Come valutare l efficacia di una terapia alternativa alla dieta
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- Agnese Sorrentino
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1 Come valutare l efficacia di una terapia alternativa alla dieta Riccardo Troncone Dipartimento di Scienze Mediche Traslazionali e Laboratorio Europeo per lo Studio delle Malattie Indotte da Alimenti Università degli Studi di Napoli Federico II II Convegno Nazionale AIC Celiachia e terapia: dalla dieta senza glutine alle prospettive future Roma, 7 novembre 2014
2 La celiachia è una malattia complessa multifattoriale
3 Meccanismi patogenetici della celiachia Gliadina Risposta adattativa Risposta innata Attivazione dei recettori tirosina-chinasi (EGF) IL Virus IEL CD94 HLA-E γ/δ NKG2D MICA Lamina propria TG2 Q Peptide deamidato E TCR CD8 CD25 HLA I-A 2 IL-15 IFN-g APC HLA-DQ2/8 E TCR CD83 CoX2 IFN-a Macrofago/DC IL-10 TGFb T CD4+ CD4+ Tr1 Anticorpi antigliadina e anti- TG2 Cellula B Gianfrani C. & Auricchio S. Prospettive in Pediatria 2008
4 Celiachia: terapia Dieta senza glutine Assoluta, per la vita Qualità della vita compromessa Sicura Terapia attuale Riduzione del carico antigenico Immunomodulazione Strategie future
5 Momenti patogenetici possibili target di strategie terapeutiche Riduzione del carico antigenico Digestione della gliadina Contatto con la mucosa intestinale Passaggio attraverso l epitelio Immunomodulazione Deamidazione ad opera della transglutaminasi Legame a molecole HLA Interazione con TCR Produzione citochine proinfiammatorie Induzione cellule Treg Homing cellule T
6 Come testare l efficacia delle nuove terapie Test preclinici In vitro Interferenza con le proprietà biologiche della gliadina su Cellule epiteliali Cellule T Ex vivo Studi su colture d organo In vivo Modelli animali
7 Come testare l efficacia delle nuove terapie Test clinici Challenge a breve termine i. Permeabilità intestinale ii. Mobilizzazione di cellule T intestinali nel sangue periferico Challenge a lungo termine i. Marcatori di integrità epiteliale ii. Anticorpi celiachia-specifici iii.alterazioni immunoistopatologiche
8 Modelli cellulari: cellule CaCo Effetti della gliadina Riarrangiamento actina Ingresso peptidi Traffico vescicolare Processi ossidativi intracellulari Proliferazione Apoptosi Utilizzate per testare effetto inibitori zonulina, binders polimerici, enzimi, probiotici
9 Il lattobacillo LP CBA L74 riduce l ingresso di P31-43 e P57-68 marcati con lissamina nelle cellule Caco-2. Verde = nuclei Rosso = vescicole contenenti i peptidi P P57-68 Lissaminati Sarno M, Int J Food Sci Nutr Jul 17:1-7. 9
10 Modelli cellulari: linee/cloni T intestinali Inattivazione epitopi Inibizione interazione peptidimolecole DQ
11 Linee T intestinali: bioassay molto sensibili per valutare la reattività al glutine + + gliadina estratta dalle farine Linee T CD4+ T intestinali No gliadina gliadina Interferon-γ ELISPOT Gianfrani, Gastroenterology 2007 Camarca, J Immunol 2009 Rizzello, App Env Microb 2007 Bergamo, Mol Nutr Food Res Maglio, Scand J Gastroenterol Gianfrani, Am J Clin Nut 2012
12 Il glutine transamidato (mtgasi + K-CH3) non attiva le cellule T di celiaci F P Q P Q L P Y P Q P F P Q P Q L P Y P Q P mtgasi +K-CH 3 F P Q P Q L P Y P Q P K-CH 3 K-CH 3 X d+ P1 P4 P6 P9 HLA-DQ2 + mtgasi + K-CH 3 * + mtgasi * Non trattato Controllo negativo * Gianfrani et al Gastroenterology 2007 IFNg (%)
13 AN-PEP degrada peptidi del glutine immunoreattivi NO AN-PEP AN-PEP
14 Cultura d organo della mucosa intestinale come bioreattante: L esempio della IL10 Espianti dell intestino gliadina IL-10 per 8-24 ore 37 C Immunoistochimica Ex-vivo FACS mrna, protein expression Generazione di linee di cellule T e Clonazione di cellule T Salvati VM et al. Gut 2005
15 Inibizione attivazione cellule T in biopsie trattate con IL10 CD3+, CD25+, CD3+CD25+ PT gliadina medium PT gliadina + IL10 Salvati VM et al. Gut 2005
16 Inibizione produzione γifn e IL2 in biopsie trattate con IL10 Salvati VM et al. Gut 2005
