COME FANNO I FATTORI DI TRASCRIZIONE AD ACCEDERE AL DNA NUCLEOSMALE? L incorporazione del DNA in nucleosomi inibisce quasi sempre il legame dei TF.!

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2 COME FANNO I FATTORI DI TRASCRIZIONE AD ACCEDERE AL DNA NUCLEOSMALE? L incorporazione del DNA in nucleosomi inibisce quasi sempre il legame dei TF.!

3 rimodellatori? Svolgimento del DNA nucleosmale a par6re dalle estremità (entry/exit sites) I nucleosomi (gli istoni) modificano la loro posizione rispetto alle sequenze del DNA e consentono il legame ai TF.!

4 I NUCLEOSOMI HANNO UNA STRUTTURA DINAMICA (Vicino le estremità) Quindi in linea di principio il DNA nucleosomale è disponibile per l interazione con proteine. Figure 4-28 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

5 Immunoprecipitazio ne della cromatina (ChIp) per mappare in vivo le proteine associate al DNA

6 ChIP-on-chip per determinare le modifiche dei nucleosomi e del DNA su scala genomica (composizione dell epigenoma) L Epigenoma è la combinazione delle modifiche a carico del DNA e della cromatina in ogni tipo cellulare

7 Modificazioni degli istoni su scala genomica

8 Modificazioni dei nucleosomi dei promotori e delle regioni codificanti. L Attivatore trascrizionale (ACT) legato all UAS recluta modificatori positivi come la HAT sul promotore, mentre la RNA polymerase (POL) recluta le istoni metilasi per metilare i nucleosomi dell inizio e delle ORF.! LE ISTONI METILASI SI ASSOCIANO ALLA CTD DELLA RNA pol II PER MODIFICARE LA CROMATINA DURANTE LA TRASCRZIONE. INIZIO Il complesso COMPASS si associa alla CTD fosforilata nella ser5 della Pol II e tramite la metilasi SET1 associata trimetila K4H3 del nucleosma posizionato sul punto d i inzio. DOT1 metila K79. ALLUNGAMENTO La fosforilazione della Ser 2 della CTD porta al reclutamento della metilasi Set2 che metila K36 di H

9 COME POSSONO LE MODIFICHE COVALENTI DEGLI ISTONI ALTERARE L ATTIVITA TRASCRIZIONALE?! Ogni singola modificazione istonica causa una modifica della struttura della cromatina attraverso due meccanismi (non mutualmente esclusive) 1. Meccanismi in cis: Le modifiche causano alterazioni dei contatti intra- e internucleosomali attraverso cambi di interazioni steriche e di carica (acetilazione e deacetilazione). 2. Meccanismi in trans: Le modifiche servono come elementi di riconoscimento per fattori che conducono a conseguenze funzionali

10 Modificazioni del dominio globulare alterano la struaura dei nucleosomi. 1. Modificazioni localizzate nell interfaccia istoni-istoni (punti di contatto tra gli istoni). L acetilazione di K91 e K92 di H4 possono destabillizare le interazioni dimero-tetramero e condurre al rilascio di H2A/H2B durante la trascrizione

11 Diversi modificatori di nucleosomi sono associate alla ser2-p-ctd della RNA pol II Durante la trascrizione, la HAT acetila i nucleosomi di fronte la polimerasi causando il loro disassemblaggio facilitando il trasferimento degli istoni sulle chaporine istoniche Spt6 (l esasoma) e FACT (H2A- H2B). Set2 metila la K36 di H3 che nel nucleosoma riassemblato dietro la RNA pol viene riconosciuto e legato dal cromodominio di una HDAC. Gli istoni sono così deacetilati e forse demetilati ripristinando il prolilo delle modiliche prima del passaggio della polimerasi. HDAC 11 istone demetilasi?

12 Interazioni tra K16 di H4 e la regione acida di H2A di due nucleosomi adiacen6! Visione lungo l asse diadico della struttura atomica di un di-nucleosoma mostra le interazioni (freccia) tra la coda N-terminale di H4 (verde) e il dominio globulare di H2A (giallo).!

13 La cromatina assemblata in vitro si compatta in presenza di Mg++! Le due strutture 2D di 40S e 50S sono considerate equivalente a due forme, rispettivamente, meno compatte e più compatte della fibra cromatinica di 30 nm presente in vivo. Defined conformational transitions in the nucleosomal array.

