UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PADOVA

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1 UNIVERSITA DEGLI STUDI DI PADOVA FACOLTA DI SCIENZE MM.FF.NN CORSO DI LAUREA IN BIOLOGIA MOLECOLARE ELABORATO DI LAUREA Gestione di analisi genomiche e biochimiche in Medicina Personalizzata TUTOR: Prof.ssa Fernanda Rigoni Dipartimento di Biologia CO-TUTOR: dott. Alessandro Buriani Data Medica Padova LAUREANDA: Sonia Keppel ANNO ACCADEMICO 2008/2009 1

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3 INDICE 1 Abstract Pag. V 2 STATO DELL ARTE Genomica predittiva Discipline omiche La Medicina Personalizzata La Medicina Personalizzata nella prevenzione e nella gestione del rischio trombotico Pag. 1 Pag. 1 Pag. 2 Pag. 2 3 APPROCCIO SPERIMENTALE Database informatici Preparazione dei campioni biologici Estrazione del DNA Genotipizzazione degli SNP Polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) Determinazione quantitativa della proteina C nel plasma e Resistenza della proteina C attivata Tempo di protrombina Tempo di tromboplastina parziale attivata Tempo di trombina Dosaggio dell Antitrombina III Test enzimatico per il dosaggio quantitativo dell omocisteina (HCy) Pag. 2 Pag. 5 Pag. 5 Pag. 5 Pag. 6 Pag. 6 Pag. 7 Pag. 7 Pag. 7 Pag. 7 Pag. 7 4 RISULTATI E DISCUSSIONE 5 Creazione del pannello di genomica predittiva per la trombofilia Creazione del pannello di farmacogenomica per la Terapia Anticoagulante Gestione di analisi genomiche e biochimiche in Medicina Personalizzata per valutare il rischio trombotico Conclusioni BIBLIOGRAFIA Ringraziamenti Pag. 8 Pag. 10 Pag. 12 Pag. 15 Pag. 16 Pag. 17 3

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5 Abstract Nell era post-genomica si sono sviluppate nuove discipline scientifiche e mediche, tra le quali la Medicina Personalizzata. Essa rappresenta un nuovo approccio bio-medico che, grazie all utilizzo diagnostico dei polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), è in grado di fornire pannelli analitici personalizzati di genomica predittiva e di farmacogenomica. Applicato a malattie multifattoriali, come la trombofilia, tale approccio scientifico è stato utilizzato in particolare nella ricerca delle suscettibilità genetiche al rischio trombotico. La selezione degli SNP è stata condotta attraverso un indagine bioinformatica nei principali database di riferimento. Gli SNP individuati sono stati quindi utilizzati per la formulazione di un pannello di genomica predittiva e di farmacogenomica, la cui applicabilità clinica è stata sperimentata attraverso l analisi di un paziente affetto da trombosi venosa profonda. I risultati hanno indicato la presenza di due fattori di rischio genetici e fornito un quadro farmacogenomico importante nella gestione della terapia anticoagulante orale. La validità dei risultati dell indagine di genomica predittiva è stata anche confermata dalle analisi biochimiche. Applicato in soggetti sani, in un contesto di Medicina Personalizzata, il pannello messo a punto è in grado di individuare soggetti a rischio trombotico, permettendo l attuazione di strategie di prevenzione pro-attiva e di monitoraggio diagnostico. 5

6 STATO DELL ARTE Genomica predittiva Le numerose scoperte derivate dal sequenziamento del Genoma Umano hanno permesso di determinare le caratteristiche e le peculiarità dell organizzazione del nostro genoma, scoprendo un identità di sequenza del 99.9% in tutti gli individui. La variabilità individuale, presente nel restante 0.1% della sequenza, si manifesta sotto diverse forme di variabilità nucleotidica: microsatelliti, regioni moderatamente ripetute, sequenze Alu e soprattutto, in frequenza molto maggiore, polimorfismi a singolo nucleotide (SNP). Le variazioni del DNA, nel loro complesso, oltre a costituire il fingerprint genetico di ogni persona, possono avere un importante impatto su come un individuo risponde ad una malattia o a determinati fattori ambientali, come batteri, virus, tossine e agenti chimici, compresi i farmaci. La maggior parte dei caratteri umani è determinata dall'intervento di più geni che spesso interagiscono tra loro e con l'ambiente. Attraverso l analisi funzionale dei geni presenti nel genoma umano (genomica funzionale) è stato possibile individuare le caratteristiche genetiche implicate nella patogenesi di molte malattie. Molti difetti congeniti e malattie dell'uomo sono il risultato infatti dell'interazione tra fattori genetici, spesso multipli, e fattori ambientali. Tali patologie prendono il nome di malattie multifattoriali: sono provocate da più fattori, compresi quelli ambientali, biologici, psicologici e sociali, al contrario delle malattie monogeniche come l emofilia, la talassemia, la fibrosi cistica e il daltonismo provocate invece solo da fattori genetici. La possibilità di ricercare marcatori molecolari nel DNA sottoforma di SNP mette a disposizione della medicina un importante metodo per risalire alle suscettibilità specifiche di un individuo. L analisi diagnostica degli SNP permette infatti di individuare suscettibilità genetiche a sviluppare determinate malattie, tale disciplina prende il nome di Genomica Predittiva [1]. Una branca della genomica predittiva, di grande importanza clinica, è la Farmacogenomica, che attraverso l analisi degli SNP implicati nei meccanismi di farmacocinetica (assorbimento e metabolismo dei farmaci) e farmacodinamica (attività biologica dei farmaci), permette di caratterizzare la capacità individuale di risposta ai farmaci [2]. Questo ha portato enormi benefici nella prevenzione delle malattie, sia per trovare il farmaco giusto, alla dose giusta e nei tempi più appropriati per ogni soggetto. Discipline omiche Il settore della genomica funzionale ha aperto nuovi orizzonti che promettono nel prossimo avvenire di poter monitorare le patologie in fase pre-clinica con crescente precisione attraverso l analisi globale di classi di molecole. Grazie alle discipline cosiddette -omiche, che si sono aggiunte alla genomica, è possibile studiare specifiche categorie di molecole all interno di determinati contesti biologici (cellule, tessuti, organi, o interi organismi). Queste comprendono: la proteomica (studio delle proteine), la trascrittomica (studio dei trascritti), la metabolomica (studio dei piccoli metaboliti), la lipidomica (studio degli acidi grassi) ed altre [3]. 6

