CORR RELAZIONE TRA CITOGENETICA CONVENZIONALE E CITOGENETICA MOLECOLARE NELLE SINDROMI MIELODISPLASTICHE

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1 Claudia Dagani Lavoro di Diploma 2013 Formazione Tecnico in analisi biomediche SSS Scuola Superiore Medico Tecnica, Locarno C C CORRELAZIONE TRA ITOGENETICA CONVENZIONALE E CITOGENETICA MOLEM ECOLARE NELLE SINDROMI MIELODISPLASTICHE Lavoro svolto presso Laboratorio di Citogenetica EOLAB, sede ORBVV Bellinzona Responsabili: Dr.ssa Monica Taborelli e Dr.ssa Barbara B Dossena

2 Indice 1 Riassunto/Abstract Introduzione Citogenetica Il ciclo cellulare I cromosomi Cariotipo umano Anomalie cromosomiche Citogenetica convenzionale Ibridazione fluorescente in situ Sindromi Mielodisplastiche Diagnosi Quadro clinico Classificazione Citogenetica nelle Sindromi Mielodisplastiche Monosomia 5 o del(5q) Monosomia 7 o del(7q) Trisomia del(17p13)/del p del(20q) Prognosi Obiettivo Materiali e metodi Campioni Tecniche di coltura e trattamento del campione Bandeggio e acquisizione Ibridazione in situ fluorescente (FISH) Sonde Procedimento Risultati Discussione Conclusione

3 8 Ringraziamenti Bibliografia Allegati Indice delle Figure Figura 1 Ciclo cellulare caratterizzato dall alternanza tra Interfase (I) e Mitosi (M) [2]... 4 Figura 2 Ultima fase dell'interfase (G2) e fasi della mitosi [2]... 5 Figura 3 Tipi di cromosomi... 7 Figura 4 Cariotipo maschile normale 46,XY nel bandeggio Q... 9 Figura 5 Cariotipo maschile normale 46,XY nel bandeggio G Figura 6 Ideogramma Cromosoma 1 [3] Figura 7 Greenberg et al., sopravvivenza (A) e rischio di evoluzione leucemica (B) in pazienti con MDS in base all'anomalia citogenetica [9] Figura 8 Sonda Vysis LSI EGR-1(5q31)) [12] Figura 9 Sonda Vysis LSI/D5S721,D5S23(5p15.2) [12] Figura 10 Cellula normale ibridata con Sonda Vysis LSI EGR-1/D5S721,D5S23 [12] Figura 11 Sonda Vysis D7S522(7q31)/CEP7(5p11.1-q11.1) [12] Figura 12 Sonda Vysis D7S522(7q31) [12] Figura 13 Cellula normale ibridata con sonda Vysis D7S522/CEP7 [12] Figura 14 Sonda Cytocell Cep8 [13] Figura 15 Sonda Cytocell P53 Deletion [13] Figura 16 Sonda Cytocell p53 [13] Figura 17 Sonda Cytocell del(20q ) [13] Figura 18 Sonda Cytocell del(20q) [13] Figura 19 Analisi citogenetica monosomia 5 del(5q) Figura 20 Analisi citogenetica monosomia 7 del(7q) Figura 21 Analisi citogenetica trisomia Figura 22 Analisi citogenetica del(17p13) Figura 23 Analisi citogenetica del(20q) Indice delle Tabelle Tabella 1 Indicazione di specifiche anomalie strutturali [3]... 8 Tabella 2 Classificazione MDS FAB [6] [7] Tabella 3 Classificazione MDS WHO [7] Tabella 4 Sistema prognostico IPSS Tabella 5 Sistema prognostico R-IPSS Tabella 7 Casi con del(5q) / Monosomia Tabella 8 Casi con del(7q) / Monosomia Tabella 9 Casi con Trisomia Tabella 10 Casi con del(17p13) Tabella 11 Casi con del(20q)

4 1 Riassunto Abstract L analisi citogenetica in un contesto di sindrome mielodisplastica (MDS) rappresenta un importante elemento diagnostico e prognostico. Nel 40-60% dei pazienti affetti da MDS sono infatti presenti aberrazioni cromosomiche ricorrenti che possono essere evidenziate sia tramite analisi citogenetica convenzionale che per mezzo dell analisi FISH, analisi citogenetica molecolare. L obiettivo di questo lavoro di diploma è stato quello di analizzare i risultati dell analisi citogenetica svolta su campioni di sangue midollare con diagnosi di sindrome mielodisplastica confermata (dal 2009 al 2012, eseguite presso il laboratorio di Citogenetica dell Ente Ospedaliero Cantonale), correlando le anomalie identificate con la citogenetica convenzionale, ossia l analisi del cariotipo, con quelle studiate con la FISH Le anomalie rilevanti per un contesto di MDS, sulle quali si è focalizzato questo studio sono: la delezione del braccio lungo del cromosoma 5 (del(5q)) e 7 (del(7q), la monosomia del cromosoma 5 (-5) e 7 (-7), la trisomia del cromosoma 8 (8), la delezione del braccio corto del cromosoma 17 (del(17p)) e la delezione del braccio lungo del cromosoma 20 (del(20q)). I casi che all analisi del cariotipo e/o all analisi FISH hanno presentato le anomalie studiate sono stati 27, per i quali l analisi FISH si è dimostrata fondamentale per l identificazione di: 6 casi su 15 di del(5q), 3 casi su 6 di -7, 2 casi su 2 di del(17p) e 1 caso su 9 di del(20q). La correlazione tra citogenetica convenzionale e la FISH per quanto riguarda la trisomia del cromosoma 8 è risultata totale in tutti i casi presi in esame. Per la delezione del braccio lungo del cromosoma 20, la correlazione è risultata quasi completa: solo in un caso infatti, l anomalia è stata evidenziata solo per mezzo della FISH. Tuttavia in FISH la delezione era presente in un piccolo clone (5%), motivo per cui all analisi del cariotipo tale aberrazione non è stata rilevata. In conclusione, da questo studio è possibile affermare che, nei casi in cui all analisi citogenetica convenzionale vengono evidenziate la presenza di trisomia del cromosoma 8 e la delezione del braccio lungo del cromosoma 20, potrebbe non essere necessario, all arrivo del campione, pianificare l analisi FISH con le sonde specifiche per i cromosomi 8 e 20. L analisi FISH tuttavia si è dimostrata utile nel rilevare aberrazioni cromosomiche mirate, in base alla scelta della sonda, che non risultano visibili con l analisi del solo cariotipo (la qualità di risoluzione dell analisi del cariotipo è limitata ad aberrazioni macroscopiche). Inoltre nella FISH, oltre ad essere esaminato un numero di nuclei (200) nettamente superiore rispetto all analisi del cariotipo (20 metafasi), la possibilità di utilizzare la tecnica su nuclei in interfase ne amplia il campo di applicazione, rendendo possibili analisi mirate anche in casi in cui non siano disponibili metafasi d idonea qualità e quantità. Cytogenetic analysis is an essential tool for diagnostic and prognostic assessment of myelodysplastic syndrome (MDS). About 40-60% of patients affected by MDS show recurrent chromosomal aberrations, which can be detected either by conventional cytogenetic analysis or by FISH analysis, molecular cytogenetic analysis. The aim of this diploma study was to interpret the results of the cytogenetic analysis of samples of bone marrow blood from patients affected by myelodysplastic syndrome (submitted in years from 2009 to 2012, at the Laboratory of Cytogenetics Cantonal Hospital). The purpose was to find possible correlations between chromosomal abnormalities identified by conventional cytogenetic analysis (by karyotype) and those identified by FISH analysis. The anomalies relevant to a context of MDS, which represented the object of this correlation study were: the deletion of the long arm of chromosome 5 (del(5q)) and 7 (del(7q), monosomy of chromosome 7 (-7), trisomy of chromosome 8 (8), deletion of the short arm of chromosome 17 (del(17p)) and deletion of the long arm of chromosome 20 (del(20q)). 27 cases presented one of the anomalies of interest, either by the analysis of the karyotype and / or by FISH analysis. FISH analysis was found to be essential for the identification in 6 of 15 cases for del(5q), in 3 of 6 cases for -7, 2 of 2 cases for del(17p) and in 1 of 9 cases for del(20q). The correlation between conventional cytogenetic and FISH regarding the trisomy of chromosome 8 was 100% in all the 6 cases examined. Concerning the deletion of the long arm of chromosome 20, the correlation was nearly complete: in one case, the abnormality was detected by FISH analysis only. However, FISH detected the aberration in a small clone (5%); this observation is considered to be the reason why the karyotype analysis could not be useful for reporting this aberration. Based on the analysis of samples in the mean of this study, it was possible to assert, that in cases where conventional cytogenetic analysis detected the presence of trisomy of chromosome 8 and the deletion of the long arm of chromosome 20, FISH analysis seemed not be crucial for the diagnosis, thus confirming high correlation between the two techniques. However, through FISH analysis by using specific probes it was possible to detect targeted chromosomal aberrations, which were not visible by karyotype analyses: the quality of resolution in karyotype analysis instead, is limited to macroscopic aberrations. Moreover, using FISH the number of analyzed nuclei (200) is significantly higher than in the analysis of the karyotype (20 metaphases); and not least, the possibility of using interphase nuclei for targeted analysis, even in cases where metaphases of suitable quality and quantity are not available, extend the field of application of the cytogenetic analysis. 3

