Laboratorio di Citogenetica e Genetica Molecolare. Dipartimento di Medicina Molecolare e Traslazionale Università degli Studi di Brescia

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1 Laboratorio di Citogenetica e Genetica Molecolare Dipartimento di Medicina Molecolare e Traslazionale Università degli Studi di Brescia CARTA DEI SERVIZI 2017 (Seconda edizione) M-AMM-01 Rev. 9 del di 9

2 Il Laboratorio di Citogenetica e Genetica Molecolare (LCGM) dell Università di Brescia è situato presso il Dipartimento di Medicina Molecolare e Traslazionale, viale Europa 11, corpo A, piano terra Tel Fax info@lcgm-geneticamedica.unibs.it WEB E un Servizio di Genetica Medica specializzato, accreditato al Servizio Sanitario Regionale (SSR Lombardia n. 399). Eroga prestazioni nelle seguenti branche: - citogenetica - citogenetica molecolare - genetica molecolare - genetica clinica (consulenza genetica) 1. CITOGENETICA La citogenetica è la branca della genetica umana che studia il patrimonio cromosomico degli individui, cariotipo, per identificare eventuali anomalie, numeriche o strutturali, dei cromosomi stessi che sono alla base di condizioni patologiche specifiche, inclusa l infertilità. L analisi del cariotipo può essere eseguita sia in epoca prenatale, sia in epoca postnatale. In epoca prenatale l analisi del cariotipo viene eseguita sulle cellule del liquido amniotico o su quelle dei villi coriali e permette di capire se il feto è portatore di alterazioni cromosomiche. In epoca postnatale l analisi del cariotipo viene generalmente eseguita sui linfociti del sangue periferico e permette di riconoscere anomalie cromosomiche che si associano ad una condizione patologica, ad una riduzione della fertilità o ad una maggiore probabilità di generare figli affetti da patologia cromosomica. In ambito oncoematologico lo studio del cariotipo su sangue midollare è impiegato per l identificazione di riarrangiamenti cromosomici acquisiti tipici delle neoplasie ematologiche, per il monitoraggio della terapia e del trapianto midollare. Prenatale Cariotipo costituzionale su liquido amniotico (metodo in situ) Cariotipo costituzionale su villi coriali (metodo diretto e coltura) Cariotipo costituzionale su sangue fetale Cariotipo costituzionale su materiale abortivo Postnatale Cariotipo costituzionale su sangue periferico (standard e/o alta risoluzione) Cariotipo costituzionale su sangue periferico per : studio riarrangiamenti cromosomici indotti (Bleomicina e/o DEB) studio del mosaicismo cromosomico Cariotipo costituzionale su fibroblasti cutanei Oncoematologica Cariotipo su sangue midollare Cariotipo su sangue periferico non stimolato M-AMM-01 Rev. 9 del di 9