7 Il termine proteomica indica l analisi delle proteine espresse in un determinato sistema biologico che nel loro insieme formano il proteoma. E una disciplina più complessa della genomica a causa del fatto che il proteoma differisce da cellula a cellula. La metabolomica o studio del metaboloma, analizza i piccoli metaboliti presenti nei liquidi organici, nei tessuti o nelle cellule, rivelando il profilo metabolico e riportando precise informazioni sulle funzioni dei sistemi biologici in esame. La lipidomica è lo studio dell assetto lipidico, la cui variazione può fornire importanti informazioni sul funzionamento dei sistemi biologici candidati ad identificare determinate malattie, anche a livello pre-clinico [10]. Infine devono essere menzionate l interattomica, comprendente la totalità delle interazioni molecolari che hanno luogo in un organismo, la trascrittomica incentrata sull'insieme degli mrna trascritti nell'intero organismo, tessuto o cellula, ed in fine la microbiomica che ha il fine di caratterizzare gli organismi microbici presenti nell organismo umano, capaci di interagire con lo stato di salute dell uomo. Caratteristica comune di queste nuove discipline è la visione d insieme rivolta ai sistemi biologici, considerati non come entità a sé, ma visti nel loro insieme, anche attraverso le interazioni dinamiche delle parti di cui sono composti, grazie ad un impostazione propria della Biologia dei Sistemi (Systems Biology) [3]. La Medicina Personalizzata Proprio grazie alla capacità della genomica predittiva, della farmacogenomica e delle altre discipline omiche, di adattare la diagnosi e la terapia all individuo in analisi, è stato coniato il termine Medicina Personalizzata, per indicare questo nuovo approccio della medicina verso il paziente [4]. Attraverso lo studio dei fattori di rischio di ciascun individuo, la Medicina Personalizzata si pone non solo l obiettivo di curare, ma soprattutto di mantenere l equilibrio dello stato di salute, attuando due strategie: una rivolta a ridurre i fattori di rischio ambientali e comportamentali, favorendo i fattori protettivi nell alimentazione o nelle strategie terapeutiche; l altra attraverso il monitoraggio diagnostico di specifici parametri che caratterizzano la fase pre-clinica della malattia di cui sia stata individuata una suscettibilità genetica, permettendone l individuazione precoce. Nel caso in cui la malattia raggiunga lo stato clinico, la Medicina Personalizzata, grazie alla farmacogenomica, è poi in grado di individuare la terapia più efficace e con meno effetti collaterali. La Medicina Personalizzata nella prevenzione e nella gestione del rischio trombotico Il termine trombofilia indica una condizione patologica in cui si verificano alterazioni della coagulazione del sangue che, a causa dello squilibrio in senso iper-coagulante, inducono la formazione di coaguli nei vasi sanguigni, ostacolando il flusso del sangue e provocando trombosi. La trombofilia non è una malattia ma piuttosto una condizione che predispone alla trombosi, capace di aumentare l indice di rischio trombotico a seconda del tipo di alterazione presente. La maggior parte delle alterazioni trombofiliche oggi note, sono congenite e trasmissibili ai figli da parte del genitore affetto, grazie ad una 7

8 trasmissione ereditaria nella quale la condizione omozigote è molto rara e comporta un maggior rischio trombotico rispetto alla condizione di eterozigosità [5]. I principali fattori di rischio, oltre alla componente genetica, sono l obesità, l ipertensione, il fumo, la dislipidemia, il diabete, l uso di contraccettivi orali e una prolungata immobilità fisica. La ricerca scientifica degli ultimi anni ha permesso di effettuare notevoli progressi nella conoscenza dei meccanismi molecolari e cellulari responsabili dei fenomeni trombotici, mentre uno dei principali progressi della biologia molecolare è stata l identificazione dei geni responsabili della predisposizione alla trombosi. Dai dati dell Istituto Nazionale di Statistica ISTAT risulta che tra il 2006 e il 2007 le malattie cardiovascolari hanno provocato il 35% dei decessi registrati in Italia (vedi Figura 1), risultando la principale causa di morte nella popolazione. Figura 1. Rappresentazione grafica dei dati ottenuti dai registri pubblici ISTAT. Riporta le cause dei decessi in percentuale, registrati nell anno nella popolazione italiana. Sono escluse le morti avvenute al di sotto del primo anno di vita. La possibilità di limitare l incidenza e i danni delle malattie cardiovascolari è un obiettivo medico e scientifico altamente significativo. Grazie alla Medicina Personalizzata, ed in particolare alla Genomica Predittiva e alla Farmacogenomica, questo obiettivo è oggi sempre più vicino. In questo studio verranno progettati pannelli diagnostici di Medicina Personalizzata, in particolare un pannello di Genomica Predittiva per la rilevazione delle suscettibilità ed anche un pannello di Farmacogenomica per individuare terapie personalizzate. A questi pannelli ne verranno aggiunti altri di tipo biochimico, in grado di rilevare altri fattori di rischio trombotico e di dare un quadro attuale della condizione trombotica del paziente. APPROCCIO SPERIMENTALE In questo lavoro sperimentale sono stati usati due differenti tipologie di materiali: materiale informatico (database di carattere medico-scientifico) e materiali analitici (esami di laboratorio). Database bioinformatici Per individuare i polimorfismi da inserire nei pannelli di diagnostica predittiva, si è fatto ricorso ad una ricerca bioinformatica. Questa ha richiesto l uso e la comprensione funzionale di diverse banche dati scientifiche internazionali, nelle quali si sono ricercate tutte le informazioni relative ai polimorfismi e alle correlazioni degli SNP con la patologia di interesse. Tra i numerosi database presenti nel web si è limitata la ricerca a soli quattro di essi, ritenuti i principali. 8

