Proteina v-onc. localizzazione. membrane plasmatica e nucleare citoplasma membrana plasmatica e Golgi - so lubile e membrane membrana plasmatica

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1 Oncogèni: espressione genica e tumori D!] Tabella 39.5 Le oncoproteine si differenziano per dimensioni e localizzazione. Gene Proteina c-onc loca[izzazione componenti Proteina v-onc localizzazione src ab! erbb neu fps fm s membrane nucleo membrana plasmatica membrana plasmatica solubile membrana plasmatica src gag-abl P68-erbB - gag-fps fms membrane plasmatica e nucleare citoplasma membrana plasmatica e Golgi - so lubile e membrane membrana plasmatica mos ras? membrane env-mos ras citoplasma membrane myc myb fos nucleo nucleo' nucleo? myc gag-myc myb gag-fos nucleo nucleo nucleo nucleo [a prima volta con l'rsv. Mutazioni tempe ratura-sensibili in l'-src permettono di revertire il fenotipo trasformato aumhl1tando la temperatul'i e di attenerlo nuovamente diminuendola. Ciò mostra chiaramente che il gene v-sre è necessario sia per iniziare, sia per mantenere lo stato trasformato. Src è un caso eccezionale, in cui la proteina virale è sintetizzata in modo indipedente e, pertanto, assomiglia a quella cellulare. Per l'oncogenicità sono n ecessarie specifiche modificazioni della sequenza. Così v-src è oncogeno a bassi livelli di proteina, mentre c-sre non lo è neanche ad alti livelli (più di lo volte rispetto al normale). Alcuni oncogèni possono essere scarsamente oncogenici quando il e-one è espresso il livelli maggiori, ma modificazioni di sequenza, come quelle trovate nei v-one o quelle che avvengono spontaneamente nei e-one, possono attivare il gene in modo molto più efficiente; è questo il caso dei geni ras e, fo rse, 11OS. n altri casi, soprattutto e-l71ye, le modificazioni della struttura della proteina non sembrano essere essenziali per l'oncogenicità, ma l'i per-espressione o l'alterazione della regolazione possono essere responsabili dell'oncogenicità. proto-oncogèni ras possono essere attivati per mutazione Cellule tu morali solamento del DNA Trasferi mento del DN A in cellule normali ~ ~VA"\OWÌ\VAYìW\VAVAVA""[i'::, ' solar:-?" + del c ;c~ trasfor" ~ solamento del D ottenuto dal.;on trasformati 6D Gli oncogèni sono responsabili di eventi di trasformazione che non comportano l'infezione virale? È possibile determinarlo direttamente trasfettando cellule rice- Figura 39.6 Gli esperimenti di trasfezione permettono di isolare alct., oncogèni va lutando la capacità del DNA delle cellue tumorali di tra5' mare le cellule normali e di renderle tumori geniche.

2 lid 39. Oncogèni: e<pre5s/ole l'-~ Tabella 39.6 Parecchi on~ogèni possono essere individuati grazie alla loro capacità di trasiormare fibroblasti 3T3 in un esperimento di trasfezione.. c-onc v-onc Modificazione nel c-onc Tipo di tumore contenente l'oncogène H-ra s K-ras H-ras K-ras mutazione punti forme mutazione puntiforme N-ras nessuna mutazione puntiforme neu nessuna mutazione puntiforme neuroblastonla del ratto mos mos riarrangi amento plasmocitoma murino met nessuna riarrangiamento osteosarcoma umano KS nessuna riarrangiamento sarcoma di Kaposi ] "cl tomocl cm"l, "di " "be'" 397 venti «normali» con DNA ottenuto da tumori animali (la linea solitamente usata come ricevente è la linea di fibroblasti murini NH 3T3). La procedura è illustrata schematicamente nella figura Se uno specifico gene contribuisce allo stato trasformato, la sua introduzione in una nuova cellula può determinarne la trasformazione. Quando una cellula 3T3 (o un'altra cellula normale) è trasformata, la sua discendenza crescerà sotto forma di focus. La comparsa di foci è usata come misura del potenziale trasformante di una preparazione di DNA. Se si parte da una preparazione di DNA isolato da cellule tumorali, l'efficienza di formazione di foci è bassa. Comunque, una volta che il gene trasformante è stato isolato e clonato, è possibile ottenere un'efficienza decisamente maggiore. nfatti, la «forza» trasformante di un gene può essere caratterizzata dall'efficienza di formazione di foci della sequenza clonata. Un gene con alto potere trasformante può avere un'efficienza superiore ai 100 foci/ng di D\'A/10 6 cellule, mentre l'efficienza di un gene debolmente