla mutazione F5 IVS8+268A>G Verificarne la capacità di correggere lo splicing aberrante del pre-mrna del F5 in vitro ed ex vivo Esone 8 Introne 8 Pseudo-esone Introne 8 Esone 9 Splicing normale Esone 8 Esone 9

11 Molecole antisenso Oligonucleotide antisenso (morfolino) U7snRNA ingegnerizzato psp64 25-mer Delivered to cells using EndoPorter Reagent anti-f5 5 - UCUACUUACCUGUGGCUUUA - 3 Delivered to cells using conventional lipofection Esone 8 Introne 8 Pseudo-esone Introne 8 Esone 9 Splicing normale Esone 8 Esone 9

12 Modello in vitro Wild-type F5 minigene Mutant F5 minigene Esone 8 Introne 8 Esone 9 Esone 8 Introne 8 Esone 9 * Clonaggio in vettore di espressione Clonaggio in vettore di espressione * Trasfezione Trasfezione Trascrizione Splicing Cellule COS-1 (rene) Cellule HepG2 (fegato) * Trascrizione Splicing mrna analysis mrna analysis Esone 8 Esone 9 mrna normale Esone 8 Esone 9 mrna aberrante

13 Modello in vitro Wild-type F5 minigene Mutant F5 minigene Esone 8 Introne 8 Esone 9 Esone 8 Introne 8 Esone 9 * Clonaggio in vettore di espressione Clonaggio in vettore di espressione * Trasfezione Molecola antisenso Trasfezione Trascrizione Splicing Cellule COS-1 (rene) Cellule HepG2 (fegato) Molecola antisenso * Transcription Splicing Analisi dell mrna Analisi dell mrna Esone 8 Esone 9 mrna normale Esone 8 Esone 9 mrna normale

14 Correzione dello splicing con morfolino Mutant F5 minigene Wild-type F5 minigene Mutant F5 minigene M Untr. R-MO 1 µm R-MO 5 µm R-MO 10 µm Blanks M M Untr. R-MO 5 µm C-MO 5 µm Untr. R-MO 5 µm C-MO 5 µm Blanks M Aberrant mrna Normal mrna Mutant F5 minigene Wild-type F5 minigene Mutant F5 minigene Aberrant mrna / Normal mrna Untr. R-MO 1 µm 15x R-MO 5 µm 34x R-MO 10 µm 103x Aberrant mrna / Normal mrna Untr. R-MO 5 µm C-MO 5 µm Untr. R-MO 5 µm 28x C-MO 5 µm Nuzzo et al. Blood 2013

15 Correzione dello splicing con U7snRNA Mutant F5 minigene Wild-type F5 minigene Mutant F5 minigene M Untr. R-U µg R-U7 0.5 µg R-U7 1 µg R-U7 2 µg Blanks M M Untr. R-U7 2µg C-U7 2 µg Untr. R-U7 2 µg C-U7 2 µg Blanks M Aberrant mrna Normal mrna Mutant F5 minigene Wild-type F5 minigene Mutant F5 minigene Aberrant mrna / Normal mrna Untr. R-U7 R-U7 R-U7 R-U7 Untr. R-U7 C-U7 Untr µg 0.5 µg 1 µg 2 µg 2 µg 2 µg x 30x 62x x 0.01 Aberrant mrna / Normal mrna R-U7 2 µg 106x C-U7 2 µg Nuzzo et al. Blood 2013

16 Modello ex vivo (I) Campione di sangue Buffy coat Centrifugazione a 250g per 10 min Stratificazione su Histopaque Cellule mononucleate (incl. progenitori ematopoietici) Cultura cellulare Medium serum-free +TPO & IL-3 5 giorni 10 giorni 15 giorni Radu et al. In preparazione

17 Modello ex vivo (II) Contrasto di interferenza Staining dei nuclei Staining del FV Controllo normale Paziente con difetto di FV Radu et al. In preparazione

18 Risultati modello ex vivo Paziente non trattato Paziente 5 µm R-MO Paziente 0.4 µg R-U7 Il trattamento con molecole antisenso specifiche per la mutazione ripristina l espressione del FV nei megacariociti del paziente! Nuzzo et al. Blood 2013

19 Conclusioni La mutazione F5 IVS8+268A>G introduce un sito donatore di splicing nell introne 8, causando l inclusione di uno pseudo-esone con un codone di stop in-frame nell mrna maturo MO and U7snRNA antisenso diretti contro questo sito di splicing inducono lo splicing normale del pre-mrna mutato in vitro e ripristinano l espressione del FV nei megacariociti del paziente ex vivo Questi risultati forniscono una prova di principio dell efficacia della terapia antisenso nel difetto di FV

20 Ringraziamenti CARIM, Maastricht University Maastricht, The Netherlands Francesca Nuzzo Connie Duckers Tilman M. Hackeng Jan Rosing Padua University Medical School Padua, Italy Claudia Radu Luca Spiezia Paolo Simioni International Centre for Genetic Engineering and Biotechnology Trieste, Italy Marco Baralle Francisco E. Baralle VIDI grant no Grazie per l attenzione!