5 2 Introduzione 2.1 Citogenetica La citogenetica umana è nata nel 1956, anno in cui fu definito l esatto numero diploide di cromosomi umani in 46 da Tijo e Levann [1]. Questa pubblicazione costituisce il fondamento dello sviluppo sia della citogenetica umana che della genetica medica. Negli anni successivi numerosi furono gli studi che definirono anomalie a livello cromosomico in pazienti affetti da alcune patologie umane. La prima osservazione di un aberrazionee cromosomica significativamentee associata ad una specifica neoplasia, identificata come il cromosoma Philadelphia, caratteristico in pazienti affetti da leucemia mieloide cronica, costituì l inizio di d un campoo di ricerca che avrebbee condotto alla definizione del significato diagnostico e prognostico di numerose aberrazionii cromosomiche non casuali nelle neoplasie. Gli Ematologi si avvalgono del contributo della citogenetica per i problemi diagnostici, prognosticii e terapeutici di alcune malattie leucemiche e di altri disordini ematopoietici. Nelle emopatie lo studio dei cromosomi è eseguito in genere sulle cellule del midollo m osseo, poiché il i midollo, a differenza di altri tessuti, offre il vantaggio di contenere un elevata quantità di cellule allo stato libero ed in attivaa moltiplicazione Il ciclo cellularee La crescita di un tessuto avviene tramitee moltiplicazione delle proprie p cellule, seguendo una seriee di programmate e ben definite fasi. Il ciclo vitale di una cellulaa è caratterizzato dall alternanza di interfase (I) e divisione cellulare o mitosi (M) (Figura 1). L interfase ha loo scopo di preparare la cellula alla mitosi per la quale è necessaria la duplicazione di d tutte le componenti cellulari e la sintesi delle strutture necessarie alla realizzazione della divisione cellulare.. Il periodo di replicazione cellulare in coltura dura generalmente dalle 122 alle 48 ore. Poiché il periodo mitotico dura meno di un ora, per gran parte del tempo la cellula sii trova in interfase (I). Figura 1 Ciclo cellulare caratterizzato dall alternanza tra Interfase (I) e Mitosi (M) [2] 4

6 L interfase I inizia con la fase G 1, caratterizzata da un attiva sintesi proteica e dalla formazione di organuli citoplasmatici. Segue la fase S, in cui avviene la duplicazione del DNA: il corredo cromosomico viene duplicato per mezzo della sintesi degli acidi nucleici, in modo tale che ciascun cromosoma risulta costituito da due cromatidi identici. Segue infine la fase G 2 in cui vengono sintetizzate tutte le strutture necessarie per lo stadio mitotico. A mitosi terminata, prima dell inizio di un nuovo ciclo, la cellula può rimanere in uno stato di quiescienza per un tempo anche prolungato (fase G 0 ). Durante l interfase, all esterno del nucleo vi è un sistema di microtubuli, essenziali per i vari processi dell interfase, che si irradia all interno del citoplasma a partire da un centro singolo di organizzazione, definito come centrosoma. Il centrosoma è costituito da due organelli chiamati centrioli; normalmente è localizzato vicino alla membrana nucleare e anch esso viene duplicato durante la fase S. Figura 2 Ultima fase dell'interfase (G2) e fasi della mitosi [2] La mitosi è un processo continuo che viene tradizionalmente suddiviso in quattro fasi: profase, metafase, anafase e telofase. (Figura 2). La divisione cellulare richiede la presenza di una struttura chiamata apparato mitotico che comprende un fuso di microtubuli, disposti longitudinalmente ai due poli della cellula. L apparato mitotico è visibile nel citoplasma solo durante la fase M del ciclo, poiché esso si disaggrega rapidamente al termine della mitosi. Durante l interfase il contenuto del nucleo rimane intatto e i cromosomi appaiono come aggregati di cromatina indistinguibili. Nella profase, l inizio della mitosi è caratterizzato da un graduale compattamento dei singoli cromosomi, detto anche condensazione. Ogni cromosoma che si condensa si è duplicato in interfase ed è così costituito da due cromatidi fratelli uniti a livello del centromero. Con la condensazione, i cromosomi si trasformano da uno stato metabolicamente attivo ad una condizione che li rende pronti per il successivo trasporto nelle cellule figlie. Un altro cambiamento coinvolge il nucleolo, il quale inizia a frammentarsi, per poi scomparire. Diversi importanti processi che caratterizzano la profase hanno lungo anche all esterno del nucleo, nel citoplasma. I centrosomi, che si sono duplicati in interfase, si dividono e sono chiaramente 5