trasformante può essere inferiore ai 10 foci. l DNA con attività trasformante pllò essere isolato solo da cellule tumoralii non è presellte nel D,VA normale. '\ella tabella 39.6 sono riassunte le proprietil trasforman ti di alcuni geni che sono stati isolati in questo modo. l geni trasformanti presentano due importanti proprietà: Presentano sequenze strettamente correlate nel DNA delle cellule normali. Ciò fa ipotizzare che la trasformazione sia causata da mutazione di un gene cellulare nor kb LJ male (un proto-oncogène) che dà origine ad un oncogène. La modificazione può realizzarsi sotto forma di mu O tazione puntiforme o di più estesa riorganizzazione del 93% DNA attorno al c-onc, come riassunto nella tabella. Possono presentare una controparte negli oncogèni tra Figura 39.7 La famiglia dei geni ras um ani com prende tre membri con sdotti da virus trasformanti. Ciò suggerisce che lo spettro dei proto-oncogèni è limitato e che, probabilmente, struttura molto simile. N-ra s e H-ra, presenta no 5 esani. l primo eso ne non è codificante; gli esani l-v cod ificano la proteina. K-ras è molto più gra nde e prese nta un esone in più (lvbl, alternativo. anch'esso codificante. Le tre proteine Ras divergono solo in regi oni re lati vamen te gli stessi geni sono bersaglio di mutazioni in grado di generare oncogèni nel genoma cellulare o sono in gra piccole. do di diventare oncogèni virali. Parecchi esempi della tabella presentano una controparte dire tta nei geni l'-onc. Gli oncogèni derivati dalla famiglia del c-ras sono sta ti spesso identificati in saggi di trasfezione. La famiglia è formata da tre geni attivi sia nell'uomo, sia nel topo, dispersi nel genoma (sono stati identificati anche alcuni pseudogenil. Le strutture dei singoli geni sono strettamente correlate, come è illustrato nella figura l geni N e H presentano strutture simili; il gene K presenta un esone addizionale che crea il potenziale per generare proteine sovrapposte, per sp'licing alternativo. prodotti proteici sono tutti strellamente correlati, del peso di dalton, e sono definiti p21 l'a'. Le proteine Ra:. "ono per lo più conservale, ma vi sono alcune re!:l:ioni \a riabili. Anche se si tralla di membri della "le""n famidia i geni c-ras H. K e :\ hanno i\ ltlo une\ oluzione imtipen K-ras il Va Vb N ras e H-ras l il V 189 Aminoacid i Conservaz ione 30% 93% < 10% della sequenza

3 /Cd e Umori - ~ E'ni ra5 comprende oncogèni attivati in tumori umani e trasdotti in retrovirus Ptolo-oncogène Aminoacidi n Derivazione del lumore c-ras (-i,k,n) H-ras K-ras N-ras Gly Ala Gin + + Leu Val + + Cys + + Arg + + Val Lys + + Arg sequenza normale carcinoma del polmone Hs242 carcinoma della vescica T24 carcinoma del polmone Calu-1 carcinoma del polmone LC-10 carcinoma del colon SW480 neu roblastoma SK-N-SH carcinoma del polmone SW 1271 virus del sarcoma murino H-ras K-ras Arg Thr + Ser Thr + ceppo di Harvey ceppo di Ki rsten Un + indica che l'aminoacido presente è lo stesso del c-ras non attivato. dente. geni H e K presentano una controparte virale, essendo stati trasdotti rispettivamente dai ceppi di Harvey e della Kirstein del virus del sarcoma murino (vedi tabella 39.2). Ogni gene v-ras è molto simile al corrispondente gene c-ras, con sole 3 o 7 sostituzioni aminoacidiche, rispettivamente (vedi tabella 39.3). ceppi virali di Harvey e della Kirstein devono avere avuto origine in modo indipendente) nel corso di eventi durante i quali un virus progenitore ha acquisito sequenze c-raso Varianti oncogeniche dei geni c-ras sono state ottenute da preparazioni di DNA derivate da diverse linee cellulari tumorali. Ciascuno dei proto-oncogèni c-ras può dare origine a oncogèni trasformanti in seguito ad una singola mutazione puntiforme. n parecchi tumori umani indipendenti, la mutazione causa la sostituzione di un singolo aminoacido, in posizione 12 o 61, in una delle proteine raso Le mutazioni sono riassunte nella tabella La tabella confronta anche gli aminoacidi presenti alle posizioni corrispondenti dei geni v-h-ras e v-k-ras del.