Diagnosi Prenatale I
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- Beniamino Amore
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1 Diagnosi Prenatale I Lezione 15
2 Diagnosi prenatale nata nel 1966 (Steele e Breg); richiede l intervento di numerose discipline: ostetricia, ultrasonografia, genetica clinica, diagnosi e consulenza genetica e la diagnostica di laboratorio; fornire scelte informate alle coppie a rischio rassicurare e ridurre l ansia scopi: permettere a coppie ad alto rischio di confermare o smentire l anomalia nel feto mediante il test, anziche rinunciare ad avere figli permettere a coppie con un bambino affetto di avere una preparazione psicologica prima e dopo la nascita permettere il trattamento prenatale del feto affetto
3 Indicazioni Diagnosi prenatale 1. Eta materna avanzata Incidenza della trisomia 21
4 Indicazioni Diagnosi prenatale 2. un precedente bambino con un anomalia cromosomica de novo 3. la presenza di anomalie cromosomiche di tipo strutturale in uno dei genitori 4. la presenza di una storia familiare per una malattia genetica che puo essere diagnosticata o esclusa mediante analisi biochimiche o del DNA 5. La presenza di una storia familiare per una malattia X-linked per la quale non esiste un test prenatale specifico 6. Il rischio dei difetti del tubo neurale 7. Lo screening del siero materno ed ecografia I e II trimestre (NT, nasal bone, CPC, EHF,SUA)
5 Considerazione Importante!!!!! Le diapositive che seguiranno trattano aspetti non genetici: sono teniche che attengono alla pratica medica, tuttavia mi sembra appropriato che li conosciate. Questo non vuol dire che siano l aspetto piu importante o esaustivo..anzi!!!!
6 Metodi ostetrici per la diagnosi prenatale Tests invasivi: Amniocentesi Esame dei villi coriali Cordocentesi Diagnostica genetica preimpianto Tests non invasivi: Alfa-fetoproteina nel siero materno Screening del siero materno Ecografia Isolamento delle cellule fetali dal sangue materno
7 Aspetti tecnici (sempre ostetrici) dell amniocentesi Esame ecografico preliminare per valutare le condizioni fetali, il periodo gestazionale, il numero di feti, la normalita strutturale e la posizione ottimale per l inserimento dell ago Epoca: tra la 15a e la 16a settimana di gestazione (eccezionalmente tra la 10a e la 14a) Esecuzione: ambulatoriale Preparazione: nessuna Aghi: g (0,8-0,7 mm) Via: transaddominale
8 Complicazioni: LAumento dello 0.5-1% al di sopra del normale rischio del 2-3% di aborto LRare perdite di liquido amniotico, infezioni e danni al feto causati dalla puntura dell ago LL amniocentesi precoce (10-14 settimane) ha un rischio d aborto del 2,6% contro lo 0,8 dell amniocentesi tradizionale LPer prevenire l immunizzazione Rh della madre, viene somministrata di routine la globulina immune Rh alle donne Rh negative
9 Analisi dei villi coriali (chorionic villus sampling o CVS) La biopsia dei villi si effettua tra la 10a e la 12a settimana di gestazione mediante prelievo transaddominale o transcervicale
10 Vantaggi del CVS: JDal momento che il trofoblasto é di provenienza embrionale e presenta il medesimo patrimonio genetico dell embrione, possono essere effettuate su questo materiale le medesime indagini citogenetiche, biochimiche e sul DNA effettuate con l amniocentesi. JI risultati delle successive indagini sono disponibili in un eta gestazionale piu precoce rispetto all amniocentesi, riducendo il periodo di incertezza e permettendo un eventuale interruzione di gravidanza nel primo trimestre JFornisce l esito dell analisi cromosomica in un periodo di tempo piu breve rispetto all amniocentesi
11 Svantaggi del CVS LL AFP non puo essere valutata in questo stadio (a differenza dell amniocentesi) e lo screening per le anomalie del tubo neurale deve essere effettuato mediante esame ecografico durante la 16a settimana di gestazione LLa frequenza di aborto e dell 1% sopra il normale rischio del 2-5% alla 7a-12a settimana di gestazione LIl successo dell analisi cromosomica e pari a quello dell amniocentesi (>99%). Tuttavia, il 2% dei tests eseguiti da CVS danno risultati ambigui a causa del mosaicismo cromosomico (sia vero che pseudomosaicismo). Quindi si raccomanda l esecuzione di un amniocentesi successiva per stabilire in maniera inequivocabile se il feto presenta un anomalia cromosomica.
12 Cordocentesi (Funicolocentesi) Con il termine funicolocentesi (o cordocentesi) si intende il prelievo di sangue fetale dal cordone ombelicale.la funicolocentesi viene eseguita più tardivamente rispetto alla villocentesi e all'amniocentesi (dopo la 20a settimana fino al termine della gravidanza) ed il prelievo comporta un maggiore rischio di aborto rispetto agli altri tipi di prelievo. Questo esame viene richiesto solo quando ci sono indicazioni specifiche.
