LE MICOTOSSINE NEL FRUMENTO: Aggiornamenti e aspettative per il Metodi rapidi e di screening nell analisi delle micotossine

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1 LE MICOTOSSINE NEL FRUMENTO: Aggiornamenti e aspettative per il 2009 Metodi rapidi e di screening nell analisi delle micotossine Carlo Brera Istituto Superiore di Sanità Bologna, 28 maggio 2009

2 Sono sostanze dotate di elevato potere cancerogeno Sono sostanze che manifestano tossicità croniche e raramente acute Sono sostanze termostabili Sono fortemente elettrostatiche Sono ubiquitariamente presenti sul territorio Presentano una tipologia di contaminazione eterogenea (a macchia di leopardo) Non presentano difficoltà da un punto di vista di determinazione analitica

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9 Regolamento CE/1126/2007 della Commissione del 28 settembre 2007 che modifica il regolamento 1881/2006 che definisce i tenori masimi di alcuni contaminanti nei prodotti alimentari per quanto riguarda le Fusarium tossine nel granoturco e nei prodotti derivati

10 Regolamento CE/1126/2007 Considerando 34 E opportuno stabilire tenori massimi di Fusarium-tossine per i cereali non trasformati commercializzati per la prima trasformazione. I procedimenti di pulizia, cernita ed essiccazione NON sono considerati parte della prima trasformazione se non viene esercitata alcuna azione fisica sulla cariosside, mentre la decorticazione va considerata parte della prima trasformazione

11 Regolamento 1126/2007

12 Distribuzione del DON nel processo di molitura del grano % % % % 0

13 Andamento processo produttivo - ROSA test - DON Il processo di decorticazione produce un abbattimento dal 20 al 30% Concentrazione nel tritello e farinaccio dal 150% al 250 % Nella semola non si osservano abbattimenti

14 La filiera analitica Campionamento Preparazione Del campione Analisi Quali/ quantitativa

15 7 t DAL CAMPO AL BANCONE 1 : % 30 t 5 kg 1 kg 50 grammi

16 Campionamento Procedure conformi al Regolamento CE/401/2006 (Controllo ufficiale) Da evitare il controllo nei silos Da preferire quello sui camion in condizioni dinamiche piuttosto che statiche Campionatori automatici PER OTTENERE INFORMAZIONI ATTENDIBILI SI DEVE INVESTIRE SUL CAMPIONAMENTO

17 Preparazione del campione Macinazione del campione globale fino a granulometria fine Omogeneizzazione del campione macinato a secco o con acqua Prelievo in modo rappresentativo di un aliquota da destinare all analisi

18 Macinazione con acqua (slurry)

19 Mycotoxin Aflatoxins Trichothecenes (type A) Trichothecenes (type B) Zearalenone Ochratoxin A Fumonisins Extraction solvent acetonitrile/water, methanol/water, acetone/water acetonitrile/water, methanol/water acetonitrile/water, water (DON) acetonitrile/water, methanol, acetonitrile chloroform/h 3 PO 4, acetonitrile/water, methanolo/3% NaHCO 3, toluene/hcl/mgcl 2 methanol/water, acetonitrile/water, acetonitrile/methanol/water

20 Purificazione Colonnine di immunoaffinità (Euroclone, R- Biopharm, Romer, VICAM) Colonnine di immunoaffinità rigenerabili (Euroclone, Generon) MycoSep /MultiSep columns (Romer) Colonnine multi-micotossina (R-Biopharm RHONE, Romer, VICAM)

21 DON HPLC-UV Metodo ISS Principio del metodo: estrazione con acqua Purificazione su CIA Determinazione per HPLC con rivelazione UV a 220 nm Fase mobile : Acqua: MeOH 85:15 (isocratica) LQ: mg/kg

22 DON Metodi di screening Estrazione con acqua Chiarificazione dell estratto Diluizione Incubazione Lettura

23 Regolamento EC 882/2004 Caratterizzazione dei metodi di analisi Accuratezza Applicabilità (matrice e concentrazione) LR/LQ Precisione (ripe/riproducibilità) Recupero Selettività Sensibilità Linearità Incertezza di misura

