Transferrina Carboidrato Carente ( CDT)

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1 Transferrina Carboidrato Carente ( CDT) Aspetti biochimici e analitici Aronne Pastoris

2 La Transferrina La Transferrina (Tf) è una glicoproteina con peso molecolare che varia da 75,37 a 79,61 kd, ed è la principale deputata al trasporto di ferro nell organismo. E sintetizzata principalmente negli epatociti e in piccola parte dal sistema reticolo-endoteliale e da ghiandole endocrine, La Tf apoproteina consiste di una singola catena polipeptidica di 679 aminoacidi, suddivisa in due domini omologhi, denominati N e C, ognuno in grado di legare uno ione Fe 3+ (es.: nel dominio N, lo ione è coordinato da diversi residui aminoacidici, Asp63, due Tyr, 95 e 188, e la His249). Il legame del Fe 3+ richiede il contemporaneo legame di una molecola di bicarbonato. Struttura terziaria della Transferrina: domini N e C Ione Fe 3+ Ione bicarbonato

3 Eterogeneità: 1 livello E dovuto al carico di Ferro. Possono essere identificate 4 forme di Tf: - Apotransferrina ( pi Fe 0 = 6,1 ) -Transferrine monoferriche con Fe legato nel dominio N-terminale (pi Fe 1N = 5,8 ) -Transferrine monoferriche con Fe legato nel dominio C-terminale ( pi Fe 1C = 5,7 ) -Transferrina diferrica ( pi Fe 2 = 5,4 ) Nei soggetti normali il livello di saturazione del ferro è circa il 30%. Per ogni ione ferrico si osserva una variazione del pi di circa 0.3 unità.

4 Eterogeneità: 2 livello La Tf è una glicoproteina: è legata a due catene complesse di glicani. I siti di legame sono due residui di asparagina (Asn 413 e 611). Queste strutture eterogenee e ramificate di glucidi mostrano una notevole variabilità anche in condizioni non patologiche e determinano il 2 livello di Eterogeneità della Transferrina. Dal punto di vista biochimico, dunque, la Tf esiste in diverse isoforme, definite dalla natura delle catene di N-glicani ad essa legate (glicoforme).

5 Le isoforme della transferrina Acido Sialico Catena glicanica Catena peptidica Esasialo Transferrina Pentasialo Transferrina pi = 5.2 Tetrasialo Transferrina pi = 5.4 Trisialo Transferrina pi = 5.6 Disialo Transferrina pi = 5.7 Monosialo Transferrina pi = 5.8 Asialo Transferrina pi = 5.9

6 Eterogeneità: 2 livello Le catene glicaniche possono essere bi,tri e tetrantennate. Ciascuna antenna termina con una molecola di acido sialico che crea una carica negativa. In linea teorica sono possibili Tf con residui di acido sialico da 0 a 8. La Spettrometria di Massa evidenzia che possono coesistere due forme di Disialo-Tf : la prima lega i 2 residui di acido sialico alla stessa catena glucidica,l altra possiede 2 catene glucidiche che legano un residuo di acido sialico ciascuna. Le forme asialo, monosialo e ottasialo non sono normalmente rilevabili nel siero. Per ogni residuo di acido sialico si osserva una variazione del pi di circa 0.1 unità.

7 Glicoforme di Transferrina Sono rilevabili glicoforme della Tf con numero di molecole di acido sialico legate che varia da 0 a 8: asialo, monosialo e octasialo-tf <1% epta e esasialo-tf ~2%, complessivamente pentasialo-tf 12 18% (pi 5.2) tetrasialo-tf 70 80% (pi 5.4) trisialo-tf 4.5 9% (pi 5.6) disialo-tf <2% (pi 5.7)

8 Microeterogeneità: 3 livello Varianti genetiche Sono dovute alla sostituzione di diversi AA nella catena polipeptidica.sono state caratterizzate almeno 38 varianti genetiche della Tf, ma solo 4 di queste mostrano una prevalenza nella popolazione maggiore del 1%. La Tf di tipo C, prevalente nella popolazione caucasica, presenta ben 16 sottotipi ma il sottotipo C 1 è il più rappresentato (>95%). Le varianti più comuni sono le Tf di tipo B e di tipo D: presentano una diminuzione (5.2) e un incremento (5.7) di pi rispetto al comune tipo C 1 (considerando la tetrasialo-tf). Le frequenze degli eterozigoti nella popolazione sono di circa il 0.7% per l eterozigote BC e di 0.2% per l eterozigote CD (più frequenti in popolazioni di origine asiatica, africana e sudamericana). Un altro sottotipo di Tf C, denominata C 2 C 3, è stata osservata con una frequenza attorno a 0.6%. Altri varianti possono, ad esempio, aumentare livelli di trisialo-tf (>8%). Queste varianti genetiche non comportano alterazioni clinicamente significative nella funzione fisiologica della Tf.