7 distinguibili come due entità separate, visibili al microscopio ottico. Allo stesso tempo, i microtubuli crescono e si contraggono rapidamente verso i propri centri di organizzazione dei centrosomi. I centrosomi continuano a separarsi, migrando attorno alla membrana nucleare verso le estremità opposte del nucleo. Durante lo stadio della metafase i cromosomi sono liberi nel citoplasma, mentre i centrioli, fino a questo momento appaiati, si separano l uno dall altro e migrano in direzione opposta, seguendo un fascio di fibre che formano il fuso mitotico. Le coppie di cromatidi si muovono sul fascio di fibre su un piano immaginario, detto piastra equatoriale, che taglia a metà la cellula. In questa fase i cromosomi raggiungono il massimo grado di visibilità al microscopio ottico, grazie alla loro forte spiralizzazione. Durante l anafase i due cromatidi di ciascun cromosoma si separano e si spostano, uno verso un polo della cellula e l altro verso il polo opposto. In questo modo ciascuna metà cellula riceve un uguale numero di cromatidi. Durante la telofase infine, i singoli cromatidi cominciano a decondensarsi e si riforma la membrana nucleare. Con la divisione citoplasmatica infine si originano due cellule figlie, costituite dallo stesso corredo genetico della cellula madre iniziale. Le cellule entrano poi di nuovo in interfase e il ciclo si ripete. [2] I cromosomi Il DNA contiene l informazione biologica sotto forma di unità definiti come nucleotidi. Quattro basi azotate, adenina (A), citosina (C), guanina (G) e timina (T), sono le componenti essenziali dei nucleotidi. Coppie di basi complementari (A con T, C con G), formano due filamenti antiparalleli uniti da legami idrogeno. Il DNA nel nucleo è associato a molecole proteiche, con le quali forma un materiale fibroso definito cromatina. Per mezzo di specifiche colorazioni, durante l interfase, la cromatina risulta visibile al microscopio ottico come una massa di materiale disperso. Quando la cellula si appresta a dividersi, le sottili fibre di cromatina si condensano progressivamente divenendo visibili in strutture singole definite cromosomi. Il DNA contenuto nei cromosomi specifica la composizione dei geni nel genoma umano e la loro espressione. Nelle cellule somatiche (diploidi), ogni cromosoma è presente in due copie che costituiscono una coppia di cromosomi omologhi, uno di origine paterna ed uno di origine materna. I cromosomi omologhi contengono un informazione genetica uguale, con stessi geni, disposti nella stessa sequenza. Ad ogni specifico locus essi possono avere forme identiche o leggermente differenti di uno stesso gene, chiamati alleli. Durante la metafase mitotica, i cromosomi appaiono al microscopio ottico ben definiti nei due cromatidi. La costrizione primaria nei cromosomi, ossia la regione in cui i due cromatidi sono a stretto contatto, viene definito centromero. A seconda della posizione del centromero, che divide il cromosoma in due braccia, il braccio corto (p) ed il braccio lungo (q), è possibile distinguere 3 tipi di cromosomi (Figura 3): - cromosomi metacentrici: centromero in posizione centrale - cromosomi submetacentrici: centromero in posizione terminale - cromosomi acrocentrici: centromero localizzato all estremità del cromosoma; può presentare dei satelliti (contenenti centinaia di copie di geni che codificano per gli RNA ribosomiali) [2] [3] 6

8 C. metacentrico C. submetacentrico C. acrocentrico Figura 3 Tipi di cromosomi Cariotipo umano Nella specie umana, il numero di cromosomi è 46, di cui 44 sono s chiamati autosomi e 2 sono i cromosomi sessuali (XX nella femminaa e XY nel maschio). L International System for Human Cytogenetic Nomenclature rappresenta r la guida di riferimento per p l analisi citogenetica umana [3]. L'ordinamento dei cromosomi di una cellula viene definito cariotipo: i cromosomi sonoo disposti in coppie di omologhi, allineati in ordine decrescente di grandezza. I 46 cromosomi umani sonoo classificati nelle coppie da 1 a 22, più i cromosomi sessuali X e Y; la lunghezza dei cromosomi decresce progressivamente passando dalla coppia 1 alla coppia 22, ad eccezione dei cromosomi 21 e 22, il cui ordine di grandezza è invertito. Le 222 coppie di autosomi vengono suddivisi in 7 lettera maiuscolaa dell alfabeto, dalla A alla G: gruppi, ciascuno dei quali è indicato con una - gruppo A: grandi metacentrici (cromosomi 1-3) - gruppo B: grandi submetacentrici (cromosomi 4-5) - gruppo C: submetacentrici di media grandezza ( cromosomi 6-12) - gruppo D: acrocentrici di media grandezza, con eventuale presenza p di satelliti (cromosomi 13-15) - gruppo E: piccoli submetacentrici (cromosomi 16-18) - gruppo F: piccoli metacentrici (cromosomi 19-20) - gruppo G: piccoli acrocentrici, con eventuale presenza di satelliti (cromosomi 21-22) Il cromosoma X è anch esso definitoo submetacentrico, mentre il cromosoma Y corrispondente a quella dei cromosomi di gruppo G, ma non presenta satelliti. è di tagliaa La descrizione del cariotipo include nell ordine: il numero totale t dei cromosomi, compresi i cromosomi sessuali; separati da una virgola, vengono poi indicati i cromosomi sessuali: 46,XXX per un cariotipo normale femminile e 46,XY per un cariotipo normale maschile. Nel caso in cui vengano descritte eventuali anomalie cromosomiche prima vengono v riportate le anomalie dei cromosomi sessuali e poi quelle che coinvolgono gli autosomi, in ordine numerico crescente. 7