24 Metodi di screening e/o rapidi Elevato numero di campioni per die Interesse ad individuare un livello soglia (ad esempio limite legale) Diversità delle matrici da analizzare Differenti sostanze da ricercare Rapidità di risposta Sensibilità accettabile Bassa cross-reattività Contenimento dei costi Esperienza del personale Possibilità di utilizzo in-situ Si rivolgono principalmente alle aziende nello svolgimento delle attività di autocontrollo Impiego nella ricerca

25 Tipi di test Test qualitativi con cut-off (risposta si/no) risposta visuale/lettore Test quantitativi che richiedono un reader ottico o scanner per la lettura della concentrazione

26 Scelta della strategia di controllo Laboratorio interno Laboratorio esterno Attrezzato?? Esperto?? Metodi ufficiali Metodi rapidi Metodi di screening Metodi di conferma

27 Metodi ufficiali e di riferimento Micotossina Matrice Metodo PRINCIPIO AFLATOSSINE CerealI AOAC IAC-HPLC-FLD AFLATOSSINE Mais AOAC ELISA Aflatossina B1 Mangimi AOAC IAC-HPLC-FLD CEN-ISO 17375:2006 Aflatossina B1 Baby foods AOAC IAC-HPLC-FLD Ocratossina A Cereali e Prodotti Derivati CEN-ISO :1998 IAC-HPLC-FLD Ocratossina A Mais ed orzo AOAC IAC-HPLC-FLD Ocratossina A ORZO AOAC IAC-HPLC-FLD

28 Metodi ufficiali e di riferimento Micotossina Matrice Metodo PRINCIPIO Ocratossina A Orzo CEN-ISO 14132:2003 IAC-HPLC-FLD Ocratossina A Baby foods CEN - IN VIA DI APPROVAZIONE IAC-HPLC-FLD Deossinivalenolo Grano AOAC IAC-HPLC-UV Deossinivalenolo Cereali e prodotti derivati CEN - IN VIA DI APPROVAZIONE Deossinivalenolo Baby foods CEN - IN VIA DI APPROVAZIONE IAC-HPLC-UV IAC-HPLC-UV Deossinivalenolo Grano AOAC IAC-HPLC-UV Zearalenone Mais AOAC IAC-HPLC-FLD

29 Micotossina Matrice Metodo PRINCIPIO Zearalenone Cereali e prodotti derivati CEN - IN VIA DI APPROVAZIONE Zearalenone Baby foods CEN - IN VIA DI APPROVAZIONE IAC-HPLC-FLD IAC-HPLC-FLD Zearalenone Grano e mangimi AOAC ELISA qualitativo Zearalenone Mais AOAC TLC Fumonisine Mais AOAC HPLC Fumonisine Prodotti alimentari a base di mais AOAC ; CEN-ISO14352:2005 IAC-HPLC-FLD Fumonisine Mais CEN 13585:2002 SPE-HPLC con derivatizzazione pre-colonna Fumonisine Mais AOAC ELISA Fumonisine Baby foods CEN - IN VIA DI APPROVAZIONE IAC-HPLC-FLD

30 Metodologie analitiche a confronto Metodologia Vantaggi Svantaggi HPLC/UPLC LC/MS/MS ELISA Ottima sensibilità Ottima selettività Buona ripetibilità Tempi di analisi relativamente brevi Metodi ufficiali disponibili (AOAC) Possibilità di automatizzazione Simultanea analisi di più micotossine Buona sensibilità Costituisce metodo di conferma Non è necessaria la derivatizzazione Preparazione del campione semplice Equipaggiamento mediamente costoso Alta sensibilità Valida per screening Analisi simultanea di molti campioni Costo della strumentazione Costo dell analisi Esperienza del personale Derivatizzazione (aflatossine, fumonisina) Uso di solventi organici Costi elevati della strumentazione Effetti matrice Alta esperienza del personale Cross-reattività con altre micotossine (specificità) Effetti matrice Presenza di falsi positivi/negativi Richiede analisi di conferma Ripetibilità e riproducibilità critiche Esperienza del personale

31 ELISA principles Direct competitive ELISA The antibody is coated on to the wells of the ELISA plate.the test sample and the enzymelabelled mycotoxin conjugate are added to the wells. If no toxin is present in the sample, the enzyme labelled toxin will bind to the capture antibody coated to the wells. If toxin is present in the sample, it will compete with the labelled toxin for binding to the antibody. During washing procedures any unbound labelled enzyme will be washed away. On the addition of substrate, a colour will develop, the intensity of which is proportional to the amount of mycotoxin-enzyme bound to the well; i.e., the colour intensity decreases with increasing concentrations of the toxin in the sample.