17 Come testare l efficacia delle nuove terapie Test preclinici In vitro Interferenza con le proprietà biologiche della gliadina su Cellule epiteliali Cellule T Ex vivo Studi su colture d organo In vivo Modelli animali
18 Alcuni modelli animali di malattia celiaca Topo HLA-DQ8/CD4 Topo DQ8-NOD Inibizione di cicloossigenasi (COX) in topi transgenici HLA-DQ8 sensibilizzati nei confronti della gliadina Transfer cellule T gliadina-specifiche in topi immunodeficienti Topo triplo transgenico HLA-DQ2/CD4/TCR Topo HLA-DQ8/IL15
19 Gliadina complessata al copolimero idrossietilmetacrilato (HEMA) - sodio 4 stirene sulfonato (SS): Effetto sulla tossicità della gliadina in un modello animale (topi CD4-DQ8)
20 Permeabilità intestinale come biomarker Studi con larazotide acetato La zonulina causa un aumento della permeabilità paracellulare. Il larazotide acetato è un octapeptide che inibisce la tossina da Vibrio Colerae contenente un elemento condiviso con la zonulina Il larazotide acetato inibisce la permeabilità indotta dal glutine in uno studio fase 1 controllato con placebo, randomizzato, della durata di una settimana I dati non sono stati confermati nella fase 2, sebbene la severità dei sintomi gastrointestinali sia risultata ridotta
21 Mobilizzazione nel sangue periferico di cellule T gliadino-speciiche dopo breve challenge in vivo con glutine Pazienti a dieta senza glutine hanno ingerito per 3 giorni 200gr di pane con grano Al giorno 0 e al giorno 6 dopo l inizio del challenge con il glutine sono state rilevate cellule mononucleate reattive alla gliadina nel sangue periferico IFN-γ ELISPOT dopo stimolazione in vitro con gliadina deamidata o peptidi della gliadina di ore IFN-γ ELISPOT Net IFN-γ- SFC/4x10 5 PBLs p=0,009 day 0 day 6 medium Gliadin-TG 17-mer-TG Anderson et al. Nature Medicine 2000, Camarca et al. Clin Exp Immunol 2012 Day0 Day
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23 Come testare l efficacia delle nuove terapie Test clinici Challenge a breve termine i. Permeabilità intestinale ii. Mobilizzazione di cellule T intestinali nel sangue periferico Challenge a lungo termine i. Marcatori di integrità epiteliale ii. Anticorpi celiachia-specifici iii.alterazioni immunoistopatologiche
24 Come testare l efficacia delle nuove terapie Test clinici In vivo (challenge prolungato) i. Marcatori di integrità epiteliale ii.anticorpi celiachia-specifici iii.alterazioni immunoistopatologiche Rapporto villo/cripta Depositi IgA antitransglutaminasi Analisi immunoistochimica (CD3, gammadelta)
25 Trial clinici: punti critici Glutine: durata esposizione e dose Endpoint: morfologia mucosale come misurarla? come standardizzarne la valutazione?
26 14 patients were randomised to gluten intake with either AN-PEP or placebo for 2 wk Measurements at baseline included complaints, quality-of-life, serum antibodies, immunophenotyping of T-cells and duodenal mucosa immunohistology. AN-PEP appears to be well tolerated. However, the primary endpoint was not met due to lack of clinical deterioration upon placebo, impeding an effect of AN-PEP.
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28 Challenge con glutine prolungato nel tempo L esempio di prodotti a base di glutine idrolizzato Un challenge di 60 giorni dimostra l assenza di tossicità, come dimostrato dai parametri serologici, morfometrici e immunoistochimici.
29 Farina predigerita Placebo
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31 Marcatori di integrità epiteliale
32 Conclusioni Molto lavoro è stato fatto, tuttavia nessun farmaco ancora disponibile Numerosi test preclinici e studi proof of concept Mancanza di affidabile modello animale
33 Conclusioni Studi clinici fattibili, ma ben disegnati (dose glutine da detossificare, durata esposizione, endpoint) Oggi gran parte degli approcci si propongono come aggiunta e non al posto della dieta senza glutine Ambiziosi i tentativi di immunomodulazione, ma sicurezza primo problema
34 Ringraziamenti Renata Auricchio Maria Vittoria Barone Salvatore Auricchio Carmen Gianfrani Luigi Greco Maria Maglio Giuseppe Mazzarella Mauro Rossi Virginia Salvati
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