9 2.1.3 Anomalie cromosomiche Le anomalie dei cromosomi possono essere sia numeriche che strutturali e possono coinvolgere uno o più autosomi, i cromosomi sessuali, o entrambi contemporaneamente. Tra le anomalie cromosomiche di tipo numerico, la più importante dal punto di vista clinico è l aneuploidia, un difetto nel numero di cromosomi dovuto dalla presenza di cromosomi soprannumerari o dalla perdita di cromosomi. L aneuploidia si presenta generalmente come monosomia (solo un elemento di una coppia di cromosomi) e la trisomia (tre cromosomi invece della normale coppia di un particolare cromosoma). I riarrangiamenti cromosomici strutturali sono il risultato di rotture cromosomiche, seguite da ricostituzione cromosomica in una combinazione anomala. Le delezioni coinvolgono la perdita di un segmento di cromosoma da cui risulta un cromosoma non bilanciato. Un anomalia cromosomica viene definita clonale quando: - almeno 2 cellule sono caratterizzate dalla stessa anomalia strutturale o dalla stessa acquisizione di materiale cromosomico - almeno 3 cellule presentano la stessa perdita di materiale cromosomico Le formule relative a diversi cloni cellulari vengono separate dal simbolo / ; ciascuna formula è seguita poi da una parentesi quadra [ ] ad indicare quante cellule formano il clone trovato. Alcuni simboli utilizzati nella descrizione del cariotipo, vengono riportati alla Tabella 1. Tabella 1 Indicazione di specifiche anomalie strutturali [3] ; Usato nei riarrangiamenti strutturali per separare cromosomi o regioni. - add del der dup inv mar s t Delezione. Indica cromosoma mancante, se il segno precede il cromosoma; cromosoma di minore lunghezza, se il segno segue il cromosoma. Cromosoma soprannumerario, se il segno precede il cromosoma; cromosoma di maggiore lunghezza, se il segno segue il cromosoma. Indica un valore approssimativo e può riferirsi al range del numero dei cromosomi e ad uno specifico segmento. Materiale aggiuntivo di origine non definita. Delezione. Derivativo. Un cromosoma è definito derivativo quando presenta più di un riarrangiamento, oppure quando presenta un riarrangiamento sbilanciato che coinvolge due o più cromosomi. Duplicazione. Inversione. Cromosoma marcatore. Satellite. Il simbolo è preceduto dal cromosoma acrocentrico cui si riferisce. Traslocazione. 8

10 Esempi di scrittura: - 47,XY,8[9]/46,XY[16]: in 9 metafasi su 25 analizzate è stato osservato un cariotipo maschile di 47 cromosomi caratterizzato dalla trisomia del cromosoma 8. Nelle restanti metafasi è stato osservato un cariotipo composto da 46 cromosomi maschile normale - 46,XX,del(5)(q21qter)[23]/46,XX[2]: in 23 metafasi su 25 analizzate è stato osservato un cariotipo femminile composta da 46 cromosomi caratterizzato dalla delezione terminale del braccio lungo del cromosoma 5. Nelle restanti metafasi è stato osservato un cariotipo composto da 46 cromosomi femminile normale Quando la complessità del cariotipo è elevata al punto da non poter identificare dei cloni, ma talune anomalie sono condivise da più cellule, può essere definito un cariotipo complesso, che riporta il range di numero di cromosomi nelle cellule prese in considerazione e le anomalie la cui frequenza rispetti la definizione di clonalità citogenetica. [3] [4] Citogenetica convenzionale La citogenetica convenzionale si avvale di diverse colorazioni di bandeggio che permettono di evidenziare delle bande lungo i cromosomi, consentendo la classificazione di ogni coppia di cromosomi con accuratezza in base alle caratteristiche specifiche del bandeggio. Tra le tecniche più utilizzate nei laboratori di citogenetica vi è il bandeggio con mostarda di quinacrina ed il bandeggio con Giemsa. Il bandeggio con mostrarda di quinacrina è definito bandeggio Q e le bande evidenziate, all osservazione con la luce ultravioletta, sono chiamate bande Q (Figura 4). La produzione di diverse bande dipende dalla non uniforme organizzazione del DNA, dove regioni eucromatiche, con tratti ricchi in coppie di Adenina e Timina (segmenti a replicazione precoce), si alternano a regioni eterocromatiche con tratti ricchi in coppie di Guanina e Citosina (segmenti a replicazione tardiva). Il bandeggio G (Figura 5), ottenuto da trattamento con tripsina ed in seguito con il colorante Giemsa è caratterizzato da un alternanza di bande chiare e scure, che risultano corrispondenti e sovrapponibili alle bande Q. Figura 4 Cariotipo maschile normale 46,XY nel bandeggio Q 9

11 Figura 5 Cariotipo maschile normale 46,XY nel bandeggio G Il centromero divide idealmente ogni cromatide di ciascun cromosoma nel suo braccio corto (p), e nel braccio lungo (q). Ciascun braccio è poi ulteriormente suddiviso in regioni, numerate consecutivamente a partire dal centromero verso l estremità o terminus (ter) del braccio stesso. All interno di ciascuna regione vi sono le bande, anch esse numerate progressivamente partendo da quella più vicina al centromero. Le bande possono essere divise in sottobande (visibili nei cromosomi della tarda profase, fusionati in una banda singola nei cromosomi metafasici), indicate usando un punto decimale dopo il numero della banda seguito da numeri progressivi, partendo sempre dal punto più vicino al centromero. Ad esempio la sigla 1p36.2, si riferisce alla sottobanda 2 nella banda 6 appartenente alla regione 3 del braccio corto del cromosoma 1 (Figura 6). [2] [3] [5] Figura 6 Ideogramma Cromosoma 1 [3] Ibridazione fluorescente in situ L ibridazione fluorescente in situ (Fluorescent in situ hybridisation, FISH) è una tecnica citogenetica che può essere utilizzata per rilevare e localizzare la presenza o l assenza di specifiche sequenze di DNA su dei nuclei fissati su vetrino (ibridazione in situ), sia in cromosomi metafasici che nella cromatina in interfase. Per l analisi FISH si fa capo a sonde marcate con dei fluorocromi che si legano in modo estremamente selettivo a sequenze nucleotidiche lungo i cromosomi. La microscopia a fluorescenza permette infine individuare il sito di legame tra la sonda e il cromosoma. Nelle tecniche d ibridazione in situ a scopo diagnostico vengono utilizzati diversi tipi di sonde. In campo oncoematologico vengono prevalentemente utilizzate sonde di tipo centromerico o alfoidi e locus specifiche. La sonda centromero-specifica è costituita da un tipo di sequenze ripetute dette alfoidi, presenti nei centromeri. Sono state isolate sequenze alfoidi specifiche per il centromero di ogni cromosoma. L ibridazione con una sonda centromero-specifica marcata con un fluorocromo permette di visualizzare segnali fluorescenti a livello dei centromeri di una coppia di cromosomi omologhi. 10