\!jusv, un retrovirus trasformante murino. n molti tumori di ratto contenenti c-ras mutati, le mutazioni sono state rinvenute nelle stesse posizioni alterate nei retrovirus. Ciò suggerisce che la normale proteina c-ras presenti, sia nel r atto, che nell'uomo (e forse anche in altri mammiferi) u n alto rischio potenziale di essere convertita in una forma tumorigenica da una mutazione puntiforme in uno di pochi codoni particolari. Quale è la relazione tra le modificazioni di sequenza g.li oncogèni c-ras identificati mediante trasfezione e gli coj!"èni )"-ras trasdotti dai retrovirus trasformanti? Le posizioni che sono modificate nei geni v-ras del oomprendono due siti comuni (12 e 59). La posizione 12 è mutata anche nei tumori umani. Questo plausibile l'ipotesi che questa posizione svolga un critico nel potenziale trasformante dei geni v-raso La forma «tumorigenica» di c-ras è definita come per la sua capacità di trasformare le cellule in cui \ trasfettata. l fatto che molte linee cellulari diverse, vate da tumori umani o di roditori, presentino geni e mutati) fornisce un'importante correlazione tra la senza di un oncogène attivo e l'esistenza di un tum Ma ciò non prova che l'oncogène mutato sia l'agente' sale; la sua funzione può essere una delle molte che ~ vono essere attivate per la formazione o la progressi tumorale. Una migliore relazione di causa-effetto è stata fol"l"l da un caso in cui il DNA di un carcinoma polmonare p sentava un gene c-ras mutato) mentre il tessuto norl1ld dello stesso paziente presentava il c-ras normale. La l tazione del c-rasi pertanto) deve avere avuto luogo n tessuto tumorale del paziente ed è quasi sicuramenle t.; relazione con la comparsa del tumore. l principio generale stabilito da questi lavori è cl una sostituzione aminoacidica può trasformare un prolooncogène cellulare in un oncogène. Un tale oncogène p essere associato con la comparsa di un tumore spontan eo nell'organismo. È anche possibile che venga trasdotto da un retrovirus; in tal caso il tumore può essere indotto dall'infezione virale. l ruolo dei geni ras nell'oncogenesi è stato finemenle studiato. Quasi ogni mutazione in posizione 12 o 61 può trasformare un proto-oncogène ras in un oncogène attivo. Tutti e tre i geni c-ras presentano una glicina in posizione 12. Se questa viene sostituita in vitro da uno qualsiasi

4 DD mi 39. Oncogeni. espressione ~..=" degli altri 19 aminoacidi, eccetto la prolina, il gene c-ras mutato può trasformare le cellule in coltura. La particolare sostituzione influenza la forza della capacità trasformante. Nei geni c-ras normali, la posizione 61 è occupata dal a glutammina. La sua sostituzione con un altro aminoacido crea solitamente un gene con capacità trasformante. Alcune sostituzioni sono meno efficaci di altre; la prolina e l'acido glutammico sono i soli sostituenti privi di effetto. Quando si verifica un'aumentata espressione di un c ras normale, o perché questo è sotto il controllo di un promotore più attivo o perché si introducono copie multiple del gene nelle cellule trasfettate, le cellule riceventi possono andare incontro a trasformazione. Alcuni c-ras che presentano mutazioni all'interno della proteina, presel1tano anche mutazioni in un introne che aumentano il livello di espressione (aumentando di circa lo volte l'efficienza di maturazione dell'mrna). noltre, alcune linee tumorali presentano geni ras amplificati (vedi tabella 39.8). Un aumento di 20 volte del livello della proteina ras non trasformante può essere sufficiente, in alcune cellule, per determinare la trasformazione. L'effetto non è stato accuratamente quantificato, ma suggerisce che l'oncogenesi dipenda da un'iperattività della proteina ras, imputabile ad un aumento della quantità di proteina o (forse in modo più efficiente) ad una serie di mutazioni che aumentano l'attività della proteina. La trasfezione del DNA può essere usata solo per trasformare certi tipi cellulari. Anche se oncogèni trasformanti sono stati isolati sia da cellule di roditori, che da cellule umane, la maggior parte dei bersagli della trasformazione in seguito a trasfezione è rappresentata da colture di fibroblasti di roditori. nfatti, la differenza di specie tra la fonte dell'oncogène (umano) e la cellula ricevente (roditore) è un importante fattore per distinguere in modo inequivocabile il gene trasfettato dal DNA dell'ospite. Le limitazioni di questa tecnica possono rendere ragione del numero relativamente