Elettroforesi in campo pulsato su ceppi di S. aureus: presentazione del protocollo

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1 Elettroforesi in campo pulsato su ceppi di S. aureus: presentazione del protocollo Pulsed Field Gel Electrophoresis on strains of S. aureus: presentation of the protocol Walter Vencia IZS Piemonte, Liguria e Valle d Aosta S.C. Controllo Alimenti e Igiene delle Produzioni National Reference Laboratory for Coagulase Positive Staphylococci including Staphylococcus aureus

2 What is the PFGE? PFGE is a molecular fingerprinting technique based on restriction sites within the bacterial genome of restriction fragments (from 10 kb to kb) subtyping of many pathogenic bacteria

3 Main steps Incorporation of bacteria in agarose Bacterial cell lysis in situ Enzymatic digestion Electrophoretic separation of the fragments (agarose gel 1%) Reading the gel Analysis and interpretation of profiles

4 Advantages subtyping many pathogenic organisms PFGE has shown to be more discriminative than other methods (ribotyping) for many bacteria DNA restriction patterns are stable and reproducible at the intra- and interlaboratory levels epidemiological investigation by providing rapid detection of outbreakrelated cases tracking contamination within a food system

5 Limitations Time consuming Some strains are untypable by PFGE Requires a high-level of skill

6 ISTITUTO ZOOPROFILATTICO SPERIMENTALE DEL PIEMONTE, LIGURIA E VALLE D'AOSTA VIA BOLOGNA 148 TORINO PROCEDURA OPERATIVA STANDARD CARATTERIZZAZIONE MOLECOLARE DI Staphylococcus aureus MEDIANTE PFGE (GEL ELETTROFORESI IN CAMPO PULSATO) POS N EDIZ./REV. N xx/xx PAGINA X DI X DATA: XX/XX/XXXX

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8 1. SCOPO 2. CAMPO DI APPLICAZIONE 3. RIFERIMENTI 4. DEFINIZIONI ED ABBREVIAZIONI 5. RESPONSABILITA 6. APPARECCHIATURE DI PROVA 7. MATERIALI, REAGENTI E SOLUZIONI 8. MODALITA OPERATIVE 9. ESPRESSIONE DEL RISULTATO

9 1. SCOPO 1.1 La procedura ha lo scopo di individuare i pulsotipi di Staphylococcus aureus mediante utilizzo di enzimi di restrizione con elettroforesi in campo pulsato. 2. CAMPO DI APPLICAZIONE 2.1. Isolati di Staphylococcus aureus.

10 8. MODALITA' OPERATIVE 8.1 Compilare la scheda operativa n. 60CA0XX. 8.2 Preparazione del ceppo Trapiantare il ceppo di Staphylococcus aureus da sottoporre ad analisi su piastra di TSAYE o MPCA e incubare per ore a 37 ± 1 C Trapiantare una colonia isolata in TSAYE. Trapiantare anche il ceppo di controllo NCTC Incubare per ore a 37 ± 1 C Nel primo pomeriggio seminare una colonia del ceppo in esame in Brodo BHI e incubare a 37 C per 18 ore (overnight). La mattina seguente la coltura deve essere all'inizio della fase stazionaria della crescita (OD 600nm >1).

11 8.3 Lavaggi 8.4 Sospensione Cellulare e Concentrazione batterica 8.5 Preparazione dei blocchetti 8.6 Lisi Cellulare Preparare l EC buffer di lisi (7.3.10, seguire la tabella per il numero di campioni da lisare). Per ogni campione distribuire 1 ml di EC buffer di lisi in provette sterili da 50 ml. Depositare nel fondo della provetta gli blocchetti solidificati nelle plug mold (eliminare il gel in eccesso con un bisturi) aiutandosi con un ansa sterile. Verificare che siano ricoperti dal buffer Incubare a 37 C ± 1 C con agitatore per tre ore Verificare che gli blocchetti siano diventati trasparenti Eliminare la soluzione di lisi Aggiungere 1 ml di ESP buffer (7.3.13) per ogni provetta verificando che siano ricoperti dal buffer Incubare a 37 C ± 1 C (temperatura di azione della Proteinasi K) in agitazione overnight. Questo tempo di incubazione può essere ridotto a due ore.

12 8.7 Lavaggi 8.8 Digestione enzimatica con SmaI Rimuovere la Soluzione di Lisi Enzimatica, miscela A (7.3.14) facendo attenzione a non danneggiare gli blocchetti, aggiungere 100 L della Soluzione di Lisi Enzimatica, miscela B (7.3.14) in ciascuna provetta contenente gli blocchetti e incubare in termostato a 37 C ± 1 C per 4 ore (fase di trattamento). 8.9 Separazione elettroforetica dei frammenti Posizionare i frammenti di blocchetti nei pozzetti, alternando ogni 5 o 6 pozzetti un ceppo di riferimento per le bande (NCTC 8325).

13 CHEF MAPPER Modalità Multi State: (Volts/cm = 6, Included Angle = +60/-60 Ramping Factor = A Linear ) Block 1(Blk1) State 1 (St01) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [+ 60] InTm = [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Block 1(Blk1) State 2 (St02) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [- 60] InTm = [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Migration Time 8 Hours Block 2 (Blk2) State 1 (St01) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [+ 60] InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Block 2 (Blk1) State 2 (St02) [6.0] V/cm a= [linear] Ang = [- 60] InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Migration Time 11 Hours vs Nel caso si disponga di CHEF DR III impostare lo strumento come segue: Volts/cm = 6, Included Angle = 120 Block 1(Blk1) [6.0] V/cm InTm [5 seconds] FnTm = [15 seconds] Migration Time 8,5 Hours Block 2 (Blk2) InTm = [15 seconds] FnTm = [60 seconds] Migration Time 11,5Hours

14 8.10 Lettura del gel Al termine della corsa elettroforetica estrarre il gel dalla cella e colorarlo immergendolo in una soluzione di Acqua UP (200mL) e DNA Gel Stain 1X per circa 30 minuti in agitazione Interpretazione dei risultati

15 9. 9. ESPRESSIONE DEL RISULTATO 9.1 Il risultato si esprime in % di similarità tra i pulsotipi ottenuti dai campioni e quelli presenti in banca dati. Pertanto esprimere il risultato come segue: Il ceppo presenta omologia con il ceppo nostra accettazione n con coefficiente di similarità pari al 100 % Il ceppo presenta coefficiente di similarità pari al X % con il ceppo nostra accettazione n 9.2 Qualora il profilo del ceppo batterico risulti non analizzabile mediante il programma di analisi di immagine esprimere il risultato come Ceppo non analizzabile.

16 Conclusion NRL is available to receive, from laboratories of the Italian network, strains to be analyzed by PFGE for genomic comparison Colleagues will present you an example of use of PFGE method to compare S.aureus strains isolated during a foodborne outbreak NLR is performing a research project aimed to characterized S.aureus strains isolated from different kind of matrices (humans, food, environment, animals)

17 GRAZIE PER L ATTENZIONE