13 QUANDO SI CONSIGLIA LA FUNICOLOCENTESI Mosaicismo cromosomico: nel caso di mosaicismo cromosomico rilevato su liquido amniotico o villo coriale può essere necessario eseguire un esame del cariotipo su sangue fetale, allo scopo di analizzare un tessuto diverso e ottenere maggiori indicazioni sull'assetto cromosomico del bambino. Malformazioni fetali evidenziate ecograficamente: le anomalie anatomiche prendono il nome di malformazioni e colpiscono un neonato su 40. Vengono frequentemente evidenziate intorno alla 20-22a settimana di gravidanza, all'ecografia di secondo livello (ecografia morfologica). Alcune di queste malformazioni possono essere conseguenza di anomalie cromosomiche e quindi richiedere un esame del cariotipo, che può essere effettuato su liquido amniotico o sangue fetale, a seconda dell'epoca gestazionale. Nel caso in cui la gravidanza sia avanzata è preferibile eseguire la funicolocentesi, in quanto si ottiene una risposta in tempo più breve rispetto all'amniocentesi.
14 QUANDO SI CONSIGLIA LA FUNICOLOCENTESI Ritardo nella crescita intrauterina: un importante ritardo della crescita fetale è talvolta associato ad un'anomalia cromosomica e può essere necessario un esame del cariotipo. Diagnosi di malattie infettive: un prelievo di sangue fetale può essere richiesto per valutare un'eventuale trasmissione di un agente infettivo dalla madre al bambino. Oggigiorno, comunque, questo tipo di indagini viene effettuato nella maggior parte dei casi su liquido amniotico.
15 LM Sc.Biosanitarie Ricerca Diagnostica Il prelievo di sangue fetale La funicolocentesi non richiede alcuna preparazione ed è ambulatoriale, anche se sono necessari uno o più controlli ecografici dopo il prelievo.la sua esecuzione consiste nell'aspirazione, mediante un ago sottile introdotto per via transaddominale sotto guida ecografica, di una piccola quantità (circa ml) di sangue fetale.e' consigliabile, dopo il prelievo, un periodo di riposo di 48 ore. Funicolocentesi: un esame rischioso? I rischi per la madre sono praticamente inesistenti, se vengono rispettate le regole della sterilità. Per quanto riguarda il feto, viene stimato un rischio di aborto dopo prelievo di sangue fetale pari al 3-4%. Il sangue fetale in laboratorio Il sangue fetale viene raccolto in apposite provette con un terreno nutritivo che favorisce la proliferazione delle cellule prelevate. Sono necessari circa 3 giorni per poter analizzare al microscopio le cellule fetali.
16 Screening dell AFP nel siero materno alla 16a settimana Quando il feto presenta difetti del tubo neurale, la concentrazione dell AFP e piu alta rispetto ai normali livelli nel siero materno. Questo saggio combinato con l esame ecografico risulta molto efficace per la diagnosi dei difetti del tubo neurale.
17 L INDAGINE ECOGRAFICA I feti affetti da anomalie cromosomiche presentano delle caratteristiche anatomiche particolari individuabili con una indagine ecografica nel corso del primo trimestre di gestazione. Nel 2001 un gruppo di ricercatori del King's College Hospital di Londra ha proposto un ulteriore marker ecografico utile per l'individuazione degli embrioni affetti da Sindrome di Down, lo studio delle ossa nasali. Si è infatti scoperto che il 73% dei bambini nati con Sindrome di Down non ha ossa nasali. Si stima che questa indagine associata all'ultrascreen può portare la predittività fino al 93% circa.
18 L INDAGINE ECOGRAFICA Una di queste indagini è la valutazione della cosiddetta TRANSLUCENZA NUCALE. Si è visto in effetti che molti embrioni affetti da anomalie cromosomiche hanno, per ragioni ancora non completamente conosciute, un accumulo transitorio di liquido negli strati sottocutanei della regione retronucale del collo nel periodo tra 10 e 14 settimane. Se lo spessore di questa zona supera i 3 mm si ha una probabilità di anomalie cromosomiche pari al 75% con un 5% di falsi positivi. In questi casi è consigliabile procedere quindi subito ad una biopsia dei villi coriali e se questa è negativa è consigliabile comunque ripetere un accurata osservazione del feto mediante un'ecografia di II livello tra la 20a e la 22a settimana, in 1 caso su 20 infatti possono essere presenti altre malformazioni, soprattutto cardiache.
19 Tecnologie emergenti Diagnosi genetica preimpianto (PGD) si effettua la biopsia di un blastomero dopo IVF. Il trasferimento degli embrioni sani e effettuato dopo analisi molecolari e/o cromosomiche. Non esiste attualmente alcuna evidenza di danni negli embrioni sottoposti a biopsia.
20 Diagnosi genetica preimpianto (PGD) Nel caso di malattie monogeniche si applica l analisi molecolare mediante PCR, mentre per le anomalie cromosomiche si utilizza la FISH in interfase dopo fissazione su vetrino di uno o piu blastomeri.