piccolo di oncogèni identificabili per trasfezione. Questo sistema è stato molto efficace nel caso dei geni ras) in cui si osserva un buona correlazione tra mutazioni che attivano i geni c-ras in trasfezione e l'insorgenza di tumori. nserzioni, traslocazioni o amplificazioni possono attivare i proto-oncogèni 6D Alcuni proto-oncogèni sono attivati da eventi che modificano la loro espressione ma che lasciano inalterate le sequenze codificanti. Quello meglio caratterizzato è c myc, la cui espressione può essere aumentata a causa di parecchi meccanismi. La capacità di un retrovirus di trasformare anche in mancanza di una sequenza v-onc fu osservata per la prima volta durante l'analisi di linfomi bursali causati dalla trasformazione di linfociti B ad opera del \ ir-u,. cosi aviaria. Eventi simili si realizzano nell'in duzio linfomi delle cellule T da parte del virus della leucemi, murina. n entrambi i casi, il potenziale trasformante del retrovirus sembra risiedere nelle L TR piuttosto che nelle sequenze codificanti. n molti tumori indipendenti) il virus si è integrato nel genoma cellulare all'interno o vicino al gene c-myc. l gene è formato da tre esoni; il primo rappresenta una lunga sequenza non tradotta, mentre gli altri due codificano la proteina c-myc. La figura 39.8 riassume i tipi di inserzione in questo locus. Le inserzioni più semplici da spiegare sono quelle che si realizzano all'interno del primo introne. L'L TR fornisce un promotore ed i due esoni codificanti del gene sono espressi come parte di un RNA iniziato dall'ltr virale. La trascrizione di c-myc sotto questo controllo differisce per due motivi: il livello di espressione è aumentato (poi ché l'l TR fornisce un promotore efficiente): il trascritto perde la sua sequenza non tradolta. L'alt.Ì\azione di c-m.l'c in seguito ad altri due tipi di inserzioni non può essere "piegata mediante la lettura tramite il promotore \ irale..l genoma re tro\irale può esse re inserito all'interno o a monte del primo intr one, ma con orientamento opposto, in modo tale che il prom otore sia diretto nella direzione sbagliata Probabilmen te n:rr rappresenta un «enhancer» che agisce su sequenze a monte che, per caso, assomigliano ad un promotore. l genoma retrovirale può anche essere inserito a valle del c-myc El E2 E3 El LTR LTR E2 E3 - mlx nm Trascritto retrovirale Trascritto di fusione fimi? TraSCritto retrovirale Kill : Promotore.. "'_/ Enhancer? [D] lill:dl.. : Trascri tto retrovirale t ' / Enhancer? Figura 39.8 Le inserzioni dell'alv nel locus c-myc attivano il gene e danno origine a cellule tumorali.

5 _ ~.i/cd e tumori ---. ~ onc e g sono V'Cn' ag li estremi della raslocaz.one Figura 39.9 Una traslocazione cromosomica è un evento reciproco che com porta lo scambio di parti ira due cromosomi. Quando un gene onc \iene traslocato da un cromosoma al locus delle g può diventare attivo. -.l gene c-myc; in questo caso la trascrizione può iniziare al normale promotore di c myc, ma può essere aumentata dall'enhancer retrovirale Ll'l{. Altri oncogèni che sono attivati in tumori dall'inser zione di un genoma retrovirale sono c-erbe, c myb, c musi c-h ras e c raf. Altri 10 geni cellulari (non preceden temente identificati come oncogèni per la loro presenza in retrovirus) sono considerati potenziali oncogèni, secondo questo criterio. l geni meglio caratterizzati di que sta ultima classe sono int 1 e int2. Un altro meccanismo responsabile dell'attivazione di oncogèni è la traslocazione ad un nuovo ambiente. Certe traslocazioni cromosomiche sono costantemente associa te con l'attivazione di oncogèni situati in prossimità dei punti di rottura coinvolti nell'evento di ricombinazione. Questa situazione fu originariamente scoperta grazie alla connessione tra i loci delle immunoglobuline e la campar sa di alcuni tumori. l'raslocazioni cromosomiche specifiche sono spesso associate con i plasmocitomi murini e con il [infama di Burkitt umano. Questi tumori originano ela linfa citi B aberranti. La caratteristica comune in entrambe le specie è che un oncogène su un cromosoma \"iene portato in prossimità di un locus delle g su un altro cromosoma (i cromosomi che contengono i loci delle g sono riassunti nella tabella 3G.1). La natura dell'evento eli