9 National Center for Biotechnology Information (NCBI): risorsa informatica di indirizzo biologico e molecolare di pubblica consultazione, comprendente a sua volta diversi database tra i quali PubMed dove è possibile consultare interi articoli di ricerca pubblicati nelle riviste scientifiche, e il database Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) contenente i geni scoperti nel genoma umano e le malattie genetiche. ( Il database OMIM è un catalogo di geni umani e di malattie genetiche, che fornisce numerosi e dettagliati link alla letteratura, alle mappe, alle sequenze geniche e agli altri database ad esso collegati. Nato inizialmente come un catalogo dei fenotipi umani, intitolato Mendelian Inheritance in Man, è ora presente in versione online costantemente aggiornata. La ricerca di informazioni può svolgersi su tre diversi livelli: base (vedi Figura 2), avanzato e con gli operatori Booleani AND, OR, NOT. Figura 2. Pagina web del sito NCBI. Rappresenta la ricerca base ottenuta digitando il termine thrombosis nel motore di ricerca OMIM. GeneCards: banca dati che fornisce dettagliate informazioni genomiche, proteomiche e funzionali sui geni umani. Permette di ottenere informazioni su mutazioni, SNP, espressione genica e processi biologici, compresi i dati sulla sequenza nucleotidica, le varianti alleliche presenti nelle diverse popolazioni, dati statistici e numerose correlazione tra geni e patologie ( Per ciascun gene sono annotate informazioni sui domini proteici, le modificazioni post-traduzionali, la funzione genica, la localizzazione genomica e il ruolo funzionale noto in condizioni fisiologiche e patologiche. Figura 3. Densità genica del cromosoma 1, con il locus del gene FV evidenziato in rosso; le bande sono state definite in accordo con Ensembl, la localizzazione con GeneLo. Figura prelevata dal DataBase GeneCard. VegaHuman: raccoglie tutte le informazioni presenti sul genoma umano, mettendo a disposizione numerosi collegamenti ipertestuali tra diversi motori di ricerca (GenBank, EMBL, DDBJ, UCSC). Per ciascuna voce ricercata, visualizza lo specifico accession number (ID) identificativo nei diversi collegamenti a cui fa riferimento, compreso il visualizzatore ExPASy della struttura proteica. Viene aggiornato manualmente. ( 9

10 Hugo (HUman Genome Organization): database contenente informazioni su più di geni, la maggior parte codificanti proteine ma anche pseudogeni. È probabilmente il database di maggior rilevanza clinica, nato da una collaborazione mondiale di numerosi istituti di ricerca che mettono in rete, in tempo reale, aggiornamenti sulle associazioni tra SNP e malattie, la cui finalità è proprio quella di facilitare e velocizzare il trasferimento delle conoscenze genomiche alla pratica clinica. Fornisce numerosi collegamenti ipertestuali a tutti gli altri database internazionali. ( Preparazione e gestione dei campioni biologici I campioni di sangue analizzati vengono raccolti tramite venipuntura e collocati in provette. Le analisi biochimiche dell ematologia vengono svolte su campioni di plasma trattato con l anticoagulante citrato di sodio 0,109 mol/l. Le analisi genomiche e di quantificazione dell omocisteina necessitano invece di campioni di sangue intero trattato con l anticoagulante EDTA. In entrambi i casi, i campioni subiscono centrifugazione a 1500g per 15 minuti, e vengono analizzati entro quattro ore, altrimenti vengono congelati e conservati per un massimo di due settimane. Il laboratorio Data Medica Padova è dotato di sistemi altamente robotizzati e automatizzati che in seguito alla preparazione dei campioni biologici, ne permettono la manipolazione pre-analitica ed analitica. Estrazione del DNA Nell estrazioni del DNA è stato utilizzato il kit Eurogold Blood Kit DNA. Tale kit è ottimizzato per un emolisi e una rimozione efficiente di emoglobina e fornisce un metodo rapido e semplice per l'isolamento fino a 30 µg di DNA genomico. Per la lisi delle cellule si è utilizzato: 400 µl CL Buffer per 1 x 10 7 cellule e 25 µl OB Protease. Poiché in seguito a centrifugazione, il surnatante ottenuto contiene DNA genomico ed RNA, viene aggiunto RNase A (20 mg/ml). Per caricare il DNA estratto su colonna si è aggiunto: 200 µl CL Buffer, alcool isopropilico, 220 µl di etanolo. Vengono caricati 750 µl della soluzione ottenuta (compreso i precipitati) in una provetta 2 ml. Segue l aggiunta di Buffer leganti il DNA e di lavaggi. L efficienza dell estrazione è leggermente migliore se la colonna, prima della centrifugazione, viene incubata a 70 C piuttosto che a temperatura ambiente. L estrazione ottiene in media 8-30 µg di genomico in 1x10 7 cellule. Genotipizzazione degli SNP La PCR viene eseguita in un volume di 50 µl con il kit Duplica Real time Genotyping Kit, e con un unità di Taq polimerasi. Ogni kit contiene un primer 5-3, un primer 3-5 specifico per l allele wildtype, un primer 3-5 specifico per l allele mutato. Nel caso degli SNP associati alla trombosi, si è utilizzato il seguente protocollo di genotipizzazione: aggiungere 45 µl di Master Mix (22,5 µl di Amplification Mix, 22,5 µl di Oligo Mix) e 5 µl di DNA. Dopo un iniziale denaturazione (94 C per 5 min) seguono 30 cicli: denaturazione (94 C per 15 sec.), annealing (58 C per 30 sec.), estensione (72 C per 30 sec.) segue l estensione finale (72 C per 5 min). 10