14 Il compattamento della cromatina è inibito dalla acetilazione di H4-K16. In assenza di Mg++ le quattro fibre hanno lo stesso coefficiente S (open symbols). In presenza di 1.0 mm MgCl2 (solid symbols) le fibre WT e H4-R23C si compattano (>S), mentre le fibre assemblate con H4 deleto della coda N- terminal (H4-ΔN) (solid squares) e quelle con H4-K16Ac, (solid triangles) hanno un folding meno compatto. 0 mm Mg++ 1mM Mg++ -Mg ++ H4 WT H4-R23C H4-K16Ac H4-ΔN

15 La piccola regione acida di H2A sulla superficie del nucleosoma è cruciale per il folding del filamento nucleosomale nella fibra chromatinica più compatta! cromatina assemblata con H2A varianti e mutanti della regione acida Folding nella fibra 30 nm più compatta > 40S! H2A.Bbd! H2A-STT! H2A.Bbd-EE! H2A.Bbd-EEE! H2A! H2A.Bbd inibisce la formazione della fibra di 30 nm più compatta, e probabilmente promuove il rilassamento della cromatina condenzata per consentire la trascrizione

16 LE MODIFICHE DEGLI ISTONI SONO ELEMENTI DI RICONOSCIMENTO DI ALTRI FATTORI REGOLATIVI 1. Il bromodominio è una regione di circa 50 amminoacidi, presente in diverse proteine associate alla cromatina, che si lega alla lisina acetilata delle code degli istoni.! 2. Il cromodominio è una regione di 37 amminoacidi, presente in alcune proteine eterocromatiche (HP1, istone metilasi SUV39), che lega specificamente la lisina 9 metilata di H3!

17 I lettori (readers) riconoscono le modifiche istoniche scritte dai writers e attraggono altri complessi con attività catalitica. Figure 4-43 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

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19 Le subunità ATPasiche associate ai complessi di rimodellamento della cromatina contengono il bromodominio o altri domini di interazione con i nucleosomi.

20 Complessi di rimodellamento e modificatori di istoni lavorano insieme per regolare l espressione genica

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22 Nucleosoma maschera La TATA box. Eventi che conducono alla formazione del PIC del gene HO di lievito. a. L attivatore A (SBF) legato all UAS recluta una Kinasi (Ki) che Phosphorila la Ser10 di H3. b. La HAT vviene reclutata e acetila la lisina 14 di H3. c. L attivatore recluta SWI/SNF. Attraverso il bromodominio lega la acetyl- K14. Il nuclesoma è rimodellato ed esponene la TATA box. d. -Il legame della TBP introduce una curvatura che fa scivolare il NUCLESOMA. Il PIC si assembla e la trascrizione può partire. rimodell. cromat.swf

23 Ordine di reclutamento nel promotore del gene dell Interferone Beta a) I TF si assemblano sull enhancer libero da nucleosmi a formare l enhansoma. b) L enhansosoma recluta un complesso HAT (GCN5) che Acetila la K9 di H3 e K8 di H4. c) L enhansosoma recluta una kinasi che fosforila la S10 di H3. HAT acetila K14 di H3. d) Il complesso SWI/SNF lega gli istoni acetilati e rimodella il nucleosoma posizionato sul promotore. e) Il nucleosoma rimodellato espone la TATA box che può così legare TFIID. f) Il PIC si può assemblare.

24 Sul gene umano dell α1-antitripsina l intero PIC si assembla sul promotore prima del reclutamento dei complessi di rimodellamento e della HAT

25 La modificazione degli istoni e del DNA regola la funzione della cromatina

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27 Lʼ Eterocromatina in Saccharomyces cerevisiae è localizzata in tre loci! Silent mating-type loci (III)! HMLα! MATa! or! MATα! HMRa! Telomeres! Ribosomal DNA (XII)!

28 = Silent Information Regulators (SIR genes)! HM! Telomeres! rdna! Funzione! SIR1" +! -! -! istaurazione eterocromatina! SIR2" +! +! +! SIR3" +! +! -! SIR4" +! +! -! HDAC! Manteimento/! spreading eterocr.! Manteimento/! spreading eterocr.!

29 La metilazione di H3 K79 da parte di DOT 1 blocca il legame delle proteine eterocromatiche Sir

30 Nel lievito S. cerevisae l eterocromatina e il silenziamento telomerico avviene ad opera delle Sirtuine Sir3! Sir4! Rap1! Rap1! Rap1! Rap1! Rap1! Sir2! telomere! repeats! Heterochromatin! spreading!

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33 HP1 con il cromodominio ombra polimerizza e recluta l istone metilasi SUV39 propagando cos le modifiche agli istoni vicini. HP1 Suv39

34 LA PROPAGAZIONE DELL ETEROCROMATINA PUO INATTIVARE GENI EUCROMATICI

35 VARIEGAZIONE DELL EFFETTO POSIZIONE (PEV)! Nel PEV il gene white non viene mutato; un riarrangiamento cromosomico lo pone vicino ad una regione eterocromatica. Il silenziamneto di white avviene in alcune cellule (omnatidi) durante il differenziamento dell occhio ed è ereditato dalla progenie (effetto clonale). Poiché il genotipo delle cellule è lo stesso mentre il fenotipo è differente, il fenomeno è EPIGENETICO. gene white nella sua normale posizione dell eucromatina boundary!

36 ELEMENTI CROMATINICI CHE DELIMITANO DOMINI D ESPRESSIONE GENICA: ISOLATORI Gli isolatori croma6nici possono avere una o entrambe funzioni: Elemen6 barriera o di confine (Boundary Elements) Blocco dell enhancer (Enhancer Blocking)

37 1. Isolatori come barriera all avanzamento dell eterocromartina e quindi al silenziamento genico Eucromatinico Gli elementi barriera bloccano l avanzata dell eterocromatina mediante il reclutamento degli enzimi come le HAT o rimodellatori di nucleosomi come CRA che conferiscono uno stato permissivo alla trascrizione al dominio cromatinico.

