La Citogenetica nella Diagnosi Prenatale

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Cristina Bruno
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1 La Citogenetica nella Diagnosi Prenatale

2 Per diagnosi prenatale si intende l insieme delle indagini strumentali e di laboratorio finalizzate ad individuare determinate patologie su base : genetica infettiva iatrogena

3 Attualmente l indagine citogenetica per lo studio del cariotipo fetale interessa circa l 80% delle diagnosi prenatali eseguite per evidenziare patologie genetiche.

4 Indicazioni alla diagnosi prenatale Eta materna > 35 anni (l'aumento del rischio di aneuploidie cromosomiche correla con l'età materna) Genitori con precedente figlio affetto da aneuploidia (rischio di ricorrenza circa 1%) Genitori eterozigoti per anomalie cromosomiche bilanciate (aumento del rischio di concepimenti sbilanciati) Anamnesi familiare positiva per patologia cromosomica (analisi del cariotipo su sangue del genitore a rischio) Anamnesi familiare positiva per malformazioni congenite Evidenza ecografica di malformazioni fetali (circa il 20% di questi feti è sbilanciato) Alterazioni biochimiche nella madre (aumento dei valori di gonadotropina corionica, riduzione dell'alfafetoproteina e dell'estriolo non coniugato predicono nel Triplo-test il 70% delle gravidanze con feto affetto da trisomia 21; >NT+free-beta hcg+papp-a predicono nel Bitest l 80-85% delle gravidanze con feto affetto da trisomia 18 o 21 ) Malattie mendeliane (analisi del DNA su villi coriali)

cariotipo su sangue del genitore a rischio) Anamnesi familiare positiva per malformazioni congenite Evidenza ecografica di malformazioni fetali (circa il 20% di questi feti è sbilanciato) Alterazioni

5 Tecniche di diagnosi prenatale AMNIOCENTESI (16-18 sett.gestazione) VILLOCENTESI (11-12 sett.gestazione) FUNICOLOCENTESI (18 sett.- termine gravidanza)

6 Funicolocentesi Approccio tardivo alla diagnosi prenatale (18 sett.->termine gravidanza) Fallimento della coltura dopo amniocentesi Mosaicismi presenti nelle cellule del LA Mosaicismi confinati alla placenta Riscontro ecografico di malformazione fetale

amniocentesi Mosaicismi presenti nelle cellule del LA

7 Cariotipo fetale da cellule di liquido amniotico Materiale esaminato: cellule di liquido amniotico (cellule di desquamazione provenienti da: sacco amniotico, epidermide, mucosa del tubo digerente, del tratto respiratorio e di quello urogenitale). Metodica d indagine: in situ: l analisi avviene per colonie. Migliore valutazione diagnostica in caso di mosaicismo cromosomico o di contaminazione materna. Tempi di coltura più brevi. in fiasca: si perde l individualità dei cloni. Maggiore crescita cellulare.

Metodica d indagine: in situ: l analisi avviene per colonie.

8 Cariotipo fetale da villi coriali Materiale esaminato: cellule del trofoblasto Metodica d indagine: coltura diretta: si analizzano le mitosi spontanee presenti nel citotrofoblasto, dopo ore dal prelievo. Rapidità. Minore rischio di inquinamento da cellule materne. Attività mitotica e qualità delle metafasi inferiori rispetto alla tecnica della coltura. coltura a lungo termine: le colture vengono allestite previo trattamento dei villi con enzimi proteolitici per disgregare le cellule del cito e del sinciziotrofoblasto. Contaminazione con cellule di origine materna.

Attività mitotica e qualità delle metafasi inferiori rispetto alla tecnica della coltura.

9 CVS

10 Frequenza anomalie cromosomiche in rapporto all età materna Età materna Anomalie numeriche Trisomia anni 25 anni 30 anni 34 anni 35 anni 39 anni 40 anni 45 anni 1/530 1/480 1/390 1/244 1/170 1/81 1/60 1/20 1/ / /900 1/474 1/350 1/146 1/110 1/30

anni 35 anni 39 anni 40 anni 45 anni 1/530 1/480 1/390 1/244

11 Problemi tecnici ed interpretativi collegati alla diagnosi citogenetica fetale Fallimento dello sviluppo della coltura cellulare in vitro (<1%) Crescita in coltura di cellule di origine materna (CCM) Mosaicismo cromosomico, pseudomosaicismo (anomalie in vitro oppure derivate da tessuti extraembrionali) Riarrangiamenti strutturali ESACs (Extra Structurally Abnormal Chromosome) insorti de novo

(CCM) Mosaicismo cromosomico, pseudomosaicismo (anomalie in vitro oppure derivate da tessuti

12 Mosaicismo Presenza in uno stesso individuo di due o più linee cellulari a cariotipo diverso Livello III (mosaicismo vero) Livello II (pseudomosaicismo a cellule multiple) Livello I (pseudomosaicismo a singola cellula)

(mosaicismo vero) Livello II (pseudomosaicismo a

13 Caratteristiche dei mosaicismi cromosomici Errori postzigotici Variabili nel tipo Variabili nei diversi tessuti Variabili nel tempo