9 CDT, definizione e origine La transferrina carboidrato-carente (Carbohydrate-Deficient Transferrin, CDT) fu scoperta da Stibler e collaboratori negli anni 70: fu definita come la somma percentuale delle frazioni di asialo-, monosialo- e disialo-tf rispetto alla Tf totale. Le glicoforme CDT aumentano in percentuale quando la corretta glicosilazione delle proteine è in qualche modo ridotta. La principale causa non genetica di riduzione della glicosilazione è il consumo eccessivo e continuato di alcool etilico (>50-60g di etanolo/giorno, per 1-2 settimane), tramite: 1) l inibizione delle glicotransferasi epatiche da parte dell acetaldeide, prodotta dal catabolismo dell etanolo 2) l aumento etanolo-dipendente dell attività delle sialidasi 3) l interferenza dell etanolo sul trasporto delle proteine a livello dell apparato del Golgi. La mancanza dei residui di acido sialico rallenta la degradazione, pertanto la CDT ha emivita di ca.14 gg. mentre le Tf normali 7 gg.

10 CDG, definizione I disordini congeniti della glicosilazione (CDG, Congenital Disorders of Glycosylation, sono patologie ereditarie che colpiscono gli enzimi coinvolti nella biosintesi delle glicoproteine e della glicosilazione. Le caratteristiche cliniche associate a tali patologie sono variabili ma spesso includono ritardi psicomotori, mentali e di crescita sin dalla prima infanzia. CDG-I: difetti nella sintesi e trasferimento di gruppi glucidici (catene di carboidrati completamente assenti o fortemente ridotte) CDG-II: difetti di processamento di gruppi glucidici (strutture anormali) La forma CDG-Ia è la più frequente (1/20000) mentre altre forme sono più rare (1/ /70000, CDG-Ib Ik e CDG-IIa IId)). A livello della transferrina, quindi, i CDG-I impediscono la corretta glicosilazione della proteina dando origine ad un notevole incremento della CDT, mentre i CDG-II producono glicoforme della Tf legate con catene di glicani anomale.

11 CDT: glicoforme significative L associazione fra Tf desialata ed abuso alcolico è relativa solo ad alcune delle glicoforme sinora prese in considerazione. Diversi studi hanno dimostrato che le glicoforme associate all abuso alcolico sono esclusivamente la DISIALO-Tf e la ASIALO-Tf, mentre per la MONOSIALO non vi sono evidenze sicure. L. Dibbelt, Does Trisialo-Transferrin Provide Valuable Information for the Laboratory Diagnosis of Chronically Increased Alcohol Consumption by Determination of Carbohydrate-deficient Transferrin?, Clin Chem 46, No. 8, 2000, pp Helander A, Eriksson G, Stibler H, Jeppsson J-O. Interference of transferrin isoform types with carbohydrate-deficient transferrin quantification in the identification of alcohol abuse. Clin Chem 2001;47: In una recente pubblicazione, il gruppo di studio IFCC sulla standardizzazione della Transferrina Carboidrato-Carente ha evidenziato che il parametro più importante associato all abuso alcolico e scelto per la standardizzazione è da considerarsi la DISIALO-Tf, sia per sensibilità, sia per specificità. J-O. Jeppsson, T. Arndt, F. Schellenberg, J. P.M. Wielders, R. F. Anton, J. B. Whitfield and A. Helander, Toward standardization of carbohydrate-deficient transferrin (CDT) measurements: I. Analyte definition and proposal of a candidate reference method) Clin Chem Lab Med 2007;45(4):

12 Aspetti preanalitici Prelievo ematico 1) Uso di anticoagulanti 2) Durata di conservazione del campione 3) Temperatura di conservazione del campione

13 Anticoagulanti L uso di provette con gel separatore non influenza la misura della CDT, mentre EDTA, Eparina e Citrato Possono: 1) alterare la saturazione in vitro degli ioni ferrici della Tf., agendo come complessanti antagonisti. 2) interferire nella separazione elettroforetica Pertanto si raccomanda di usare il siero come campione biologico.