21 Cellule fetali nel sangue materno In ogni gravidanza sono presenti cellule fetali (linfociti, cellule trofoblastiche, eritrociti) nel sangue materno (1 su ). Queste possono essere arricchite mediante MACS ed utilizzate per la FISH con speciali sonde di DNA per il cromosoma 13, 18 e 21, X e Y. Queste tecniche pero non sono ancora applicabili nella pratica clinica e devono, per il momento, essere considerate delle tecniche sperimentali.
22 Test di laboratorio Analisi citogenetica Analisi del DNA teoricamente saggi biochimici per la diagnosi di malattie metaboliche (dosaggi enzimatici su liquido amniotico o direttamente su villi coriali) questi ci riguardano quando si parla di diagnosi prenatale di malattie genetiche!!!!!
23 Il liquido amniotico Il liquido amniotico contiene cellule di origine fetale che possono essere messe in coltura per i successivi tests diagnostici.
24 Analisi citogenetica Sia l amniocentesi che il CVS forniscono cellule fetali per l analisi del cariotipo. La preparazione e successiva analisi dei cromosomi puo richiedere da 1 a 2 settimane. Si possono, in alternativa, usare nuclei interfasici da cellule fetali non coltivate per diagnosticare le comuni aneuploidie dei cromosomi 13, 18, 21, X ed Y immediatamente dopo amniocentesi o CVS. Questo rapido test citogenetico deve essere ancora realmente valutato come metodo diagnostico da utilizzare di routine.
25 Tecniche di bandeggio cromosomico Bandeggio Q Bandeggio G Bandeggio R
26 MOSAICISMO Si riferisce alla presenza di due o piu linee cellulari in un campione o tessuto.si distinguono tre livelli di mosaicismo nel liquido amniotico o nelle colture CVS: LMOSAICISMO VERO (elevato rischio di anomalie fetali) KMOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA (chorion, amnion) JPSEUDOMOSAICISMO (una singola cellula anomala): viene ignorato La grande maggioranza dei mosaicismi in diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali
27 problemi dell analisi cromosomica prenatale: Fallimento della coltura cellulare (rischio basso) Situazioni avverse inattese riarrangiamento cromosoma marker de novo?? Analisi del cariotipo dei genitori 1. Genitori non portatori : de novo 2. Un genitore (sano) portatore di un riarr.bilanciato Stesso riarrangiamento nel feto Feto sano? Riarrangiamento sbilanciato nel feto Gravi anomalie fetali
28 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) Cromosomi di cui non è riconoscibile con le metodiche classiche la provenienza Frequenza alla nascita /1000 Difficile correlazione genotipofenotipo in diagnosi prenatale Importante il rilievo della caratterizzazione molecolare 28
29 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) In più del 50% dei casi è oggi possibile fare previsioni fenotipiche corrette: Invdup15 (50% ESAC) Cromosomi sessuali 29
30 30
31 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) CBG positivo DA/DAPI positivo FISH centromero 15 positiva Invdup(15) Definizione del tipo 31
32 32
33 33
34 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) FISH sonde pericentromeriche (D15S11; GABR3) NEGATIVA Invdup(15) tipo I Assenza di anomalie del fenotipo 34
35 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) Rischio di Disomia Uniparentale 15q11-q13 da origine postzigotica del marcatore Materna Paterna s. Prader/Willi s. Angelman 35
36 36
37 37
38 P F M P F M D15S130 D15S165 Polimorfismi Cromosoma 15 - Tecnica PAGE 38
39 CROMOSOMI MARCATORI (Extra Structurally Abnormal Chromosome) ESCLUSIONE DISOMIA UNIPARENTALE CON MARCATORI POLIMORFICI DEL CROMOSOMA 15 39
40 40
41 41
42 42
43 Mosaicismo Amniocentesi cellule dall epiblasto della massa cellulare interna. Villocentesi Coltura a breve termine cellule del trofoblasto. Villocentesi Coltura a lungo termine cellule dello stroma (mesoderma extraembrionario). 43
44 44
45 MOSAICISMO I Livello: singola cellula II Livello: due o più cellule in una flask con la stessa anomalia o singolo clone III Livello: due o più cellule in più flask con la stessa anomalia o almeno 2 cloni 45
46 Liquido Amniotico Mosaicismi Livello I % Livello II % Livello III < 0.2 % 46
47 MOSAICISMO PSEUDOMOSAICISMO MOSAICISMO CONFINATO ALLA PLACENTA (chorion, amnion) MOSAICISMO VERO La grande maggioranza dei mosaicismi in diagnosi prenatale non si correla ad anomalie fenotipiche fetali 47
48 Diagnosi Malattie DNA Numero elevato malattie Numero elevato di mutazioni (es. Fibrosi cistica) Coinvolgimento geni diversi (es. Retinite pigmentosa) 48
49 Diagnosi Malattie DNA - Prerequisiti Conoscenza gene/i Identificazione della specifica mutazione 49
50 Conoscenza geni 8000 malattie geni noti 30% (60-70% pazienti) 50
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