traslocazione è illustrata nella figura Nel topo, la maggior parte delle traslocazioni cromosomiche comportano la fusione di parte del cromosoma 15 con regioni del cromosoma 12 contenenti il locus gh; alcune coinvolgono la stessa parte del cromosoma 15 e ~a.rt e del cromosoma 6, che contiene il!ocus gk. '\ell'uomo, le traslocazioni coinvolgono solitamente il mosoma 8 ed il cromosoma 14, che contiene il locus!!h nel 10% dei casi sono coinvolti il cromosoma 8 e il m050ma 2 (locus K) o il cromosoma 22 (locus Ì\). nell'uomo, sia ilei topo, è interessato lo stesso on -my c. posto sul cromosoma 15 nel topo e sull'8 Quando c-mvc viene traslocato al locus g, viene attivalo. La sua attivazione è UlO degli eventi a.'; con la conversione della cellula in uno stato t genico. La causa di base dell'evento di traslocazione p u ' dere in un cattivo funzionamento del meccanisrn sponsabile della ricombinazione dei geni del sisterr munitario. La specificità della traslocazione dipen tipo cellulare, come indicato nella figu l'a La generazione di geni attivi delle 19 o del TcR porta probabilmente il riconoscimento di sequenze senso simili, ad opera della stessa recombinasi; n el! lule B l'enzima agisce sui loci delle g mentre nelle T agisce sui loci del l'cr (vedi capitolo 36). Così. nelle cellule B c-myc può andare incontro ad una li binazione aberrante con uno dei loci g, nelle celh.. gli eventi aberranti traslocano c-myc in prossimità locus l'cr. Tali riarrangiamenti sono rinvenibih in mi e leucemie a cellule T. Questi errori del sistem rt volto nella riorganizzazione genica causano, perciò mi a cellule B in seguito alla traslocazione c-myc-g e cemie e!infami a cellule T in seguito alla traslocal c-myc-tcr. L'attivazione di c-myc è l'evento comune qualche motivo, attualmente ignoto, gli enzimi di ri binazione possono agire su siti in prossimità del ger myc, posto su un diverso cromosoma, e su siti circo::. i loci g o TcR. Le traslocazioni al locus gh sono le più comuni n cellule B. Esse sono di due tipi. Un tipo è simile a qu osservato in altri loci g e TcR e coinvolge le sequenze consenso usate per la ricombinazione somatica V-D-] geni g. Nell'altro tipo, la traslocazione si realizza in sito di «switching»; questi casi possono essere asso con la funzione del sistema che sposta l'espressione un gene C H all'allro. Le caratteristiche di tali traslocaz ni sono riassunte nella figura Nel locus gh la combinazione avviene molto spesso all'interno della gione di switch per il gene Ca) nel topo, e per il gene C nell'uomo. L'evento di ricombinazione interessa solil mente la regione che circonda il primo esone, non coclii cante, del gene c-myc. m.j Perché la traslocazione attiva il gene c-myc? L' c\-e to di traslocazione non coinvolge siti definiti, ma int e re~ sa punti diversi all'interno di una regione generale su ciu scun cromosoma che va incontro alla ricombinazione L'evento ha due conseguenze: c-myc viene trasportato i[1 una nuova regione in cui i geni g o TcR sono attivamen te espressi; la struttura dello stesso c-myc può andare incontro a cambiamenti. Sembra probabile che meccanismi diversi possano attivare il gene c-myc in questa nuo\ a sede. Una caratteristica comune di tutte le traslocazioni è un aumento del livello di espressione di c-myc. L'aumento varia considerevolmente tra i singoli tumori ed è generalmente nell'ordine di 2-10 volte. La causa della maggiore espressione non è nota. La correlazione tra il fenotipo tumorigenico e l'attiva

6 DD zione eli c-myc per inserzione o traslocazione suggerisce che l'espressione eli grandi quantità di proteina c-myc possa essere oncogenica. l potenziale oncogenico di c myc è stato dimostrato direttamente dalla creazione di topi transgenici contenenti un c-myc normale sotto il controllo di un enhancer. Questi esperimenti dimostrano ulteriormente che il potenziale oncogenico non è ristretto alle cellule linfoieli) in cui c-myc è più spesso attivato. Topi transgenici contenenti un gene c-myc associato ad un enhancer specifico dei linfociti B (l'enhancer gh) sviluppano linfomi. tumori rappresentano linfociti B maturi e immaturi; ciò suggerisce che nperespressione di c-myc è tumorigenica a tutti i livelli della linea B. topi transgenici che presentano un