11 I frammenti di DNA amplificati sono: per la mutazione del Fattore II l allele wildtype di 177 bp, l allele mutato 199 bp, per lo SNP in posizione 1691 del Fattore V l allele wild type è di 123 bp mentre quello mutato di 148 bp, per lo SNP del gene MTHFR in posizione 677 il wild type è di 148 bp mentre il frammento con lo SNP è di 173 bp. Successivamente all amplificazione, l individuazione degli SNP avviene con metodo RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) per i geni FV, FII, MTHFR, FBG, ITGβ e CYP2C9 in gel di agarosio al 3%. Nella genotipizzazione del gene VKORC1 viene invece utilizzato sequenziamento diretto. Polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) Tali variazioni della sequenza nucleotidica sono evidenziabili nel genoma ogni 300 basi circa, sia nelle regioni non codificanti, che in quelle codificanti. Spesso sono associati con alterazioni delle funzioni cellulari, talvolta predisponendo la persona a manifestare particolari fenotipi patologici, oppure influenzando la risposta all assunzione di farmaci. Gli SNP scelti come marcatori nel presente studio, sono polimorfismi dei geni codificanti i principali fattori che partecipano al processo coagulativo. Essi possono essere semplicisticamente suddivisi in loss-of-function mutations degli anticoagulanti naturali, gain-of-function mutations dei fattori procoagulanti e in anomalie responsabili di una generalizzata decreased fibrinolytic function. Determinazione quantitativa della proteina C e Resistenza della proteina C attivata Lo strumento utilizzato per questi test di coagulazione e per i successivi, esclusa l analisi quantitativa dell omocisteina, è l analizzatore automatico Sysmex CA con metodiche coagulative, cromogeniche ed immunologiche. Il dosaggio della proteina C in campioni di plasma umano viene monitorato mediante metodo cromogenico grazie al kit Spectrolyse Protein C. Tale kit contiene i seguenti reagenti: anticorpo anti-proteina C umana di pecora, attivatore liofilizzato da veleno di vipera Agikistrodon Contortix, substrato della proteina C e additivo del substrato. La procedura consiste in: aggiungere 100 µl di anticorpo anti-proteina C, 100 µl di campione di plasma e incubare la soluzione a 37 C per 2 minuti; aggiungere 200 µl di attivatore e incubare a 37 C per 5 minuti; aggiungere 200 µl di substrato e incubare a 37 C per 10 minuti. In una cuvetta da 1cm viene letta l assorbanza a 405 nm, dopo aver azzerato sul bianco lo spettrometro con acqua deionizzata. L assorbanza ottenuta in presenza dell anticorpo viene sottratta dall assorbanza ottenuta in assenza dell anticorpo per correggere l eventuale attività amidolitica indipendente dalla proteina C. Il test funzionale che determina l attività della proteina C è denominato APC e utilizza il kit Pefakit APC-R FactorV Leiden. Il campione di plasma in esame viene diluito con plasma carente del fattore V fornito dal Kit, in modo tale da ottenere un risultato strettamente correlato alle alterazioni del fattore V, in particolar modo alla mutazione di Leiden. La coagulazione del campione viene innescata attraverso l aggiunta di un attivatore della protrombina estratto dal veleno di serpente Notechis scutatus in assenza di calcio, eliminando le interferenze da parte dell eparina grazie all aggiunta di particolari reagenti. Si registra il tempo della formazione del coagulo alla presenza dei due diversi reagenti della proteina C e si calcola la Ratio tra i due tempi ottenuti. 11

12 Tempo di protrombina Il test PT misura il tempo di coagulazione del plasma e utilizza il kit TROMBOPLASTINA-S.. Tale test misura la coagulazione del plasma dopo aggiunta di tromboplastina liofila estratta da cervello di coniglio contenente Calcio Cloruro. Il reagente fornisce tromboplastina tessutale che attiva la cascata coagulativa. Il valore che si ottiene in seguito a lettura foto-ottica ottica è espresso in INR (Rapporto Internazionale Normalizzato) per standardizzare i risultati del test in soggetti in terapia con farmaci anticoagulanti orali. Tempo di tromboplastina parziale attivata Il test APTT misura il tempo di coagulazione del plasma. Si è utilizzato il kit APTT-EA,, ed è stata seguita la seguente procedura: aggiungere 0,1 ml di reagente APTT-EA in 0,1 ml di plasma, incubare a 37 C per 3 minuti; aggiungere 0,1 ml di calcio cloruro preriscaldato e rilevare il tempo di formazione di coaguli, in secondi. Il valore ottenuto è espresso in secondi e Ratio. Tempo di trombina Il TT misura il tempo di coagulazione indotto da trombina bovina in presenza di calcio nel plasma e permette di analizzare l attività dell antitrombina. La procedura del test consiste nell incubare 100 µl l di plasma intero a 37 C per 3 minuti e aggiungere 50 µl del reagente trombina bovina. Il valore deriva da una lettura foto-ottica ottica e viene espresso in secondi o Ratio. Dosaggio dell Antitrombina III Il dosaggio cromogenico per la determinazione quantitativa dell antitrombina III misura l assorbanza a 405 nm. 15 µl l di plasma intero vengono diluiti in rapporto 1:8 con 105 µl l di tampone diluente. Segue una seconda diluizione 1:40. Vengono aggiunti 50 µl di reagente trombina e prima della lettura a 405 nm viene incubata la soluzione a 37 C per un minuto con 50 µl di substrato trombina. Test enzimatico per il dosaggio quantitativo dell omocisteina (HCy) nel siero L'omocisteina è un aminoacido solforato che si forma in seguito a perdita di un gruppo metilico da parte della metionina. Le alterazioni del metabolismo della metionina sono provocate da diverse cause di base genetica, nutrizionale, endocrina o farmacologica. Un livello elevato di omocisteina nel sangue (iperomocisteinemia) è considerato un fattore tore di rischio accertato per le malattie cardiovascolari, compresa la trombosi [5]. Il test enzimatico Homocystein T(Hcy) Minias prevede il dosaggio quantitativo dell omocisteina (HCy) attraverso una cascata di reazioni enzimatiche che portano ad una diminuzione di assorbanza a 340 nm dovuta all ossidazione del NADH a NAD+ rilevabile spettrofotometricamente. Il campione analizzato è costituito da 15 µl l di sangue intero trattato con EDTA il quale dopo l aggiunta di 30 µl di reagente R2, viene incubato per 2 minuti. Prima della lettura allo spettrofotometro, vengono aggiunti 25 µl l di R3 e incubati per 3 minuti. I risultati sono espressi ssi in micromoli/litro (µmol/l). 12