32 DON - Cross reattività Nei kit ELISA commercialmente disponibili, è possibile l esistenza di cross-reattività con alcuni metaboliti del DON che portano ad una sovrastima dei risultati - DON-3-glucoside - AcetilDON - 3-OH DON - 15-OH DON DIPARTIMENTO DI SANITA PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE

33 Hana Jaslova, 2008 DIPARTIMENTO DI SANITA PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE

34 DIPARTIMENTO DI SANITA PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE

35 STUDIO INTERLABORATORIO. METODO IMMUNOENZIMATICO PER LA DETERMINAZIONE DEL DEOSSINIVALENOLO IN CAMPIONI DI GRANO TENERO Carlo Brera, Francesca Debegnach, Elisabetta Prantera, Marina Miraglia Reparto OGM e Micotossine Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Alimentare Istituto Superiore di Sanità

36 Caratteristiche di efficienza - ELISA 20% 40% %

37 Progetto MICOCER - DON nel frumento CONFRONTO HPLC vs ELISA 2500 HPLC y = x R² = 1 y = 0,7969x + 5,0687 R² = 0,9992 Lineare (HPLC v.s. ELISA ) Lineare (retta 45) ELISA SOVRASTIMA COSTANTE

38 Parametri DON (µg/kg) Materiali Valori UE Valori assegnati < LOQ Valori di riferimento < LOQ Anno 2008 Numero dei lab Numero dei lab dopo outliers Numero di outliers Numero di risultati accettati Numero di repliche Media, µg/kg Sr, µg/kg RSDr, % r (=2,8xSr) µg/kg SR, µg/kg RSDR, % DIPARTIMENTO DI SANITA 31.6 PUBBLICA 15.5 VETERINARIA 23.5 E SICUREZZA 18.6 ALIMENTARE R (=2,8xSR) µg/kg Recupero, %

39 Andamento del kit ELISA rispetto al valore di riferimento ottenuto dall analisi in HPLC per lo studio di validazione interlaboratorio per la determinazione del DON in campioni di grano tenero (2008/2009). HPLC y = x R 2 = 1 y = 0.882x R 2 = ELISA DIPARTIMENTO DI SANITA PUBBLICA VETERINARIA E SICUREZZA ALIMENTARE

40 Confronto ELISA GC/MS Dr.ssa Emma Tealdo VENETO AGRICOLTURA - Istituto per la Qualità e le Tecnologie Agroalimentari, 2008

41 Comparison of ELISA and HPLC methods to determine concentrations of aflatoxins (ppb) in Sicilian durum wheat grain in (Gallo, 2008)

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43 Principi teorici del Lateral Flow Device (LFD) L LFD competitivo si basa sulla competizione della micotossina presente nel campione con i siti attivi di un recettore anticorpale marcato per i siti attivi di un complesso coniugato micotossina - recettore. La linea test contiene un complesso coniugato - micotossina immobilizzato alla membrana che lega il recettore non legato per formare un complesso coniugato micotossina-recettore colorato. La linea di controllo include un anticorpo specifico legato alla membrana che si lega con il recettore marcato. Il legame comporta una colorazione della banda. Se il segnale nella linea test è mancante o più debole come intensità, il test indica che l analita è presente (test positivo). Se la linea test è chiaramente visibile, vuol dire che il campione non contiene la micotossina

44 LATERAL FLOW DIPSTICK Metodo Rapido

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46 800 DON - Correlazione HPLC-LFD y = 1,226x + 10,51 R² = 0, H P L C SOTTOSTIMA Rosa Test (ug/kg)