14 Temperatura e durata di conservazione La CDT è stabile a t.a. fino a 30 h., a 4 C per alcune settimane e a -20 C per diversi mesi. Se lasciata a t.a., dopo 3 gg. la CDT aumenta anche del 25% per la presenza di batteri ad attività neuraminidasica che staccano i residui di Ac. Sialico dalle catene glicaniche. A questo scopo si raccomanda l uso di provette sterili. Ripetuti cicli di congelamento e scongelamento non alterano la determinazione della CDT. Il prelievo deve essere fatto a digiuno, mancando dati relativi in letteratura.

15 Aspetti analitici generali La separazione delle glicoforme della Tf è legata alla loro eterogeneità e quindi al pi risultante da: Differenza di carica dovuta al contenuto di Ac. Sialico Differente grado di saturazione ferrica Differente struttura primaria della Varianti Genetiche Per evitare la presenza di glicoforme CDT e non-cdt con diverso pi, è necessario saturare la Tf con una soluzione di ioni Fe 3+

16 Analisi della CDT Dalle prime analisi effettuate tramite isoelettrofocalizzione delle proteine, con staining, immunoblotting, immunofissazione attraverso le analisi tramite separazione cromatografica su minicolonne a scambio ionico e reazioni immunochimiche attraverso altre tecniche che fanno uso di reazioni immunochimiche con anticorpi monoclonali fino alle analisi tramite tecniche separative. CDT RIA, CDT EIA, CDT TIA N Latex CDT Elettroforesi capillare (CE/CZE) Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC)

17 IEF Prima tecnica separativa utilizzata per la separazione delle isoforme della transferrina Tecnica scarsamente automatizzabile e non semplice Per la rivelazione, è necessario un passaggio successivo di staining Separativamente efficiente ma la quantificazione pone seri problemi di inaccuratezza ed imprecisione (densitometria). Esistono kit commerciali disponibili? In un gradiente di ph creato da anfoliti e applicando un campo elettrico, ogni proteina migra fino a raggiungere il punto in cui ha carica netta neutra (pi) formando bande strette e ben definite.

18 %CDT TIA Tecnica semplice ed automatizzabile (screening) Esistono rilevanti problemi sulla corretta separazione delle isoforme e sul riconoscimento dell anticorpo (contaminazione da Mono- e Tri-sialo Tf) Spesso la quantificazione è soggetta ad elevata inaccuratezza ed imprecisione (turbidimetria). Esistono numerosi kit commerciali disponibili Tf desialata Anticorpo policlonale anti Tf Microcolonna a scambio ionico Campione di siero saturato con Fe 3+ Tf totale Misura turbidimetrica a 405nm e rapporto fra Tf desialata e Tf totale con curva di calibrazione %CDT

19 N Latex CDT Tecnica che utilizza anticorpi monoclonali ricombinanti contro la porzione peptidica desialata della transferrina + anticorpo contro Tf umana per la determinazione della Tf totale. Elevata specificità per A-, Mono- e Di-sialo Tf Quantificazione adeguatamente sensibile e precisa (nefelometria). Accuratezza e Commutabilità? Metodo completamente automatizzato e rapido su strumentazione di chimica clinica Misura anche la CDT delle Varianti Genetiche Buona correlazione con metodo HPLC di riferimento Helander A, Husa A, Jeppsson JO. Improved HPLC method for carbohydrate-deficient transferrin in serum. Clin Chem 2003;49: J.R. Delanghe, A. Helander, J.P.M. Wielders, J. M. Pekelharing, H.J. Roth, F. Schellenberg, C. Born, E. Yagmur. W. Gentzer, H. Althaus, Development and Multicenter Evaluation of the N Latex CDT Direct Immunonephelometric Assay for Serum Carbohydrate-Deficient Transferrin, Clin. Chem :

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21 Elettroforesi Capillare (CE/CZE) Tecnica separativa, evoluzione delle tecniche elettroforetiche: la separazione delle molecole avviene lungo capillari in silice fusa del diametro di μm Flusso elettroosmotico Anodo Z Z z 30 min. Rivelazione a nm detector Catodo Siero + - Saturazione con ferro Alto voltaggio

22 Valori di CDT I risultati sono espressi in % della transferina totale e non in g/l in modo da eliminare variazioni fisiologiche della concentrazione della transferrina totale. Il calcolo: % CDT = (2 sialo ) + (0-sialo) = Tutte le isoforme *100

23 Variant: normal sample

24 Variant: positive sample

25 Fattori da considerare per una validazione accurata

26 Effetti della conservazione del siero sul pattern di Capillarys CDT degradatedc3 degradated C3 Campione conservato a -20 C Campione conservato a +20 C