13 RISULTATI E DISCUSSIONE Creazione del pannello di genomica predittiva per la trombofilia Il pannello genomico messo a punto in questo studio definisce quali SNP rappresentano un aumentato rischio trombotico nella popolazione caucasica europea. La precisazione della provenienza geografica dei pazienti a cui è destinata tale indagine, risulta essere un dato di primaria importanza poiché la correlazione tra un dato SNP e la patologia, dipende strettamente dalle frequenze dei polimorfismi [6]. Tali frequenze possono infatti variare in base alla provenienza geografica e all etnia. I criteri utilizzati per la selezione dei geni inseriti nel seguente pannello hanno considerato: la presenza degli SNP nei database di maggior riferimento nell ambito genomico, l affidabilità statistica degli studi usati per definire le frequenze degli SNP, la quantità di informazioni presenti sulle più importanti riviste scientifiche, il numero e la qualità degli studi di associazione e di metaanalisi svolti per confermare l associazione tra SNP e manifestazione trombotica ed infine la particolare prevalenza della mutazione nella popolazione caucasica europea. La correlazione tra patologia trombotica e sequenze geniche riguarda singoli nucleotidi, ed ha permesso la realizzazione della seguente lista di polimorfismi: GENE SNP Ricercato Fattore V G1691A Il polimorfismo del gene Fattore V determina la sostituzione di una guanina con un adenina, in posizione 1691 del gene, e la traduzione, in posizione 506, di una glutammina al posto della normale arginina, all interno di uno dei siti proteolitici su cui agisce la proteina C attivata. Questo polimorfismo provoca una maggiore attività pro-coagulante del fattore V attivato, causata dall impossibilità da parte della proteina C di tagliare il fattore a livello del sito 506, determinando una resistenza alla proteina C attivata (APC) che predispone al rischio trombotico. La variante G1691A, definita variante di Leiden (località in cui fu scoperta) ha una frequenza genica del 1,4-4,2% in Europa con un gradiente decrescente da nord a sud. La frequenza di portatori eterozigoti in Italia è pari al 2-3% della popolazione, mentre l omozigosità per tale mutazione ha un incidenza di 1 su I soggetti eterozigoti hanno un rischio 8 volte superiore rispetto alla norma di sviluppare una trombosi venosa, mentre gli omozigoti hanno un rischio pari ad volte [5]. GENE SNP Ricercato Fattore V A4070G Il polimorfismo A4070G nell esone 13 del gene FV, determina la sostituzione di un arginina al posto di un istidina nella posizione 1299 del dominio B del Fattore V. Diversi studi hanno confermato una sua associazione con il fenotipo Resistenza alla proteina C attivata e con fenomeni trombotici. GENE SNP Ricercato Fattore V A5279G Il polimorfismo A5279G consiste nella sostituzione di un adenina con una guanina in posizione 5279 del gene, ed è piuttosto frequente nella popolazione 13

14 italiana. Questo SNP comporta la sostituzione a livello proteico di una tirosina con un residuo di cisteina nella posizione amminoacidica Evidenze cliniche associano la mutazione A5279G ad un rischio trombotico aumentato di 3-4 volte. GENE SNP Ricercato Fattore II G20210A In posizione della regione 3 non trascritta del gene della protrombina, è stato descritto uno SNP caratterizzato dalla sostituzione di una guanina con una adenina. Questo polimorfismo è coinvolto nella regolazione genica posttrascrizionale, conferendo stabilità all mrna, ed è associato ad un aumento di circa il 30% dei livelli plasmatici di protrombina. La modalità di trasmissione ereditaria è di tipo autosomico dominante. Questa variante ha una prevalenza in Europa del 3-5%, con un gradiente crescente da nord (2-5%) a sud (3-7%), mentre è molto rara in Africa e Asia. E stata misurata una presenza del 18% dello SNP negli individui affetti da trombosi [5]. La frequenza degli omozigoti è estremamente bassa. I soggetti eterozigoti hanno un rischio circa 3 volte superiore rispetto alla popolazione generale di sviluppare una trombosi venosa. GENE SNP Ricercato Beta-fibrinogeno G455A Il polimorfismo presente all interno del promotore del gene codificante il fibrinogeno, consiste nella sostituzione di una adenina al posto di una guanina nella posizione nucleotidica 455 ed è associato ad un maggior rischio di manifestare trombosi venose profonde, conseguente al legame costitutivo del fibrinogeno all endotelio. GENE SNP Ricercato Integrina beta-3 T1565C Nell esone 2 del gene ITGB3 si è individuato un polimorfismo direttamente associato con eventi trombotici. Tale gene codifica per un recettore di membrana che media l interazione tra piastrine e fibrina, determinando la formazione del tappo piastrinico. Il polimorfismo T1565C determina la sostituzione di una prolina in posizione 33 al posto della leucina. GENE MTHFR SNP Ricercati C667T A1298C Il polimorfismo in posizione 667 del gene MTHFR rappresenta una variante termolabile dell enzima codificato, con una sostituzione di una citosina a timina, ed una alanina con una valina nella sequenza amminoacidica. Il polimorfismo in posizione 1298 consiste nella sostituzione dell adenina in citosina e di un glutammato con una alanina. Entrambi questi polimorfismi hanno una trasmissione autosomica recessiva e si associano ad una ridotta attività dell enzima MTHFR che determina un aumento dei livelli plasmatici di omocisteina. La prevalenza dello SNP C667T in Europa è del 3-3,7%. 14