47 Don - Correlazione HPLC-LFD LFD 800 TRITELLO y = 0,920x + 123,6 R² = 0, HPLC (ug/kg) LFD (ug/kg) sottostima costante

48 Metodi rapidi Metodologia Vantaggi Svantaggi Lateral flow dipsticks (LFD) Strip test Rapidità di esecuzione Non è necessaria la purificazione Basso costo della apparecchiatura Facile da usare Non necessaria alta qualifica del personale Discreta esattezza Costi operativi medi Buona sensibilità (limiti di legge) Costi operativi medio-bassi Uso limitato di solventi organici Validi per test di screening Possibilità di essere utilizzati in loco Effetto matrice Possibilità di falsi positivi/negativi Metodi esistenti non validati Test qualitativi (soglia) Cross-reattività con altre micotossine Precisione critica

49 Alcuni prodotti per il DON ELISA R5901 RIDASCREEN FAST DON R5902 RIDASCREEN FAST DON R5905 RIDASCREEN FAST DON SC R5906 RIDASCREEN DON Campo di concentrazioni: 0 6 mg/kg Cross reattività: determina anche il 3- Acetil-DON LQ: 18.5 µg/kg Colonnine di immunoaffinità P50 / P50B DONPREP Lateral flow test R5904 RIDA QUICK DON Livello soglia 1.25 mg/kg o : 0.5 mg/kg Tempo di incubazione: 5 min Standards P63 DEOXYNIVALENOL STANDARD : Concentrazione : 100 µg/ml Materiali di Riferimento P64-D Deoxynivalenol Reference Material Azienda: R-Biopham Rhone

50 Colonnine di immunoaffinità DON TEST : Campo di concentrazione mg/kg Azienda: VICAM Colonnine di immunoaffinità MycoSep /MultiSep ELISA Test Kits: AgraQuant DON: Campo di concentrazione mg/kg : LOQ: 0.2 mg/kg; tempo di incubazione: 20 min AccuTox DON: LOQ: 0.5 mg/kg Lateral Flow Test Kits: AgraStrip DON: Campo di concentrazione: mg/kg. Tempo di incubazione: 4 min Standards: Concentrazione µg/ml Azienda : ROMER LABS

51 Lateral Flow Test Kits: ROSA TEST : campo di concentrazione : 0 6 mg/kg Azienda: CHARM/FOSS ELISA Test Kits: KIT AGRI-SCREEN (analisi qualitativa) Controllo a 1 mg/kg; Tempo di analisi 10 min; cross-r 3-acetyl DON KIT VERATOX (analisi quantitativa) - Vomitossina HS DON: Campo di concentrazioni: mg/kg; TA=20 mi Vomitossina 5/5 DON Campo di concentrazione: mg/kg; TA = 10 min Lateral Flow Dipsticks : REVEAL DON : Reveal DON CUT OFF: 2 mg/kg; TA= 6 min Colonnine di immunoaffinità AZIENDA DIESSECHEM

52 ELISA KIT Quantitativo 96 e 48 pozzetti Lateral Flow Dipsticks STRIP TEST DON : Campo di concnetrazione: 0, mg/kg AZIENDA: ASTORI ELISA Deossinivalenolo Elisa Kit: campo di concentrazione 0 10 mg/kg; LQ = 0.5 mg/kg; TA=20 30 min AZIENDA: EUROCLONE ELISA DON GOLD (VT344/345): campo di concentrazione mg/kg; LQ:0.05 mg/kg; TA=30 min AZIENDA: TECNA

53 I metodi immunoenzimatici possono presentare sia una leggera sovrastima sia una sottostima rispetto al dato ottenuto dall analisi in HPLC Il metodo immunoenzimatico per la determinazione del deossinivalenolo nel grano mostra un andamento soddisfacente per un analisi di screening anche se in presenza di una leggera sovrastima Confrontando i risultati ottenuti negli studi interlaboratorio con i parametri riportati nel Regolamento 401/2006, si può affermare che esiste un sostanziale accordo, anche in considerazione del fatto che i parametri di riferimento riportati nel Regolamento riguardano metodi di conferma

54 3 Congresso Nazionale Le micotossine nella filiera agroalimentare e zootecnica Istituto Superiore di Sanità settembre 2009

55 Carlo Brera Istituto Superiore di Sanità Dipartimento di Sanità Pubblica Veterinaria e Sicurezza Aliementare (DSPVSA) Reparto OGM e Micotossine Tel carlo.brera@iss.it