38 B. LEWIN, IL GENE - Edizione compatta, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2007

39 1. Enhancer blocking. Blocca la diffusione di una influenza posi6va (enhancer) o nega6va (silenziatori) solo se interpos6 tra ques6 elemen6 gene6ci e i promotori. Ins En1 En2 Prom En3 Ins Effetto Direzionale: A monte dell enhancer l isolatore non ha effetto. En1 Ins En2 Prom En3 Effetto Polare: L isolatore posto tra due enhancers, blocca quello localizzato più distale rispetto al promotore.

40 L enhancer bloccato nell interazione con il promotore in una direzione, può attivare la trascrizione da un promotore nella direzione opposta.

41 Gli isolatori cromatinici sono degli elementi genetici che separano domini d espressione genica.

42 Meccanismi epigenetici! Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA. Modificazioni degli istoni; Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina. Metilazione del DNA; Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C. Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio della metilazione la C della doppietta CpG.

43 EREDITA GENETICA ED EREDITA EPIGENETICA! Figure 4-35 Molecular Biology of the Cell ( Garland Science 2008)

44 Metilazione del DNA

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46 LA METILAZIONE DEL DNA PUO ESSERE MANTENUTA ATTRAVERSO LE DIVISIONI CELLULARI

47 Quali regioni sono bersaglio della metilazione? I geni dei vertebrati e piante sono marcati da isole CpG di lunghezza compresa tra 0,3 e 3 kb. Sono regioni ipometilate del genoma solitamente localizzate nelle vicinaze dei promotori della maggior parte dei geni (>50%) umani e di altri vertebrati attivamente trascritti. In queste regioni la frequenza di CpG è circa del 60%, nella restante parte del genoma è invece più bassa del 20% rispetto all atteso. gene housekeeping espresso in tutti i tessuti : abbondanza di isole CpG al 5 gene tessuto specifco: povero di isole CpG

48 Attivatore legato al DNA non metilato

49 La metilazione della ICR controlla l imprinting

50 LA METILAZIONE DEL DNA E ASSOCIATA AL SILENZIAMENTO GENICO

51 Il DNA metilato recluta il complesso HDAC e HMT Histone methylase Histone deacetylase methyl-cpg-binding domain [MBD] proteins Silenziamento eterocromatinico 51

52 RELAZIONE TRA GENOMA E EPIGENOMA Il Genoma è l informazione genetica codificata nel DNA.! i. LʼEpigenoma è la combinazione delle modifiche a carico del DNA e cromatina in ogni tipo cellulare e rappresenta lo stato Epigenetico delle cellule.! ii. Lʼepigenoma è la maniera delle cellule di esprimere lʼinformazione genetica.! iii. Un solo genoma per tutte le cellule, epigenomi differenti per i diversi tipi cellulari.! Genoma Epigenoma DNA Cromatina Histone Acetylation Ac Me Histone Methylation Gene Expression DNA Methylation Phenotype 52

53 CLASSICA DEFINIZIONE DI EPIGENETICA Cambio nello stato d espressione di un gene che non coinvolge una mutazione, ma che può essere ereditato anche in assenza di segnali o eventi che hanno iniziato il cambio. Le modifiche della croma6na e la me6lazione del DNA possono essere considerate epigene6che solo se stabilmente propagate alla progenie cellulare aaraverso la replicazione del DNA e della croma6na. 53

54 Alterationi che durano meno di un ciclo cellulare non sono epigenetiche (green asterisk, a) perchè non sono ereditate. Alterazioni non-mutazionali che sono trasmesse da una cellula alle cellule figlie (red asterisk, b) o tra generazioni di un organismo (blue asterisk, c) sono qualificate come epigenetiche. Perceptions of epigenetics NATURE Vol May

55 L Epigene6ca svolge importan6 ruoli nel differenziamento cellulare e normale e nel cancro, EPIGENOMA Meccanismi Epigenetici normali Meccanismi Epigenetici de-regolati Differenziamento normale, e.g. embryonic cells, hematopoetic cells Malignant progenitor cell Tumor

56 I cambiamenti Epigenetici possono cooperare con le mutazioni genetiche per promuovere l oncogenesi! GENETIC EPIGENETIC Errori nella replicazione, agenti mutageni alterano la sequenza nucleotidica! Altered! DNA/mRNA/proteins! X X Oncogenesis Errori nelle modificazioni dei nucleosmi e/o della metilazione del DNA alterano la struttua della cromatina! Altered levels of! mrna/proteins! Oncogene function Tumor suppressor function Oncogene levels Tumor suppressor levels Tumor

57 Nei Tumori, Cambiamenti della struttura della Cromatina può silenziare gli Oncosoppressori! Normal cells Ac Ac Ac Cancer cells Ac Ac Ac Ac Ac Ac Tumor suppressor gene expression Tumor suppressor gene expression 57

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