3 Indagine Citogenetica Cariotipo da coltura di amniociti (liquido amniotico metodo in situ) Cariotipo da coltura a breve termine di trofoblasto (villi coriali metodo diretto) 7 Cariotipo da coltura a medio-lungo termine di trofoblasto (coltura) Cariotipo da coltura di linfociti da sangue fetale 7 Cariotipo da coltura da materiale abortivo 28 Cariotipo da coltura di linfociti 15 Cariotipo da coltura di fibroblasti ottenuti da biopsia cutanea 28 Cariotipo da coltura di sangue midollare 14 Cariotipo da coltura di sangue periferico non stimolato 14 Per casi particolarmente urgenti i tempi indicati possono essere ridotti, previo accordo. 2. CITOGENETICA MOLECOLARE Le indagini di citogenetica molecolare, FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) ed Array CGH (Comparative Genomic Hybridization), si basano sul legame selettivo di sonde di DNA, coniugate con coloranti fluorescenti (fluorocromi), che riconoscono sequenze complementari a quelle presenti su un cromosoma o su un suo segmento. Analisi FISH Possono essere utilizzate sonde: centromeriche, che permettono rapidamente di evidenziare anomalie numeriche dei cromosomi; painting, che colorano l intero cromosoma, utili per classificare anomalie cromosomiche strutturali; locus-specifiche, che consentono di riconoscere specifici loci evidenziando delezioni e/o duplicazioni submicroscopiche; telomeriche, che identificano specificamente le regioni subtelomeriche presenti alle estremità dei cromosomi. La FISH offre una maggior risoluzione rispetto al cariotipo convenzionale, consente una migliore definizione di riarrangiamenti cromosomici, la caratterizzazione di anomalie strutturali non evidenziabili alla citogenetica classica che includono sindromi da microdelezioni, duplicazioni, traslocazioni criptiche, riarrangiamenti complessi, marcatori cromosomici. Limite della metodica è la specificità per il solo tratto di DNA interrogato. Indagine Citogenetica Molecolare (FISH) FISH per indagini su campioni in prenatale 5-* FISH per indagini su campioni in postnatale FISH per indagini su campioni in postnatale per riarrangiamenti subtelomerici FISH per indagini su campioni oncologici 14 * i tempi possono variare se la richiesta è coincidente con l arrivo del campione o se è generata da un approfondimento diagnostico. M-AMM-01 Rev. 9 del di 9

4 Tra le sindromi da microdelezione/microduplicazione indagate le principali sono: Patologia Geni analizzati /regione cromosomica Angelman Sindrome di SNRPN/UB3A (15q11-q13) Catch 22 (Di George Sindrome di) TUPLE 1 (22q11.) Cri Du Chat Sindrome di CTNND2/D5S2874 (5p15.2) Di George II Sindrome di DGCRII/D10S547(10p14) Kallmann Sindrome di KAL (Xp22.3) Miller Dieker Sindrome di PAFAH1B1 (17p13.3) Pallister Killian Sindrome di Telomero (12p) Prader Willi Sindrome di SNRPN (15q11-q13) Smith Magenis Sindrome di RAI1 (17p11.2) Williams Sindrome di ELN (7q11.23) Wolf Hirschorn Sindrome di WHSC1 (4p16.3) Ritardo Mentale idiopatico isolato o sindromico Riarrangiamenti regioni subtelomeriche (telomeri) Sul versante oncoematologico i principali riarrangiamenti indagati sono: Patologia Leucemia Mieloide Acuta (LMA) Geni analizzati /regione cromosomica Traslocazione PML/RARA t(15;17) (q22;q) Traslocazione AML/ETO t(8;) (q;q22) 14 Traslocazione CBFB t(16 ;16) ; inv(16) 14 Delezioni FIP/Chic/PDGFRA (4q12) 14 Studio MLL (11q23) 14 Leucemia Mieloide Cronica (LMC) Traslocazione M-bcr/abl t(9;22) (q34;q11) 14 Studi interfasici post-trapianto di Studio centromeri cromosomi X e Y (Sex 14 midollo osseo (allogenico) Mismatch) 14 NOTA È possibile, previo accordo, l esecuzione di analisi FISH con altre sonde commerciali, i tempi di dipenderanno dal tempo di approvvigionamento della sonda. M-AMM-01 Rev. 9 del di 9