15 Fattori di cui si sono selezionati i polimorfismi nel pannello di Genomica predittiva: Il Fattore V attivato è un cofattore essenziale per l'attivazione della protrombina a trombina. Il suo effetto pro-coagulante è normalmente inibito dalla Proteina C attivata, che taglia il fattore V in tre parti, degradandolo; La Protrombina, o Fattore II della coagulazione, svolge un ruolo fondamentale nella cascata coagulativa in quanto la sua attivazione a trombina, porta alla trasformazione del fibrinogeno in fibrina e quindi alla formazione del coagulo; Il beta-fibrinogeno, precursore della fibrina, è presente nel plasma sanguigno sotto forma di proteine dimeriche. Il fibrinogeno è essenziale nella coagulazione del sangue poiché, attraverso un processo di polimerizzazione, viene convertito in fibrina dalla trombina, inducendo così la formazione del trombo emostatico; Figura 4. Rappresentazione schematica della cascata coagulativa del sangue. I fattori coagulanti sono indicati da un numero romano o da un nome. Le frecce in rosso evidenziano i fattori anticoagulanti, le frecce in verde la via fibrinolitica. L Integrina beta-3 è una glicoproteina integrale delle membrane cellulari, che lega le proteine della matrice extracellulare. Svolge un ruolo fondamentale nell adesione delle piastrine durante la loro attivazione, stabilizzando il tappo piastrinico grazie alla salda interazione con il collagene e il fibrinogeno; Il Metilenetetraidrofolatoreduttasi è un enzima coinvolto nella conversione del 5,10-metilenetetraidrofolato in 5-metiltetraidrofolato. Tale reazione enzimatica permette la conversione dell omocisteina a metionina grazie al trasferimento di gruppi metile, risultando fondamentale per impedire l accumulo di omocisteina nel sangue. Figura 5. Rappresentazione schematica del processo metabolico dell omocisteina nel sangue. Creazione del pannello di farmacogenomica per la Terapia Anticoagulante La Terapia Anticoagulante Orale (TAO) viene prescritta in seguito alla manifestazione di un evento trombotico e il suo dosaggio deve essere attentamente monitorato per scongiurare sovradosaggi con un aumentato rischio emorragico, o sottodosaggi con conseguente inefficacia nella profilassi anti- 15

16 trombotica. La metabolizzazione del farmaco warfarin, è molto variabile e soggettiva e dipende spesso dalla presenza di determinati polimorfismi. La presenza e/o la combinazione dei polimorfismi nel gene del citocromo P450-2C9 e del gene della vitaminak-epossido Reduttasi, determinano variazioni importanti nella risposta terapeutica al warfarin, perciò risulta molto utile sottoporre i pazienti ad un indagine farmacogenomica. GENE SNP Ricercati CYP2C9 C3608T (*2) A42614C (*3) Il gene CYP2C9, localizzato nel locus cromosomico 10q24, codifica per il complesso del citocromo P450-2C9 e presenta numerose mutazioni puntiformi. Il polimorfismo C3608T determina, in posizione 144, una sostituzione di un residuo di arginina con una cisteina, mentre il polimorfismo A42614C è caratterizzato da una isoleucina in posizione 359 al posto di un residuo di leucina. Tali polimorfismi sono associati ad una ridotta metabolizzazione del warfarin, che ha quindi un emivita più lunga e richiede un dosaggio più basso per non esporre i soggetti a complicazioni emorragiche [9]. Esistono precise correlazioni genotipo-fenotipo per una migliore gestione delle cure farmacologiche prescritte al singolo paziente. Data l elevata frequenza dei polimorfismi del CYP2C9, l analisi del genotipo trova un ruolo fondamentale nella messa a punto del trattamento farmacologico con il warfarin. GENE SNP Ricercati VKORC1 G1639A C1173T G3730A Nel gene VKORC1 la cui corsa elettroforetica è riportata come esempio nella figura sottostante, sono presenti decine di polimorfismi e tra i più frequenti ci sono lo SNP G1639A e lo SNP C1173T associati ad una minor espressione ed attività dell enzima. La presenza di questi tre SNP è considerata predittiva della variabilità di risposta al trattamento con warfarin, poiché ne altera la sensibilità al farmaco. Fattori proteici di cui si sono selezionati i polimorfismi nel pannello di Farmacogenomica Il CYP2C9, uno dei membri della famiglia dei Citocromi P-450, è responsabile del metabolismo di circa il 16% dei farmaci attualmente in commercio, ed ha funzione di ossidazione ed eliminazione di sostanze endogene ed esogene. E importante per il metabolismo di molti farmaci aventi un range terapeutico ristretto, come gli anticoagulanti Warfarin e Acenocumarolo. L enzima vitamina K-Epossido Reduttasi è implicato nella sintesi di fattori coagulativi vitaminak-dipendenti e costituisce il bersaglio proteico del warfarin. La vitamina K agisce come coenzima di questa ossido-reduttasi durante la carbossilazione di residui di acido glutammico, determinando l attivazione di proteine, tra le quali la protrombina. 16