14 Mosaicismo XX/XY Di solito è uno pseudomosaicismo (CCM in gravidanza 46,XY) Non documentabile in una gravidanza 46,XX Il mosaicismo XX/XY, di III livello si associa di solito ad una femmina 46,XX (linea XY vanishing twin) Importante e dirimente l analisi ecografica dei genitali esterni

di III livello si associa di solito ad una femmina 46,XX (linea XY

15 Mosaicismo X/XY In postnatale fenotipo variabile : femmina con fenotipoturneriano, neonato con genitali ambigui, maschio sterile In prenatale, maschi normale Monitoraggio ecografico Origine placentare della linea 45,X

ambigui, maschio sterile In prenatale, maschi normale

16 Trisomia 20 Di solito è contributo dagli amniociti, ed il feto ha un cariotipo normale Raramente il mosaicismo causa difetti Rischio di patologia legato alla presenza della linea aneuploide in >60% delle cellule

mosaicismo causa difetti Rischio di patologia legato

17 Mosaicismo per isocromosoma autosomico Raro i(12p) associata alla Sindrome di Pallister Killian non presente nel sangue prognosi grave forme molto rare, a prognosi infausta

18 Riarrangiamenti strutturali Bilanciati: spostamento di parti di un cromosoma su di un altro o all interno dello stesso, senza modificare il contenuto genomico dell individuo (es.:traslocazioni, inversioni). Frequenza nella popolazione 1:200 familiari ( 1% rischio aggiuntivo di patologia) de novo ( 3-5% rischio aggiuntivo di patologia) Sbilanciati: aumento o perdita di materiale genetico (es.: duplicazioni, delezioni). Frequenza 1:1000 diagnosi prenatali

Frequenza nella popolazione 1:200 familiari ( 1% rischio aggiuntivo di patologia) de novo ( 3-5% rischio

19 46,XY,t(3;4)(q24;q34)

20 Traslocazioni de novo Difficoltà a definire se il riarrangiamento sia realmente bilanciato In postnatale la presenza di un fenotipo normale suggericse un anomalia bilanciata Frequenza: 1/2.000 amniocentesi; 1/9.000 quelle robertsoniane; 1/ le inversioni Meccanismi alla base di un effetto fenotipico: delezione duplicazione rottura di un gene effetto di posizione

Frequenza: 1/2.000 amniocentesi; 1/9.000 quelle robertsoniane; 1/10.

21 Screening rapido delle aneuploidie dei cromosomi FISH (Fluorescence in situ Hybridization) Materiale esaminato: amniociti non coltivati Tempi di risposta: ore dall arrivo del campione in laboratorio Limiti diagnostici: valutazione parziale e limitata solo ai cromosomi specificatamente ricercati (cromosomi 21,13,18,X,Y). Limiti di affidabilità: materiale da esaminare scarso mosaicismi molto diluiti QF-PCR (Quantitative Fluorescence-Polymerase Chain Reaction)

22 QF-PCR Estrazione del DNA da amniociti non coltivati Analisi dei microsatelliti (cromosomi 13,18,21,X) ed analisi del gene amelogenina in Xp ed Yp mediante PCR Analisi dei prodotti di PCR per elettroforesi capillare, analisi dei frammenti e calcolo delle aree sottostanti gli amplificati (picchi) Vantaggi: rapidità, meno laboriosa, automatizzabile, meno costosa

23 QF-PCR Trisomia 21 Trisomia 18

24 FISH (Fluorescence In Situ Hybridization)

25 (Fluorescence in FISH in situ situ Hybridization) Studio delle traslocazioni genoteche cromosoma specifiche(painting) Definizione più precisa dei punti di rottura Individuazione di riarrangiamenti criptici (microdelezioni e/o microduplicazioni, riarrangiamenti subtelomerici) Precisa definizione sullo status mono o dicentrico delle traslocazioni robertsoniane. Caratterizzazione di marker sovrannumerari(esac) Identificazione di delezioni causa di sindromi da geni contigui Origine e struttura dei cromosomi ad anello

26 ESAC in diagnosi prenatale Frequenza 1:2500 Morfologia: ad anello (ring), metacentrico Importante l analisi dei genitori (familiare vs de novo) Mosaicismo vs aneuploidia omogenea Con satelliti vs senza satelliti 1/3 presentano reperti ecografici patologici (Warburton, Am J Hum Genet 49, ,1991)

27 ESAC Familiari In genere non comportano rischi per il feto ESAC de novo I dati sui rischi empirici riflettono difetti di campionamento Non sono disponibili follow-up adeguati dei neonati Le anomalie diagnosticate sulle gravidanze interrotte riguardano solo i difetti principali 15% per ESAC non satellitati 11% per ESAC satellitati Sottoclassificazione con bande C, Ag-NOR, Distamicina A/DAPI, FISH

28 ESACs in diagnosi prenatale: approccio diagnostico Prelievo ematico ai genitori per controllo cariotipo Caratterizzazione del marcatore con tecniche di citogenetica molecolare (FISH)

29 ESAC(Extra Structurally Abnormal Chromosome) der 14/22 Ish.alfasat.14/22 +

30 IDENTIFICAZIONE DI RIARRANGIAMENTI DELLE REGIONI SUBTELOMERICHE LSI 1pter; LSI Xpter/Ypter LSI 1qter; LSI Xpter/Ypter CEP X

31 Dalla citogenetica tradizionale alla CGH-Array 1970 Bandeggio standard 1980 Bandeggio ad alta risoluzione 1990 Citogenetica molecolare (FISH) 2002 Array-CGH (acgh)

32 A-CGH: principi ed applicazioni in ambito diagnostico Agli studenti è stato fornito materiale didattico cartaceo e sono stati consigliati testi specifici dove poter approfondire gli argomenti trattati a lezione.

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