5 Analisi CGH-Array L analisi Array-CGH consente di identificare perdite o acquisizioni di sequenze di DNA lungo l intero genoma in un'unica analisi con una risoluzione 100 volte superiore a quella possibile con le tradizionali tecniche di citogenetica classica su metafasi. Questa tecnologia è basata sulla comparazione di un campione di DNA test e uno di controllo, marcati con fluorocromi diversi e ibridati contemporaneamente a sonde di DNA adese ad un supporto di vetro (array). L intensità della fluorescenza viene quantificata mediante uno scanner e successivamente elaborata da un software dedicato. La risoluzione della piattaforma attualmente in uso è di kb su tutto il genoma. L analisi Array-CGH in diagnosi postnatale si esegue su DNA estratto da sangue periferico o da altri tessuti (cute, mucosa buccale). E indicata in caso di: sospetta sindrome da microduplicazione/delezione, ritardo mentale isolato o sindromico, malformazioni congenite, fenotipi complessi, caratterizzazione molecolare di anomalie cromosomiche identificate mediante cariotipo convenzionale. L indagine viene eseguita in diagnosi prenatale solo in particolari situazioni : riscontro di anomalie ecografiche e studio di riarrangiamento cromosomico fetale insorto de novo (compresi i cromosomi marcatori sovrannumerari). Il DNA può essere estratto da villi coriali, liquido amniotico, sangue fetale, biopsia cutanea fetale. La metodica non rileva i riarrangiamenti cromosomici bilanciati e i mosaicismi inferiori al 30%. Indagine Array-CGH Array- CGH su campioni in diagnosi post natale Array- CGH su campioni in diagnosi pre natale GENETICA MOLECOLARE Le indagini di genetica molecolare consistono nello studio del DNA e dei suoi prodotti, RNA e proteine, le cui alterazioni possono essere correlate o responsabili di una particolare condizione genetica. Attraverso l analisi molecolare è possibile identificare mutazioni geniche responsabili o predisponenti a malattie genetiche. Le analisi molecolari possono essere eseguite in epoca prenatale o postnatale a partire da diversi tipi di materiale biologico. Tali indagini sono svolte a fini assistenziali (inquadramento diagnostico e ottimizzazione terapeutica), di prevenzione (consulenza genetica preconcezionale e prenatale), e di ricerca (identificazione di nuove mutazioni, ricerca di correlazioni genotipo/fenotipo). Le analisi molecolari in epoca prenatale possono essere eseguite a partire da: villi coriali, cellule del liquido amniotico, sangue fetale, biopsia cutanea fetale, materiale abortivo Le analisi molecolari in epoca postnatale possono essere eseguite a partire da: sangue periferico, biopsie tissutali. M-AMM-01 Rev. 9 del di 9

6 Le analisi molecolari disponibili sono: Patologia Geni indagati Metodo massimi di refertazio ne Anemia Falciforme (drepanocitosi) HBB seq Aneuploidie 13,18, X e Y (QF-PCR) Polimorfismi cromosomi 13,18,,X e Y QF-PCR 2-3 Angelmann, Sindrome di Test di Regione 15p11.2 Metilazione MS-PCR Aortic Valve Disease di tipo 1 (AOVD1) NOTCH1 seq Arterie tortuose (ATS) Sindrome delle SLC2A10 seq 30 Artrogriposi distale TNNI2, TNNT3, MYH3, TPM2 seq 30 Atassia di Friedreich dim.all. X25 LR PCR Atassia Spinocerebellare tipo 1 SCA1 ATXN1 dim.all. Atassia Spinocerebellare tipo 2 SCA2 ATXN2 dim.all. Atassia Spinocerebellare tipo 3 SCA3 Machado-Joseph-disease (MJD) ATXN3 dim.all. Atassia Spinocerebellare tipo 6 SCA6 CACNA1A dim.all. Atassia Spinocerebellare tipo 7 SCA7 ATXN7 dim.all. Atassia Spinocerebellare tipo 17 SCA17 TBP dim.all. Atrofia dentato-rubro-pallido-luisiana ATN1 dim.all. (DRPLA) Beals-Hecht Sindrome di (Contratture FBN2 (mutazioni seq. congenite con aracnodattilia) ricorrenti) Caffey, Malattia di COL1A1 seq. 30 Conservazione del DNA 5 Carcinoma renale papillare c-met seq. Celiachia, predisposizione alla Antigeni HLA classe II RDB (DQ2,DQ8, DR) Corea di Huntington IT15 dim.all Cutis laxa dominante di tipo 1 (ADCL1) ELN (mutazioni seq. ricorrenti) Cutis laxa recessiva di tipo 2A (ARCL2A) ATP6V0A2 seq. Deficit di α1 Antitripsina SERPINA seq. Deficit di G6PD G6PD seq. Disgenesia Gonadica Ricerca SRY Sequenze Y Relate PCR M-AMM-01 Rev. 9 del di 9