gene c-myc sotto il controllo delfltr del virus del tumore mammario murino) invece, sviluppano vari tipi di tumore tra cui carcinomi Cromosoma 14 Cromosoma 14 Cromosoma 12 (topo) Direzione della trascrizione El l ---- Traslocazlone -/ ~ ~ === Trascritto mr\la giuntalo Figura Alcune traslocazioni che attivano il gene c-myc avven gono tra le regioni Sa del locus g ed il primo esone di c-myc. Gli esoni sono indicati con fondini colorati, gli introni come zone vuote.,, Cellule B 8 8 c- myc c-myc gh TcR ex Cellule T Figura Le traslocazioni che attivano il proto-oncogène umano c-myc possono interessare il locus delle g nelle cellule B e quello del TcR nelle cellule T. mammari. Ciò suggerisce che l'aumentata espressione di c-myc possa trasformare nel tumore corrispondente il tipo cellulare in cui si realizza. La specificità del tipo tumorale può perciò elipendere dal meccanismo usato per attivare c-myc; non è una proprietà intrinseca del gene. Un altro caso in cui una traslocazione attiva un onco gène è fornito dal cromosoma Philade!phia (PH 1 ) presente nella leucemiamieloide cronica (LMC). Questa traslocazione reciproca è troppo piccola per essere visibìle con il cariotipo, ma congiunge una regione di 5000 kb all'estremità del cromosoma 9) contenente il gene c-ab!, con la regione bcr del cromosoma 22. l bcr (breakpoint clu ster regionl è definito come una regione ristretta di ;).8 kb all'interno della quale si realizzano rotture sul cromosoma 22. Le conseguenze di questa traslocazione sono riassunte nella figura Anche se la frattura su entramb; i cromosomi 9 e 22 varia nei singoli casi) il risultato co mlme è la produzione di un trascritto codificante un proteina di fusione bcr-ab!, in cui le sequenze l\-ternunli derivate dal ber sono unite alle sequenze e-ab!. l punto di rottura sul cromosoma 9 è solitamen1t> di 15 kb a monte del locus c-ab! che viene lje'rcìò to intatto daua traslocazione. L'unità estende dal bcr attraverso il punto di 1'01 c-ab! traslocato. Le differenze dei p U~L singoli campioni comportano importar' l <L--c.. ~ tlb2a."

7 Oncogèni: espressione genica e tumori Figura La leucem ia micloide cron ica è associata a traslocazioni tra il crom osoma 22 ed il cromosoma 9 che generano il cromosoma Filadelfia, dando origi ne ad un trascritto di fusione ba-abl Trascrizione C Cromosoma 22 ocr J,,/ mrna { -+ 4,5kb prodotti 6,7kb Cromosoma 9 c=========-_ kb } --1i. 7kb Traslocazlone. ) \ ~----om"om' F",de'li' ~ Trascrizione ~-v-v-v ~ Splicing mrna 8kb Elii2i O= ~ Traduzione N-'1rn1l1l' utjooooooo ~( ' ocr :-a: ~ '(11 dalton mensioni del trascritto primario. L'RNA risultante unisce la parte 5' del trascritto ber al gene ab!. Lo splicing del trascritto di fusione unisce un esone della regione ber al secondo esone del gene e ab!; il primo esone del c-ab! viene eliminato. La proteina risultante contiene sequenze ber unite alla maggior parte della sequenza codificante del c-ab!. La proteina di fusione di dalton contiene circa dalton della normale proteina di e-ab! (che è di dallonl e circa dalton dell'ignota proteina codificata dal ber. Perché questo prodollo è oncogenico? Forse la fusione (o la pe rdita delle sequenze N terminali) muta la conformazione delle restanti sequenze di c-ab! ed attiva un potenziale oncogeno latente. L'onco genicità del v-ab! trasdotto dal virus della leucemia di Abelson dipende, in modo analogo, dalla sostituzione dell'estremo N-terminale. Un altro meccanismo responsabile dell'aumentata espressione di un oncogène è l'amplificazione genica. ìvlolte in e (-l cellulari tumorali presentano regioni visibili di amplificazione cromosomica, quali le «regioni con colorazione omogenea» (vedi figura 35.4) o i cromosomi «doubip minutp» (vedi figura 35.5). n qualche caso, la regione amplificata contiene oncogèni noti o sequenze corre' n altri casi, l'uso di batterie di sonde che riconos oncogèni mostra che un certo oncogène è amplific anche se l'amplificazione non è necessariamente \ isil La tabella 39.8 riassume alcuni esempi. Si noti che nella maggior parte dei casi si tratta d. nee cellulari derivate da tumori e non tumori primari. livello di amplificazione è abbastanza variabile. n ncs, no di questi casi è noto se il gene amplificato sia norrni4 o se abbia