27 Emoglobina (Hb) 1.44 g/dl: nessuna interferenza 1.73 g/dl: interferenza

28 Anticoagulanti EDTA o Citrato

29 Rimozione del picco monoclonale con CDT/IS Prima del trattamento Dopo il trattamento con la «soluzione CDT/IS»

30 %CDT in HPLC Tecnica separativa, candidata metodica di riferimento messa a punto per la separazione delle glicoforme della Tf e la determinazione della CDT Jeppsson J-O, Kristensson H, Fimiani C. Carbohydrate-deficient transferrin quantified by HPLC to determine heavy consumption of alcohol. Clin Chem 1993;39: Helander A, Husa A, Jeppsson J-O: Improved high-performance liquid chromatography method for carbohydratedeficient transferrin in serum. Clin Chem 49: , Z Z z 30 min. Siero Saturazione con ferro e precipitazione lipoproteine 10 min centrifuga Iniezione del sovranatante in un sistema HPLC che usa un gradiente salino con colonna a scambio anionico: il pi delle diverse isoforme della Tf è il discriminante per la separazione Fase mobile (gradiente) Colonna a scambio anionico Rivelazione della Tf tramite misura in assorbimento a nm altamente specifica (Fe coordinato)

31 Specificità del metodo HPLC L immunosottrazione applicata a campioni normali, patologici, con Trisialo elevate, con Transferrine Varianti, con C.M., con PCR elevate ha evidenziato la purezza dei picchi cromatografici, utilizzando anticorpi monoclonali da siero di coniglio ( Bianchi et. Al.) Nei campioni immunosottratti solo il picco della Tf di coniglio rimane evidente. L anticoagulante EDTA produce un picco cromatografico (t.r. 1,9 min. Fe- EDTA) che non interferisce con i picchi delle isoforme di Transferrina.

32 Confronto CZE-HPLC Imprecisione (al cut-off) CZE < 3.0 % HPLC < 2.9 Sensibilità (LOD) CZE = 0.4 U.% HPLC = 0.3 U. Tempo di analisi CZE = 10 min. HPLC = 37

33 Correlazione CZE-HPLC La pendenza = (molto vicina ad 1) indica che la differenza, tra i valori di % CDT in HPLC ed i valori di Capillarys CDT, rimane approssimativamente costante; la correlazione è lineare. L intercetta = invece è significativamente diversa da 0 ed infatti i due metodi hanno un diverso valore di cut-off (dati Sebia)

34 Valori di Riferimento Latex < 2.5 % CZE < 1.6 HPLC < 2.0 Cause probabili: I metodi immunologici indiretti (estrazione su resina ion exc.),risentono dell interferenza di glicoforme CDT coeluenti, non controllabili. I metodi immunologici diretti risentono dell interferenza di altre frazioni non-cdt (epitopi differenti). Il metodo CZE è lievemente meno sensibile dell HPLC classico (~ 0,1 U.%), è lievemente meno risolutivo (R s disialo-trisialo ~0.1 U.%), è meno specifico (lettura a 200 nm) e presenta una linea di base più disturbata da altre sostanze proteiche comigranti).

35 Risultati analitici Per un referto comprensibile della CDT è necessario specificare il Metodo utilizzato e quali Glicoforme vengono utilizzate per il calcolo. La CDT deve essere espressa come % sulla Tf totale e non sulla Tetrasialo Tf. Il Laboratorio dovrebbe indicare sul referto anche l Errore Analitico. I campioni positivi o dubbi analizzati con metodi non separativi devono essere confermati con metodi HPLC o CZE.

36 CDT: conclusioni La glicoforma DISIALO-Tf è l analita target. La metodica HPLC, accoppiata alla Spettrometria di Massa, è candidata ad essere il Riferimento per l analisi della CDT. La differenza dei Valori di Riferimento CZE-HPLC non è significativa, per cui i due metodi sono confrontabili. Il Laboratorio dispone, ad oggi, di Biomarcatori in grado di coprire la finestra temporale di rivelazione, da pochi istanti fino a mesi di distanza dall assunzione di alcol in quantità significativa.

37 Biomarcatori: criteri di utilizzo Nelle applicazioni Amministrative e Forensi, le determinazioni di tali Parametri devono rispettare il consolidato criterio di correttezza analitica della Tossicologia Forense secondo cui i risultati analitici devono essere confermati dalla concordanza di almeno due tecniche basate su principi chimico-fisici differenti. ( Tagliaro et al. 2010)