12 L ibridazione con una sonda locus specifica marcata con un fluorocromo permette la visualizzazione di segnali fluorescenti a livello di una regione sul braccio corto o sul braccio lungo di una coppia di cromosomi omologhi. [2] [3] [5] 2.2 Sindromi Mielodisplastiche Le sindromi mielodisplastiche (Myelodysplastic Syndrome, MDS) rappresentano un gruppo di disordini del midollo osseo che coinvolgono la cellula staminale emopoietica. Interessano tipicamente ma non solo, i soggetti anziani: l incidenza media è stimata a 3-5 casi ogni persone per anno, mentre oltre i 70 anni di età, l incidenza può superare i 20 casi ogni persone per anno. Le MDS sono caratterizzate da un ematopoiesi inefficace, alterazioni morfologiche displastiche a carico delle principali filiere emopoietiche (eritrociti, neutrofili e trombociti), citopenia periferica, progressiva insufficienza midollare ed un aumentato rischio di progressione in leucemia acuta mieloide (AML). Il quadro diagnostico mielodisplasia può essere primitivo, senza identificazione cioè di alcuna causa eziologicamente significativa, oppure secondario in seguito all esposizione a fattori tossici (solventi organici, pesticidi; assunzione di alchilanti o altri citostatici; esposizione a radiazioni ionizzanti e a piombo; trattamenti con antibiotici; ). La sopravvivenza dei pazienti affetti da MDS varia da alcuni mesi a diversi anni per cui risulta di primaria importanza avere a disposizione un sistema classificativo e di valutazione prognostica che permettano di predire la probabilità di sopravvivenza e di evoluzione in AML allo scopo di definire il più corretto approccio terapeutico. [6] [7] Diagnosi Il percorso che porta a formulare una diagnosi di MDS si avvale di numerosi mezzi quali l emogramma, l analisi morfologica dell aspirato midollare, la biopsia osteomidollare e non da ultimo, l analisi citogenetica su sangue midollare Quadro clinico La maggior parte dei pazienti affetti da MDS presenta sintomi correlati alla citopenia: per lo più si manifesta anemia; meno frequenti invece la neutropenia e la trombocitopenia. Quasi tutti i pazienti affetti da MDS presentano un valore di emoglobina poco inferiore alla norma (<12 g/dl per le donne, <14 g/dl per gli uomini), anche se spesso si può presentare un quadro anemico di grave entità. L anemia è generalmente macrocitica o, meno frequentemente, normocitica, con anisopoichilocitosi, ipocromia e presenza di emazie con punteggiatura basofila. Il quadro anemico è generalmente riconducibile ad un inefficace eritropoiesi, la cui natura peraltro rimane poco chiara. Il quadro clinico conseguente alla leucopenia (<2.5 x10 9 /L) nelle MDS è contrassegnato dalla comparsa di frequenti infezioni che possono peraltro rappresentare la più frequente causa di morte di questi malati. La maggior parte delle infezioni è di tipo batterico, con manifestazioni di tipo pneumonico e setticemico. Accanto alla riduzione quantitativa dei neutrofili, le infezioni in 11

13 pazienti con MDS sono caratterizzate anche da un alterata funzionalità di questi elementi, in particolare da un deficit di attività chemiotattica, fagocitica e di killing. Una diminuzione del tasso piastrinico è relativamente comune nel corso di una MDS; anche se generalmente non di grave entità (< 100 x10 9 /L), può rappresentare l unico segno d esordio della malattia. Spesso la trombocitopenia è associata ad alterazioni morfologiche delle piastrine (piastrine giganti o agranulari) ed a disturbi funzionali delle stesse, quali un tempo di sanguinamento allungato anche in presenza di valori piastrinici normali e ridotta aggregazione all adrenalina ed al collagene. Una caduta rapida a valori molto bassi del tasso piastrinico (< 10 x10 9 /L) può segnalare l evoluzione verso una forma di leucemia acuta, con manifestazioni di ecchimosi o di vasti ematomi in occasione di traumi Classificazione Il primo sistema di classificazione fu proposto nel 1982 dal gruppo Franco Americano Britannico (FAB). Questa classificazione distingue cinque forme e si avvale esclusivamente dei criteri morfologici come la citopenia, la displasia midollare, la presenza di cellule immature o blastiche nel sangue periferico e midollare, come descritto nella Tabella 2. Tabella 2 Classificazione MDS FAB [6] [7] Sangue periferico - midollo osseo AR ARSA AREB AREB-t LMMC Blasti - Sangue Periferico % - Midollo Osseo % <1 <5 <1 <5 < > < Morfologia - Diseritropoiesi - Disgranulopoiesi - Dismegacariopoiesi ± ± - ± ± ± ± ± Conta monocitaria N N N N >1x10 9 /l Reticolociti D D D D D Eritrociti D D D D D Leucociti N/D N/D D D D/A Trombociti N/D N/D D D D Morfologia Midollo osseo - Cellularità - Diseritropoiesi - Disgranulopoiesi - Dismegacariopoiesi N/A ± ± A ± ± A A A Sideroblasti ad anello <3% >15% ± ± ± Evoluzione in AML 15% 15% 30-60% 100% 40% AR: Anemia Refrattaria; ARSA: AR con sideroblasti ad anello; AREB: AR con eccesso di blasti; AREB-t: AREB in trasformazione leucemica; LMMC: Leucemia mielomonocitica cronica. N: normale; A: Aumentato; D: Diminuito 12

14 Nel 2001 l organizzazione mondiale della sanità (World Health Organisation, WHO) ha proposto una nuova classificazione, che riprende in considerazione molti criteri e definizioni del sistema FAB, definendo però con maggior precisione alcuni sottotipi. Questa classificazione distingue sette forme principali, come descritto nella Tabella 3, in cui è compresa la sindrome associata alla delezione del braccio lungo del cromosoma 5 (del(5q)), quale anomalia cromosomica isolata. Tabella 3 Classificazione MDS WHO [7] CRDU, AR, RN, RT ARSA CRDM AREB-1 AREB-2 MDS-NC MDS associata a del(5q) isolata Sangue Periferico Citopenia unilineare o bilineare Assenza o rari blasti <1% Anemia Assenza di blasti Citopenia Assenza o rari blasti <1% Assenza di corpi di Auer Monociti <1x10 9 /L Citopenia Blasti <5% Assenza di corpi di Auer Monociti <1x10 9 /L Citopenia Blasti 5-19% Corpi di Auer ± Monociti <1x10 9 /L Citopenia Assenza o rari blasti <1% Assenza di corpi di Auer Anemia Assenza o rari blasti <1% Conteggio trombocitico normale o aumentato Midollo osseo Displasia unilineare; 10% delle cellule della linea interessata Blasti <5% Solo displasia eritroide Blasti >5% Sideroblasti ad anello 15% Displasia >10% delle cellule in 2 o più linee mieloidi Assenza di corpi di Auer Sideroblasti ad anello ±15% Displasia unilineare o multilineare Blasti 5-9% Assenza di corpi di Auer Displasia unilineare o multilineare Blasti 10-19% Corpi di Auer ± Displasia non equivoca in <10% delle cellule in una o più linee mieloidi Blasti <5% Megacariotici con nucleo ipolobato normali o aumentati Blasti <5% Isolata del(5q) Assenza di corpi di Auer CRDU: Citopenia Refrattaria con Displasia Unifilare; AR: Anemia Refrattaria; RN: Neutropenia Refrattaria; RT: Trombocitopenia Refrattaria; ARSA: Anemia Refrattaria con sideroblasti ad anello; CRDM: Citopenia Refrattaria con Displasia Multifiliare; AREB: Anemia Refrattaria con Eccesso di Blasti; MDS-NC: MDS non classificabili Citogenetica nelle Sindromi Mielodisplastiche Circa il 40-60% dei casi di MDS, sono caratterizzati da anomalie citogenetiche ricorrenti, a dimostrazione della clonalità della malattia. Gli elementi delle tre serie maturative midollari (eritrociti, neutrofili e trombociti) derivano tutte dalla stessa cellula progenitrice multipotente che ha acquisito un alterazione genetica ad impronta displastica. La presenza di un cariotipo normale non esclude la possibilità di una diagnosi di MDS. Tuttavia, se la malattia viene identificata clinicamente, un cariotipo normale conferisce una prognosi favorevole. Tra i casi che presentano anomalie citogenetiche, le anomalie più frequenti sono di tipo non bilanciato, con la perdita di frammenti (del(5q), del(7q), del(20q), del(17p13)) o di interi cromosomi (-5,-7) o ancora, per la presenza di cromosomi soprannumerari (8). 13