acquisito delle modificazioni oltre l'amplificazione. Le linee stabilizzate tendono ad amplificare i geni r una delle tante modificazioni cariotipiche a cui vanno in contro). Ciò nonostante, la presenza di oncogèni noti nel le regioni amplificate e la frequente amplificazione di particolari oncogèni in molti tumori indipendenti dello stesso tipo rinforzano la correlazione tra l'aumentata espressione e la crescita tumorale. È naturalmente possibile che l'amplificazione genica fornisca un vantaggio di crescita al tumore stabilizzato e che non sia necessariamente un evento iniziatore. Grazie alla loro presenza nel DNA amplificato sono stati identificati due nuovi oncogèni della famiglia di

8 BOE 39. Oncogéni: esprec ; Tabella 39.8 Gli oncogèni sono amplificati in alcuni tumori. Oncogène Amplificazione Derivazione del tumore c-myc c-myc N-myc L-myc -20x 5-' O x 5-' 000 x, 0-20 x leucemia e carcinoma polmonare umani linfoma bursale aviario neuroblastoma e retinoblastoma umani microcitoma polmonare umano c-abl -5x linea di leucemia mieloide cronica umana c-myb 5-' O x linea di leucemia mieloide acuta e di carcinoma del colon umano c-erbb -30x linea di carcinoma epidermoide umano c-k-ras c-kras 4-20x x linea di carcinoma del colon umano linea di carcinoma surrenale del topo c-myc. geni cellulari N-myc e L-myc presentano sequenze codificanti correlate a parte del secondo esone di c-myc. L'omologia è ristretta a regioni piuttosto brevi, così i tre geni possono codificare proteine con qualche funzione comune (per esempio, la capacità di legare un particolare legante); non sembra necessario che i geni presentino estese omologie. c-myc può essere attivato in tre modi: inserzione retrovirale, traslocazione cromosomica e amplificazione genica. l comune denominatore è l'aumentata espressione dell'oncogène piuttosto che una modificazione qualitativa, anche se in alcuni casi il trascritto perde la sua sequenza leader, non tradotta ma con probabile funzione regolatoria. c-myc rappresenta il paradigma degli oncogèni che possono essere efficacemente attivati per aumentata (o alterata) espressione. Gli anti-oncogèni possono sopprimere la lormazione di tumori 6D 11 ruolo comune degli oncogèni nella tumorigenesi è dovuto al fatto che l'aumentata o alterata attività del prodotto genico è oncogenica. Sia nel caso che l'oncogène venga introdotto da un virus, sia che origini da una mutazione genomica, è comunque dominantp rispetto al suo allele (proto-oncogène). Una mutazione che attivi un singolo allele è tumorigenica. L'oncogenesi, in questo caso, risulta dall'acquisizione di una funzione. Certi tumori sono causati da un meccanismo diverso: la tumorigenesi deriva dalla perdita di entrambi gli all'eli in un locus. La propensione a formare tali tumori può essere ereditala per, ia germinale; può anche verificarsi come risultato di una mutazione somatica. n questo caso, la tumorigenesi deriva dalla perdita di una funzione. l retinoblastoma è un tumore infantile che si sviluppa a carico della retina. Si realizza sia in forma ereditabile, sia sporadicamente (per mutazione somatical. È spesso associato con delezioni della banda q14 del cromosoma 13 umano. l gene RE è stato localizzato in questa regione mediante tecniche di clonaggio molecola re. La figura illustra la situazione. 11 retinoblastoma origina quando vengono inattivate entrambe le copie del gene RB. Nella forma ereditaria della ll1alatlia, uno dei cromosomi parentali presenta un'alterazione in questa regione, solitamente una delezione. Un evento somatico nelle cellule retiniche, che causa la perdita dell'altra copia del gene RB, origina il tumore. NeJJa forma sporadica della malattia i cromosomi parentali sono normali ed entrambi gli alleli sono persi in seguito a mutazione somatica. Quasi la met~l dei casi di relinohlastoma mostrano delezioni al locus RB. n altri casi, i trascritti del locus sono assenti o alterati in lunghezza. l prodotto proteico è assente nelle cellule di l'etinoblastoma. La causa del tumore è perciò la perdita dela funzione proteica, solitamente dovuta a mutazioni che impediscono l'espressione genica (a differenza delle mutazioni puntiformi che alterano la funzione del prodotto proteico). La perdita di RB può essere coinvolta anche in altre forme di tumore, tra cui 1'0 steosarcoma e il microcitoma polmonare. l gene RB è particolarmente suscettibile di essere perso dalla linea somatica? llocus supera le 150kb e per