7 Disomia Uniparentale- UPD cromosomi 7, 9, 11, 14, 15 dim.all. Displasia acromicrica/geleofisica FBN1 esoni seq. Distrofia Miotonica di Steinert DM1 dim.all. e S.B. Ehlers-Danlos classica Ehlers-Danlos spondilodisplastica COL5A1, COL5A2, COL1A1 (p.arg312cys) B4GALT7, B3GALT6, SLC39A13 seq. e MLPA seq. seq. 30 seq. Ehlers-Danlos vascolare COL3A1 seq. e MLPA Ehlers-Danlos cifoscoliotica PLOD1, FKBP14 Ehlers-Danlos artrocalasica COL1A1 (esone 6), COL1A2 (esone 6) LR PCR, seq, MLPA seq. Ehlers-Danlos dermatosparassi ADAMTS2 seq. Ehlers-Danlos atipica COL1A1, COL1A2 seq, MLPA Ehlers-Danlos cardiaca-valvolare COL1A2 seq. MLPA Ehlers-Danlos miopatica COL12A1 seq. Ehlers-Danlos muscolocontratturale CHST14, DSE seq. Ehlers-Danlos simil-classica TNXB seq. e LR PCR Emocromatosi HFE RDB Epidermolisi Bollosa Distrofica COL7A1 seq. 30 Fibrosi Cistica CFTR seq. FRAXA, Sindrome di (o S. di Martin Bell) dim.all. e FMR1 South.Blot. FRAXE AFF2 dim.all. FXTAS, Sindrome di FMR1 dim.all. Fallimento Ovarico Prematuro, Sindrome da (POF) FMR1 dim.all. Gaucher, Sindrome di GBA seq. Insensibilità agli Androgeni, Sindrome da (AIS - Sindrome di Morris) AR (esoni 1-8) seq. Kennedy Malattia di (SBMA) AR (seq CAG) dim.all. Lynch, Sindrome di Loeys-Dietz Sindrome di (LDS) MLH1 TGFBR1*, TGFBR2*, SMAD3, TGFB2, TGFB3 Test di Metilazione MS-PCR *seq, ed MLPA seq. Marfan Sindrome di FBN1 seq. e MLPA 30 MELAS( Mitochondrial myopathy encephalopathy lactic acidosis stroke syndrome) MT-TL1 seq. 30 M-AMM-01 Rev. 9 del di 9