15 La perdita del cromosoma Y (-Y) è stata osservata in diversi disordini maligni, ma è anche un fenomeno associato con l avanzare dell età. La perdita del cromosoma Y non esclude una MDS. Nel caso in cui la malattia viene identificata clinicamente, quest anomalia è associata ad una prognosi favorevole. [8] [7] [4] Monosomia 5 o del(5q) La delezione del braccio lungo (del(5q)) e la monosomia del cromosoma 5 (-5) sono stati dimostrati in numerosi disordini ematopoietici, ma soprattutto in pazienti affetti da MDS e leucemia mieloide acuta. L anomalia cromosomica del(5q) è il risultato di delezioni interstiziali di vario tipo a livello del braccio lungo del cromosoma 5. I punti di rottura più frequentemente coinvolti vanno da 5q12-14 (breakpoint prossimale) a 5q31-33 (breakpoint distale), anche se vi sono notevoli variazioni per quanto riguarda la lunghezza del segmento deleto. La delezione che viene osservata più frequentemente (90%) coinvolge il segmento da q31 a q Non è ancora noto il gene critico che viene perso con il materiale genetico contenuto nella delezione; esiste tuttavia una mappatura piuttosto ampia del braccio lungo del cromosoma 5, che fornisce informazioni su un gran numero di geni in esso contenuti. Si tratta di geni implicati nella crescita cellulare, in modo particolare di geni che codificano per fattori di crescita delle cellule midollari e per i loro recettori. L utilizzo della citogenetica molecolare suggerisce l esistenza di più di una regione critica nel segmento deleto e di conseguenza la possibilità della perdita di un gene oncosoppressore. Tra questi, il gene EGR-1, un oncosoppressore che viene espresso nelle cellule mieloidi e gioca un ruolo importante nella differenziazione dei blasti mieloidi. La presenza della del(5q) come unica anomalia conferisce nel paziente una prognosi favorevole. Una MDS associata alla singola del(5q) pare maggiormente espressa nelle donne; morfologicamente è caratterizzata da megacariocitosi con nuclei non lobati o ipolobati, anemia refrattaria macrocitica e da un conteggio dei trombociti normale o eventualmente aumentato Monosomia 7 o del(7q) La monosomia del cromosoma 7 (-7) o la delezione del suo braccio lungo (del(7q)), determina nel paziente affetto da MDS una prognosi sfavorevole. Queste anomalie ricorrono non solo nelle MDS e AML, ma anche in altre neoplasie mieloidi. Non sono tuttora noti i geni persi nel cromosoma 7. Si suppone che anche in questo caso vi siano delle regioni che contengano geni oncosoppressori, la cui perdita contribuisce alla trasformazione neoplastica Trisomia 8 Quest anomalia è molto frequente nei disordini mieloidi. La presenza di trisomia del cromosoma 8 conferisce nel paziente una prognosi intermedia. 14

16 del(17p13)/del p53 La delezione del gene p53 (del p53), localizzato sul braccio corto del cromosoma 17 alla banda 3 della regione 1 (17p13) è un anomalia piuttosto rara nel quadro diagnostico di una MDS. La proteina 53 (p53) è un oncosoppressore coinvolto nella patogenesi di numerose neoplasie umane, incluse quelle ematologiche. L assenza del gene p53 determina nel paziente con una MDS, una prognosi sfavorevole, con un aumentato rischio di evoluzione in AML. Il quadro morfologico nel sangue periferico è spesso caratterizzato dalla presenza di cellule pseudo Pelger-Huët, neutrofili di grandezza scarsa e vacuolati del(20q) La delezione del braccio lungo del cromosoma 20 (del(20q)) è una anomalia ricorrente nei disordini mieloidi maligni. All interno di questa regione sono contenuti tra i diversi geni d interesse, il PTPRT ed il MYBL2. Il gene PTPRT codifica per un enzima, il receptor-type tyrosine-protein phosphatase T, appartenente alla famiglia delle proteine tirosina fosfatasi, molecole che svolgono un ruolo determinante in alcuni processi cellulari come la crescita, la differenziazione, il ciclo mitotico, e non da ultimo la trasformazione oncogenica in quanto oncosoppressore. Il gene MYBL2 (Myb-related protein B) codifica per una proteina appartenente alla famiglia delle MYB (MYeloBlastosis), fattori di trascrizione che giocano un ruolo essenziale nella regolazione dell ematopoiesi. La clinica dei pazienti che presentano questa anomalia è caratterizzata da una malattia a basso rischio, generalmente con un anemia refrattaria, una bassa probabilità di evoluzione in leucemia acuta, ed una buona sopravvivenza. Morfologicamente, la presenza della del(20q) è associata ad una prominente displasia nelle linee eritropoietica e megacariopoietica. La presenza come unica anomalia conferisce nel paziente una prognosi favorevole Prognosi Nel 1997 è stato proposto un sistema prognostico a punteggio, l International Prognostic Scoring System for Myelodysplastic Syndromes (IPSS). [9] Questo sistema, come descritto nella Tabella 4, formula un punteggio (Score) prendendo in considerazione la citopenia, la percentuale di blasti midollari e le alterazioni citogenetiche. Vengono infine classificati diversi gruppi di rischio, che differiscono significativamente per probabilità di sopravvivenza e per evoluzione leucemica. 15