17 Gestione di analisi genomiche e biochimiche in Medicina Personalizzata, per valutare il rischio trombotico Una volta messi a punto i pannelli di Genomica predittiva e di Farmacogenomica, sono stati utilizzati per creare un profilo diagnostico di Medicina Personalizzata, con lo scopo di caratterizzare l individuo, in modo da valutarne complessivamente lo stato di salute o il rischio di malattia e al tempo stesso di poter valutare le corrispondenze funzionali alle eventuali alterazioni geniche. A tal fine, ai pannelli di genomica sono stati aggiunti altri parametri di tipo biochimico, che vengono oggi utilizzati per il monitoraggio patologico. Queste analisi valutano un noto fattore di rischio trombotico, l omocisteina, un pannello di lipidomica, che può essere associato al rischio trombotico, e gli altri esami di routine, che in diagnostica ematologica sono normalmente usati su pazienti trombofilici. L insieme di tutti i pannelli analitici fornisce il profilo di rischio trombotico e, al tempo stesso, una valutazione attuale del rischio per il monitoraggio diagnostico. Il profilo diagnostico di Medicina Personalizzata è stato quindi eseguito su un paziente già noto aver subito un evento trombotico, per verificarne l efficacia e fornire un esempio di gestione di indagine diagnostica di questo nuovo approccio di Medicina Personalizzata. La gestione delle analisi eseguite in seguito ad un improvviso fenomeno trombotico, in un paziente al di sotto dei 50 anni, con un anamnesi familiare positiva a tali eventi, non ha quindi avuto alcun scopo predittivo, ma piuttosto ha confermato il sospetto clinico delle concause genetiche. Tale paziente è stato sottoposto all individuazione dei polimorfismi presenti nel pannello di Genomica Predittiva sopra descritto, confermando, in questo caso, l associazione tra manifestazione trombotica e presenza di SNP, indici di una specifica suscettibilità. Si è ottenuto la seguente conclusione diagnostica: REFERTO GENOMICA PREDITTIVA GENE GENOTIPO Fattore V G1691A GG Wild type Fattore V A4070G AA Wild type Fattore V A5279G AA Wild type Fattore II G20210A GG Wild type Beta Fibrinogeno G455A GA Eterozigote mutato Integrina Beta3 T1565C TT Wild type MTHFR C677T: TT Omozigote mutato MTHFR A1298C AA Wild type Sulla base degli studi presenti in letteratura, un tale profilo genetico positivo per due polimorfismi, non è considerato raro [5]: presenta il polimorfismo in posizione 455 del gene FBG in eterozigosi e il polimorfismo in posizione 677 del gene MTHFR in omozigosi. I due polimorfismi causano l alterazione di vie metaboliche diverse: uno altera la cascata coagulativa con il legame costitutivo del fibrinogeno all endotelio, e l altro l ossidoriduzione dell omocisteina con una ridotta attività enzimatica del Metilenetetraidrofolato Reduttasi. Entrambi i polimorfismi presenti, sono associati ad un aumentato rischio trombotico. Le analisi del DNA non sono però l unico strumento della Medicina Personalizzata usato per individuare una suscettibilità trombotica al fine di ridurne 17

18 o ritardarne la manifestazione. A tale scopo quindi è stata condotta l analisi quantitativa dell omocisteina nel sangue, mediante Cromatografia ad Alta Risoluzione (HPLC) [8]. L esame ha dato i seguenti risultati: VALORE OMOCISTEINA VALORE NORMALITA 29.6 µmol/l 3 15 µmol/l Il valore al di sopra della soglia di normalità, manifesta pienamente il genotipo omozigote per la mutazione 677 del gene MTHFR. Il fenotipo si manifesta quindi in un incapacità di riconvertire l omocisteina a metionina, determinando così elevati livelli di omocisteina circolante nel sangue (iperomocisteinemia), che determina un fattore di rischio per eventi trombotici. Un altro importante parametro che è associato ad un aumentato rischio trombotico, è stato individuato dall analisi lipidomica, in particolare dall analisi dell Ossidazione lipidica delle membrane eritrocitarie. La composizione di questa membrana è infatti rappresentativa dello stato di salute dell organismo, fornendo una misura dello stato ossidativo delle membrane [8, 10]. Questo esame biochimico è stato condotto e gestito dal laboratorio di lipidomica Lipinutragen Srl, che ha fornito il seguente pannello lipidomico: ACIDI GRASSI Valori trovati (%) Valori normali (%) Palmitico (16:0) Palmitoleico (16:1) Stearico (18:0) Oleico (18:1) Vaccenico (18:1) Linoleico omega6 (18:2) Eicosatrienoico omega (20:3) Arachidonico omega6(20:4) EPA omega3 (20:5) DHA omega3 (22:6) Tot. saturi (SFA) Tot. monoinsaturi (MUFA) Tot. poliinsaturi (PUFA) Trans 18: Trans-ARA TotalTRANS INDICE DI SQUILIBRIO NELLA BIOSINTESI LIPIDICA SFA / MUFA omega6 / omega EFA deficiency Il risultato ottenuto ha messo in evidenza una condizione specifica, indicativa dell aumento di rischio trombotico, in quanto gli acidi saturi sono in eccesso 18