9 Oncogèni: espressione genica e tumori rnnlortaliz zazione e trasforma. L'individuo normale RB+ RB+ ha due alleli RB + RB+ RB RB RB La perdita di un allele nelle cellule somatiche non ha effetto; la perdita di un allele nella linea germinale crea un portatore con fenotipo normale La perdita del secondo allele nelle cellule somatiche induce la formazione di tumori Figura l retinoblastoma è determinato dalla perdita di entrambe le copie del gene RB (banda cromosomica 13q14). Nella forma ereditaria, un cromosoma presenta una delezione in questa regione, mentre la seconda copia viene persa per mutazione somatica. Nella forma sporadica entrambe le copie vengon perse in seguito ad eventi somati ci. ciò rappresenta un ampio bersaglio. Nel retinoblastoma si possono realizzare diversi tipi di delezioni; queste possono estendersi ad entrambi i lati del gene o possono essere interne. L'mRNA è lungo 4,7 kb e codifica una fosfoproteina nucleare di dalton. Qual è la sua funzione? Si ritiene che potr ebbe essere quella di regolare altri geni. Se e:,,,o fosse un repressore di protooncogèni, la perdita del "un.zione di RB potrebbe portare all'iperespressione di uesti!!:eni ed alla tumorigenesi. rmo ad ora non sono ancora stati identificati bersagli ceùulari della proteina RB, ma una connessione con altre \'ie oncogeniche è fo r nita dalla sua capacità di legare l'oncoprolema El -\ dcoadeno\'ìl'us e l'antigene T dell'sv40. Non è ancora noto - 8 /'inibizione della funzione RB è coinvolta nell'azion e dj quesle oncoproteine. 6B La maggior parte dei tumori è il r._ multipli. Spesso si distingue tra l'inizia zio cellula tumorigenica e la sua promozion;" una neoplasia in via di accrescimento si pc re modificazioni che ne aumentano la lwn dentificazione di oncogèni con potenziai così come è misurato dai saggi attualme può non essere sufficiente per spiegar e tumori, ma è necessario guardare agli once _ gare almeno alcuni di questi eventi. La necessità di funzioni multiple è in a che si osserva nel caso di alcuni virus ttw in cui sono necessarie almeno due funzior. mare la cellula bersaglio. L'adenovirus contiene la regione E1A alle cellule primarie di crescere indefinitam ra, e la regione E1B, che determina modific, logiche tipiche dello stato trasformato. l polioma produce tre antigeni T: "'arge ' la crescita indefinita, «middle T» è responsa h. sformazione morfologica e «small T» ha una t cora ignota. l «middle T» del polioma fo rse diante c-src, alla quale si lega durante l'irue La separazione delle funzioni, però, non è «large T» di SV40 sembra riunire le funzioni ni "'arge T» e «middle T» di polioma e può t da solo. La suddivisione delle funzioni è riassunta n la 39.9, che assegna le oncoproteine all'immo ne o alla trasformazione (o ad entrambe). n questa classificazione delle funzioni oncogenic dell'adenovirus assieme a «middle T» del poliom~ ~- trasformare le cellule primarie. Ciò suggerisce cessaria una funzione di ciascun tipo. L'attività della maggior parte delle proteine c dai retrovirus trasducenti (o dai c-onc correlati) 110t' cora caratterizzata. Comunque, dal comportamer mutanti temperatura-sensibili, è noto che v-src è ne rio e sufficiente per iniziare e mantenere una cell ula sformata. l suo prodotto proteico e il «large T» dell 'S\ sono le uniche oncoproteine per le quali una tal E' p prietà è stata definita in modo inequivoco, anche se in cuni casi la distinzione tra proteine immortalizzanti trasformanti può essere artificiosa. Per esempio, El presenta ajcune delle funzioni solitamente attribuite alle proteine trasformanti. Parecchi oncogèni sono stati identificati per la loro efficienza di trasfezione in cellule NlH 3T3. Questo saggio è limitato dal fatto che le cellule 3T3 non sono fibroblasti normali, ma sono stati adattati nel corso di molti anni a crescere in coltura. nfatti, esse sono già passate attraverso alcune delle modificazioni caratteristiche delle cellule tumorali; in particolare, hanno già conseguito l'immortalità. L'attività oncogenica in saggi di trasfezione richiede