17 Tabella 4 Sistema prognostico IPSS Parametro Score Grado di citopenia* Citogenetica** Favorevole Intermedio Sfavorevole - Blasti midollari % < *Citopenia: - Emoglobina <10 g/dl - Trombociti <100x10 9 /L - Conteggio assoluto dei neutrofili <1.8x10 9 /L **Citogenetica: - Favorevole: normale, -Y, del(5q), del(20q) - Sfavorevole: complesso ( 3 anomalie), anomalie cromosoma 7 - Intermedio: altre anomalie Gruppo rischio IPSS score Basso 0 Intermedio Alto Per mezzo dell analisi di Kaplan-Meier vengono rappresentante la sopravvivenza (Figura 7A) ed il rischio di evoluzione leucemica (Figura 7B) in base alle diverse anomalie cromosomiche. In questo studio sono stati identificati diversi gruppi di pazienti, secondo le anomalie citogenetiche che essi presentavano. Secondo il metodo di Kaplan-Meier [10] ciascun gruppo di pazienti affetti da MDS è stato seguito per un totale di circa 18 anni dalla diagnosi. Alla fine del periodo di osservazione ciascun paziente appartenente al rispettivo gruppo, caratterizzato da: - una condizione: 0 ad indicare che la condizione non è avvenuta (ad es. paziente sopravvissuto o nessuna evoluzione leucemica avvenuta) o 1 ad indicare che la condizione è avvenuta (paziente deceduto o un evoluzione leucemica avvenuta) - il tempo dell osservazione La probabilità (P) del verificarsi di una condizione (ad esempio, la sopravvivenza) a qualsiasi momento dell osservazione (tempo x), è calcolata secondo la formula seguente: P Tempo x = (numero di soggetti viventi all inizio dello studio numero di soggetti deceduti)/ numero di soggetti viventi all inizio dello studio Per un determinato lasso di tempo ( tempo di osservazione ) per ogni gruppo di individui che presentano uguali e specifiche anomalie citogenetiche, viene così formulato il decorso della malattia, in ragione della probabilità del verificarsi o meno dell evento di interesse (della condizione, ad esempio l evento morte o l evento leucemia mieloide acuta ). 16

18 Figura 7 Greenberg et al., sopravvivenza (A) e rischio di evoluzione leucemica (B) in pazienti con MDS in base all'anomalia citogenetica [9] Nel 2012 è stato pubblicato uno studio rivisitato, rispetto al precedente sistema prognostico a punteggio, il Revised International Prognostic Scoring System for Myelodysplastic Syndromes (R- IPSS) (Tabella 5), nel quale vengono definiti in totale 7 gruppi a rischio anziché i 5 precedenti. [11] 17

19 Tabella 5 Sistema prognostico R-IPSS Parametro Emoglobina (g/dl) Trombociti (x10 9 /L) Conteggio assoluto dei neutrofili (x10 9 /L) Score <10 < < <0.8 Citogenetica* Molto favorevole Favorevole Intermedia Sfavorevole Molto sfavorevole Blasti midollari (%) 2 >2 - < >10 * Citogenetica: - molto favorevole: -Y, del(11q) - favorevole: normale, del(5q), del(12p), del(20q), doppia del(5q) - intermedio: del(7q), 8, 19, i(17q) - sfavorevole: -7, inv(3)/t(3q)/del(3q), doppia -7/del(7q), complesso con 3 anomalie - molto sfavorevole: complesso con più di 3 anomalie Gruppo rischio IPSS-R score Sopravvivenza media (anni) Rischio medio del 25% di evoluzione in AML (anni) Molto basso >14.5 Basso > Intermedio > Alto > Molto alto >

20 3 Obiettivo L obiettivo di questo lavoro di diploma è stato quello di analizzare i risultati dell analisi citogenetica di campioni con diagnosi di sindrome mielodisplastica confermata, giunti dal 2009 al 2012, presso il laboratorio di Citogenetica dell Ente Ospedaliero Cantonale, al fine di correlare le anomalie identificate con la citogenetica convenzionale con quelle osservate con l ibridazione fluorescente in situ (Fluorescent in situ hybridisation, FISH), tecnica di citogenetica molecolare, per una corretta e completa analisi citogenetica. Attraverso questo studio di analisi si vuole determinare perciò in quale misura, l analisi FISH offra informazioni supplementari, oltre alla sola analisi del cariotipo, rispetto ad alcune aberrazioni cromosomiche ricorrenti, tipiche nelle sindromi mielodisplastiche. 19

21 4 Materiali e metodi In ambito oncoematologico, le tecniche che permettono di studiare i cromosomi sono l analisi del cariotipo e l analisi FISH. 4.1 Campioni Sono stati considerati in analisi i campioni giunti presso il laboratorio di Citogenetica (EOLAB) dell Ospedale San Giovanni di Bellinzona negli anni dal 2009 al 2012, con un sospetto diagnostico di MDS (prima diagnosi). Per confermare il sospetto diagnostico di MDS sono stati visionati, oltre all esito dell analisi citogenetica, i risultati dell analisi morfologica dell aspirato midollare eseguita nel laboratorio di ematologia morfologica dell Ospedale San Giovanni di Bellinzona (LEM) ed i risultati delle analisi eseguite sulla biopsia osteomidollare presso l Istituto Cantonale di Patologia di Locarno (ICP). I campioni utilizzati per l analisi citogenetica, sono prelievi di sangue midollare anticoagulati con litio eparina, che presentavano un sospetto diagnostico di MDS. 4.2 Tecniche di coltura e trattamento del campione Le indagini citogenetiche richiedono la presenza di cellule in attività mitotica. 0.5 ml di sangue midollare è messo in coltura in sospensione nel terreno di crescita Marromax (4 ml, pronto all uso) all intero di una provetta a becco di clarino sterile che garantisca lo scambio gassoso. Il terreno contiene elementi nutritivi, fattori di crescita e sistemi tampone. Le colture sono allestite in camera sterile sotto una cappa a flusso laminare per garantire la sterilità e poste in termostato a 37 C, con il 5% di contributo di CO 2. Per un indicazione di MDS si effettuano due colture indipendenti a tempi diversi: una a 24 ore e l altra a 48 ore. Al termine del periodo d incubazione, alle colture vengono aggiunti 50 μl di Colcemid, una soluzione di colchicina, e si incuba nuovamente la provetta nel termostato a 37 fornita di CO 2 per un minimo di 4h e un massimo di 6h. La colchicina è in grado di inibire la formazione delle fibre del fuso mitotico consentendo di bloccare le cellule in divisione allo stadio di metafase, in cui i cromosomi presentano il grado di condensazione ottimale per lo studio. Successivamente alle ore di incubazione con colchicina, viene eseguito il processamento del campione. L uso di una soluzione ipotonica (4 ml di 0.65% KCl) consente il rigonfiamento delle cellule e la conseguente dispersione controllata dei cromosomi metafasici, che ne migliora la visibilità. I successivi trattamenti con una soluzione di 5% acido acetico (4 ml) ed in seguito con soluzione di fissativo (4 ml, di cui: 3 parti di metanolo e 1 parte di acido acetico glaciale) permettono di bloccare i processi degenerativi e rimuovono detriti dal preparato ed alcune proteine dai cromosomi. La sospensione dei nuclei così ottenuta, viene strisciata su vetrini, che saranno infine destinati all analisi del cariotipo (quindi alla colorazione in bandeggio) o all analisi FISH. 20