19 rispetto ai monoinsaturi, come anche il valore di acido arachidonico. Questa condizione complessiva può associarsi ad un aumento dei livelli di colesterolo sierico e dello stato infiammatorio, che rappresentano importanti fattori di rischio cardiovascolare. I risultati della lipidomica sono coerenti con i dati provenienti dall analisi sierica dell assetto lipidico, in cui sono risultati elevati i valori di colesterolo totale e LDL (Low Density Lipoproteins) [dati non riportati]. L indagine diagnostica si completa infine con l analisi dei fattori della coagulazione. Anche in questo caso, i risultati ottenuti, piuttosto che un valore predittivo, hanno avuto lo scopo di confermare l efficacia e la predittività del pannello genomico messo a punto, ed hanno permesso di trovare riscontri biochimici coerenti con i polimorfismi trovati. ESAMI DI LABORATORIO VALORI TROVATI VALORI DI RIFERIMENTO ANTIGENE PROTEINA C 82,6% 75,5% 108,9% APC-R 3.2 Ratio >2.2 TEMPO TROMBOPLASTINA 27 sec 0.9 Ratio sec Ratio TEMPO DI TROMBINA 22 sec sec TEMPO DI PROTROMBINA 1 INR INR ANTITROMBINA III 86.2% 75%- 125% FIBRINOGENO 530 mg/dl mg/dl Complessivamente le indagini biochimiche hanno confermato le indagini genomiche, evidenziando un aumento del fibrinogeno, causato evidentemente dalla mutazione del gene FGB e dimostrando l efficacia del sistema nell individuare importanti fattori di rischio che possono essere utilizzati nella prevenzione anti-trombotica. Considerati assieme alla mutazione dell enzima dell omocisteina, i risultati dell indagine di Medicina Personalizzata forniscono un esauriente quadro in grado di giustificare l evento trombotico. REFERTO GENOMICA PREDITTIVA GENE GENOTIPO VKORC1 G1639A GA Eterozigote mutato VKORC1 C1173T CT Eterozigote mutato VKORC1 G3730A GG Wild type CYP2C9 C3608T CT Eterozigote mutato CYP2C9 A42614C AA Wild type I risultati di Farmacogenomica indicano che sono presenti tre polimorfismi: uno sul gene CYP2C9 2* e due sul gene VKORC1. La positività in eterozigosi del polimorfismo C3608T (*2) sul gene CYP2C9, si associa ad una ridotta attività dell enzima citocromo P450-2C9 [9], e questo si traduce in un lento metabolismo della classe di farmaci, che come il warfarin, vengono metabolizzati attraverso questa via enzimatica. La positività in eterozigosi di due polimorfismi (G1639A e C1173T) sul gene VKORC1 si associa ad un alterata sensibilità dell enzima 19

20 vitaminak-epossido Reduttasi all azione degli anticoagulanti orali [9]. Nel contesto del trattamento, questo genotipo può complessivamente influenzare la corretta determinazione della dose terapeutica iniziale e, per i farmaci con un ristretto profilo terapeutico come gli anticoagulanti, può dar luogo ad un iperdosaggio o ad un incapacità di mantenere l efficacia terapeutica. La dose terapeutica iniziale deve quindi essere calcolata sulla base di questo assetto genetico. Conclusioni Attualmente la Medicina Personalizzata non ha ancora avuto un ampia applicazione nel sistema sanitario italiano, ma le strutture di ricerca più avanzate e alcuni centri sanitari privati hanno già cominciato ad applicare questa nuova disciplina, nonostante la radicata diffidenza presente nell ambiente medico. I risultati diagnostici ottenuti nel presente studio confermano che la ricerca condotta ha permesso di ottenere risultati positivi riguardo alla validità clinica dei geni considerati per il rischio trombotico. Lo stesso pannello genomico eseguito su un paziente non ammalato, avrebbe quindi potuto predire un alto grado di suscettibilità alla malattia trombotica e raccomandare adeguate cure terapeutiche nell ambito di un quadro di Medicina Personalizzata. I test genetici utilizzati per valutare la suscettibilità a patologie, vengono condotti prima della comparsa dei sintomi clinici, e grazie alla multi-fattorialità della patologia, è eventualmente possibile ridurre i fattori di rischio non genetici e adottare regimi specifici di monitoraggio diagnostico per iniziare tempestivamente eventuali terapie antitrombotiche. La predizione alla suscettibilità trattata, conferisce utilità clinica unicamente alla patologia trombotica e agli specifici polimorfismi dichiarati. La nuova era della Medicina Personalizzata ha inoltre consentito lo sviluppo di un ruolo innovativo della figura del Biologo Molecolare, che affiancando il medico, contribuisce alla corretta comprensione dell approccio globale alle problematiche del paziente. 20

21 BIBLIOGRAFIA [1] Ramoni RB, Himes BE, Sale MM, Furie KL, Ramoni MF, Predictive genomics of cardioembolic stroke. Stroke. 40(3 Suppl): S [2] Evans WE, McLeod HL, Pharmacogenomics - Drug Disposition, Drug Targets, and Side Effects. The New England journal of medicine. 348: [3] Weston AD, Hood L, Systems biology, proteomics, and the future of health care: toward predictive, preventative, and personalized medicine. Journal of proteome research. 3(2): [4] West M, Ginsburg GS, Huang AT, Nevins JR, Embracing the complexity of genomic data for personalized medicine. Genome research. 16(5): [5] Zöller B, García de Frutos P, Hillarp A, Dahlbäck B Jan. Thrombophilia as a multigenic disease. Haematologica. 84(1): [6] A Tripodi, P. M. Mannucci, 2001.Laboratory Investigation of Thrombophilia. Clinical chemistry. 47: [7] MG. Andreassi, I. Foffa, S. Manfredi, C. Vassalle. (2007) Marcatori genetici di rischio cardiovascolare. LigandAssay. 12 [8] Mozaffarian, D., Katan, M.B., Ascherio, A., Stampfer, M.J., Willett, W.C Trans fatty acids and cardiovascular disease. The New England journal of medicine 354, [9] Klein, Altman, Eriksson, Gage, Kimmel, Lee, Limdi, Page, Roden, Wagner, Caldwell, Johnson Estimation of the warfarin dose with clinical and pharmacogenetic data. The New England journal of medicine. 360(8): [10] Wakelam, Pettitt, Postle, Lipidomic analysis of signaling pathways. Methods in Enzymology. 432:

22 Ringraziamenti Ringrazio la Data Medica Padova Spa per aver permesso la realizzazione di questo studio, fornendo supporto logistico, strumentazione, metodi e soprattutto il sostegno e la competenza di personale specialistico, in particolare del medico responsabile del servizio di Medicina Personalizzata, dott. Stefano Fortinguerra. 22