8 Microdelezioni sul Cromosoma Y (Yq) AZF a-b-c PCR Noonan/Leopard Sindrome di PTPN11 seq. 30 Osteogenesi imperfetta COL1A1 COL1A2 seq. MLPA 30 Parkinson Malattia di Polimorfismi fetali per esclusione contaminazione materna Prader Willi Sindrome di SNCA, α-sinucleina, PARK1 LRRK2 dardarina PARK 2 parkina PINK1, p-ten, PARK6 Polimorfismi vari cromosomi Regione cromosomica CR15p11.2 seq. MLPA seq. MLPA seq. MLPA seq. MLPA dim.all. Test di Metilazione MS-PCR Pseudoxantoma elastico ABCC6 LR PCR, seq. Screening Trombofilico Fattore V G1691A Fattore II G200A RDB MTHFR C677T Shprintzen-Goldberg Sindrome di (SGS) SKI seq. Sordità (Ipoacusia) GJB2 (connessina 26) GJB6 (connessina 30) delezioni GJB6 DNA mitocondriale seq. seq PCR. PCR e dig.enz. Swyer Sindrome di (Disgenesia Gonadica) SRY seq. Talassemia Alfa HBA1, HBA2 MLPA, Seq Talassemia Beta HBB seq., MLPA Talassemia Delta HBD seq. Talassemia Gamma HBG1, HBG2 seq. Talassemia HPFH e Emoglobina Lepore MLPA, GAP- HBB, HBD PCR Thoracic Aortic Aneurysm di tipo 4 (AAT4) MYH11 seq. Thoracic Aortic Aneurysm di tipo 6 (AAT6) ACTA2 seq. Thoracic Aortic Aneurysm di tipo 7 (AAT7) MYLK seq. Tossicità al 5 fluorouracile (5FU) DPYD seq. 7 Thrombo-test resistenza al warfarin VKORC1, CYP2C9 RDB 7 Tipizzazione di HLA-B27 HLA-B27 RDB Vohwinkel Malattia di (Cheratoderma ereditario da difetto di loricina) LOR seq. Weill-Marchesani sindrome di FBN1 seq. MLPA Ricerca mutazione/i familiari NON comprese nella DGR 4716/2013 All. B seq. MLPA, altro I tempi possono variare se la richiesta è coincidente con l arrivo del campione o se è generata da un approfondimento diagnostico. M-AMM-01 Rev. 9 del di 9

9 LEGENDA: dim.all: dimensionamento allelico QF-PCR: quantitative-fluorescent PCR dig.enz: digestione con enzimi di restrizione RDB reverse dot blot LR PCR: long range PCR S.B: southern blot MS-PCR: metilation sensible PCR seq: sequenziamento automatico del DNA NOTA Il laboratorio al momento opera come SERVICE PASSIVO. Non potrà pertanto essere applicata la normativa D.G.R. n del 7 luglio 1999 che consente di reperire ed inviare mediante service campioni biologici a centri di riferimento nazionali ed internazionali per l esecuzione dei test non direttamente forniti. Le modalità di prelievo, conservazione e trasporto del materiale biologico sono disponibili sul sito area operatori. 4. GENETICA CLINICA (CONSULENZA GENETICA) Il Servizio di Consulenza e Genetica Clinica si rivolge a persone affette o a rischio di malattie genetiche, assicurando un corretto inquadramento diagnostico di malattia, l impostazione del follow-up assistenziale, la consulenza genetica in merito alle modalità di trasmissione della malattia, alla definizione del rischio riproduttivo dell affetto e dei familiari, alle possibili terapie incluse le opzioni riproduttive. Durante la visita viene raccolta l anamnesi familiare e personale del probando, viene ricostruito l albero genealogico, viene esaminata la documentazione clinica e strumentale relativa alla patologia in esame, quando necessario, viene visitato il paziente. In base all indicazione si effettuano le seguenti consulenze genetiche: Preconcezionale Valuta, in una coppia, il rischio di ricorrenza di una malattia ereditaria presente nella famiglia, o il rischio riproduttivo di una coppia che desideri pianificare una gravidanza. Prenatale Correlata alla diagnosi prenatale di una malattia genetica in presenza di una patologia genetica familiare o di un anomalia riscontrata in ambito prenatale. Postnatale finalizzata all inquadramento clinico diagnostico, alla prognosi e al rischio di ricorrenza/occorrenza di una patologia genetica in un bambino o in un adulto. correlata ai test genetici, atta cioè a fornire informazioni relative ai test genetici richiesti e all interpretazione dei risultati degli stessi. Oncologica: permette di identificare persone ad alto rischio di insorgenza di tumori attraverso l'analisi della storia familiare e/o attraverso l'applicazione di test genetici. L attività si avvale dell interazione tra diversi specialisti che, in alcuni casi, sono organizzati in unità/ equipe dedicate. Per accedere all ambulatorio chiamare il numero tutti i giorni feriali dalle 8.00 alle M-AMM-01 Rev. 9 del di 9