56 Title: Masked mycotoxins: determination of a deoxynivalenol glucoside in artificially and naturally contaminated wheat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Personal Authors: Berthiller, F., Dall'Asta, C., Schuhmacher, R., Lemmens, M., Adam, G., Krska, R. Author Affiliation: Christian Doppler Laboratory for Mycotoxin Research, Institute for Plant Production Biotechnology, Department for Agrobiotechnology (IFA-Tulln), University of Natural Resources and Applied Life Sciences, Vienna, Konrad Lorenz Strasse 20, A-3430 Tulln, Austria. Editors: No editors Document Title: Journal of Agricultural and Food Chemistry Abstract: Conjugated mycotoxins, in which the toxin is usually bound to a more polar substance like glucose, are referred to as masked mycotoxins, as these substances escape routine detection methods but can release their toxic precursors after hydrolysis. This is the first report on the natural occurrence of a glucoside of deoxynivalenol (DON) in Fusarium-infected wheat and maize. To obtain appropriate standards, we chemically synthesized deoxynivalenol-3-β-d-glucopyranoside (DON-3-glucoside) and deoxynivalenol-15-β-dglucopyranoside (DON-15-glucoside). The synthesis products were characterized by liquid chromatography- tandem mass spectrometry. The DON-glucosides showed different collision-induced dissociation (CID) fragmentation behaviors and could therefore be distinguished. Wheat plants were either treated with DON (n=52) or with Fusarium spp. (n=4) at anthesis, and after harvest, wheat ears were analyzed for DON and DONglucosides. All 56 treated wheat samples contained DON and a DON-glucoside with the same retention time, molecular mass, and CID fragmentation behavior as the synthetic DON-3-glucoside. Moreover, the DONglucoside was also found in two out of three analyzed naturally DON-contaminated maize and in five out of five naturally contaminated wheat samples, in a range from 4 to 12% of the DON concentration. To further confirm the identity of the DON-glucoside, the compound was isolated from wheat extracts and characterized as DON-3- glucoside with NMR. The results of this study indicate the importance to consider both DON and DON-3- glucoside with regard to food and feed safety. Publisher: American Chemical Society Carlo Brera

57 Analysis of deoxynivalenol, masked deoxynivalenol, and Fusarium graminearum pigment in wheat samples, using liquid chromatography-uv-mass spectrometry. Full Abstract Tolerable limits set for deoxynivalenol (DON) do not consider DON conjugates such as DON-3-glucoside. Conjugates may be metabolized in vivo to DON. Such masked mycotoxins and the potentially toxic Fusarium pigment are not routinely analyzed in cereals. We quantified DON, DON-3-glucoside, and a red Fusarium pigment in hard red spring wheat, using a new liquid chromatography-mass spectrometry method. Extraction protocols using centrifugation and shaking, and methanol-methylene chloride (50:50 [vol/vol]) or acetonitrile-water (84:16 [vol/vol]) were assessed. Purposively and randomly selected hard spring wheat samples were extracted with solvent filtered through a C18 column and analyzed using liquid chromatography-uv-mass spectrometry. Isocratic mobile phase (70% methanol) was used. Recoveries were 96.4% (DON) and 70.0% (DON-3-glucoside), while limits of detection were 1 microg/kg (MS) and 10 microg/kg (UV), and limits of quantification were 1 microg/kg (UV) and 0.5 microg/kg (MS), respectively. The pigment limits of quantification and limits of detection on the MS were 4.3 and microg/kg, respectively. The purposively selected samples had DON, DON-3-glucoside, and pigment averages of 3.4 +/- 4.0 microg/g, 3.8 +/- 8.3 microg/g, and / g/kg, respectively. The randomly selected spring wheat had lower mean levels of DON (1.4 +/- 2.3 microg/g), DON-3- glucoside (0.2 +/- 1.0 microg/g), and pigment ( / microg/g). Analytical tools such as this new liquid chromatography-uv-mass spectrometry method can be used to quantify masked and parent mycotoxins, plus a potentially toxic pigment for risk assessment. Journal of food protection (J Food Prot), published in United States. (Language: eng) Reference: 2008-Jun; vol 71 (issue 6) : pp Carlo Brera