22 4.3 Bandeggio e acquisizione I vetrini allestiti, vengono lasciati una notte nel termostato a 37 C, dopodiché si procede alla colorazione. I vetrini sono colorati con mostarda di Quinacrina (Quinacrine dihydrochloride), che fornisce il bandeggio Q. Ogni vetrino viene inizialmente idratato in una serie di diluizioni di etanolo al 100%, 90%, 80%, 70% per 5 minuti ciascuno ed infine in acqua per 2 minuti. I vetrini vengono poi immersi nella soluzione di mostarda di Quinacrina per minuti e da ultimo, lavati nella soluzione tampone McIlvaine. I vetrini dapprima lasciati asciugare al buio, vengono montati con soluzione tampone McIlvaine e copri oggetto per l analisi al microscopio a fluorescenza. Al microscopio a fluorescenza si acquisiscono da entrambe le colture (24h e 48h), almeno 20 metafasi di cellule per caso per mezzo del Software Cytovision. Viene ricostruito il cariotipo delle varie metafasi ed ogni cromosoma viene attentamente analizzato, al fine di ricercare eventuali anomalie. 4.4 Ibridazione in situ fluorescente (FISH) Sonde Vysis LSI EGR-1(5q31)/D5S721, D5S23(5p15.2) [12] La sonda locus specifica LSI EGR1/D5S23, D5S721 (Figure 8 e 9) viene utilizzata per detettare la delezione del locus 5q31 contenente il gene EGR-1. La sonda LSI D5S23, D5S721 è impiegata nel determinare se la delezione è a carico dell intero cromosoma 5 o solo del corrispettivo braccio lungo. In una cellula normale ibridata si osservano due segnali arancioni e due verdi (Figura 10). In una cellula contenente la delezione del braccio lungo vi è un solo segnale arancione e due segnali verdi; in caso di monosomia invece, è presente un solo segnale arancione e uno verde. Figura 8 Sonda Vysis LSI EGR-1(5q31)) [12] 21

23 Figura 9 Sonda Vysis LSI/D5S721,D5S23(5p15.2) [12] Figura 10 Cellula normale ibridata con Sonda Vysis LSI EGR-1/D5S721,D5S23 [12] Vysis LSI D7S522(7q31)/CEP7 [12] La sonda D7S522/CEP7 (Figure 11 e 12) viene utilizzata per detettare la delezione del locus D7S522 e la regione centromerica del cromosoma 7, localizzati rispettivamente ai locus 7q31 e 7p11.1-q11.1. In una cellula normale ibridata vengono osservati due segnali arancioni e due verdi (Figura 13). In una cellula contenente la delezione del braccio lungo vi è un solo segnale arancione e due segnali verdi; in caso di monosomia invece, è presente un solo segnale arancione ed uno verde. Figura 11 Sonda Vysis D7S522(7q31)/CEP7(5p11.1-q11.1) [12] 22

24 Figura 12 Sonda Vysis D7S522(7q31) [12] Figura 13 Cellula normale ibridata con sonda Vysis D7S522/CEP7 [12] Cytocell Cep 8 alpha satellite probe [13] La sonda Cytocell Cep 8 è utilizzata per detettare la trisomia 8. In una cellula normale ibridata vengono osservati due segnali arancioni (Figura 14), mentre in una cellula con la trisomia vi sono tre segnali arancioni. Figura 14 Sonda Cytocell Cep8 [13] Cytocell p53(17p13) deletion [13] La Cytocell sonda p53(17p13) (Figura 15) è utilizzata per detettare la delezione del gene p53. In una cellula normale ibridata vengono osservati due segnali arancioni e due verdi (Figura 16). In una cellula contenente la delezione vi è un solo segnale arancione e due segnali verdi. 23

25 Figura 15 Sonda Cytocell P53 Deletion [13] Figura 16 Sonda Cytocell p53 [13] Cytocell del(20q) deletion [13] La sonda Cytocell del(20q) si utilizza per ricercare la delezione del braccio lungo del cromosoma 20 (Figura 17). La sonda prossimale, marcata in rosso, copre una regione di 301 kb nel 20q12, all interno del PTPRT. Nel 20q13.12 un altra sonda, marcata in verde, copre la regione del gene MYBL2. In una cellula normale ibridata vengono osservati due segnali arancioni e due verdi (Figura 18). In una cellula contenente la delezione vi è un solo segnale arancione e due segnali verdi. Figura 17 Sonda Cytocell del(20q ) [13] 24

26 Figura 18 Sonda Cytocell del(20q) [13] Procedimento Ogni sonda (con eventuali tamponi di ibridazione) è conservata a -20 C e viene portata a temperatura ambiente prima dell uso. Data la presenza nelle sonde di fluorocromi fotosensibili alla luce, vi è la necessità di mantenere le sonde al riparo dalla luce. Per le sonde Vysis e per la sonda Cytocell Cep 8 in una Eppendorf vengono aggiunti 8 L del rispettivo tampone di ibridazione (Vysis o Cytocell) con 2 L di sonda. Le sonde Cytocell rimanenti sono invece pronte all'uso. Successivamente alla fissazione dei nuclei su vetrino viene effettuato un pretrattamento che permette di eliminare RNA e proteine: - soluzione 2xSSC per 5 min a temperatura ambiente - soluzione 1xPBS per 5 min a temperatura ambiente - soluzione 1xPBS per 5 min a temperatura ambiente I vetrini sono in seguito sottoposti a disidratazione in una serie di diluizioni di etanolo al 70%, 80%, 90% e 100% per 5 minuti ciascuno a temperatura ambiente I vetrini vengono posti in termostato a 37 C ad asciugare. La FISH viene eseguita per mezzo dello strumento Thermobride TM S500 (Abbott Molecular). Dispensare per ogni vetrino 10 L di sonda o della miscela della specifica sonda preparata (descritto precedentemente per ogni sonda), coprire delicatamente con il coprioggetto e sigillare con una soluzione collante gommosa e far asciugare completamente. I vetrini vengono caricati nell Hybride, il quale viene impostato per eseguire due processi: - Melt T 75 C per 1 minuto: il DNA bersaglio e la sonda, opportunamente selezionata, sono denaturati ad alta temperatura, in modo da separare i due filamenti della doppia elica del DNA - Hyb T 37 C, over night: ibridazione delle sequenze complementari tra sonda e sequenza bersaglio Terminata l ibridazione, la sonda di DNA non legata o legata in modo non specifico, viene rimossa per mezzo di lavaggi stringenti. Vengono rimossi il coprioggetto e le tracce di colla. I vetrini vengono così lavati come segue: 25