Modulo 4: DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI

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1 C.I. MEDICINA DI LABORATORIO MICROBIOLOGIA CLINICA CL MEDICINA E CHIRURGIA AA Modulo 4: DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI Giovanni Di Bonaventura, PhD Università G. d Annunzio di Chieti-Pescara Nuovo Polo Farmacia, corpo D, III livello (tel ) Centro Scienze dell Invecchiamento (Ce.S.I.), V livello (tel ) gdibonaventura@unich.it

2 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI APPROCCIO GENERALE Presuppone un adeguata diagnosi clinica: corretto inquadramento differenziale sul piano clinico per restringere lo spettro delle indagini da eseguire Buona conoscenza della patogenesi delle infezioni sospette corretto prelievo ed invio di un adeguato campione clinico Diagnosi di laboratorio indispensabile quando: sia prospettabile uno specifico intervento profilattico o terapeutico il quadro clinico può essere sostenuto da più virus non correlati (forme esantematiche, forme enteriche acute, infezioni respiratorie) sia necessario seguire particolari categorie di pazienti (ad esempio, immunodepressi) si predisponga il controllo di preparazioni commerciali di emoderivati si ricerchi l agente eziologico di nuove o gravi patologie si eseguano indagini a carattere epidemiologico su una determinata popolazione

3 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI APPROCCIO GENERALE La diagnosi di laboratorio di una infezione virale può essere eseguita seguendo due approcci differenti: approccio DIRETTO, a cui è riconducibile una ricerca di tipo virologico, si avvale di tecniche atte ad identificare il virus direttamente nel campione clinico. Ad eccezione dell isolamento colturale, sono metodiche rapide, in grado di fornire una risposta al quesito diagnostico in poche ore o, al massimo, in giornata. isolamento virale (coltivazione) ricerca di particelle virali (microscopia) ricerca di antigeni virus-specifici (immunoenzimatica, IF) ricerca di acidi nucleici virali (biologia molecolare) approccio INDIRETTO, a cui è riconducibile una diagnosi di tipo sierologico, si avvale di tecniche in grado di rilevare nel siero dei pazienti la presenza di anticorpi contro specifici antigeni virali: ricerca di anticorpi vs antigeni virus-specifici

4 RICERCA VIRALE

5 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE E il GOLD STANDARD tra le metodiche utilizzate in diagnosi virologica. I virus sono patogeni intracellulari obbligati, quindi: richiedono l inoculazione in ospiti viventi adeguati (cioè: sensibili e permissivi) OSPITI PER L ISOLAMENTO DI: Fagi (batteriofagi o virus batterici) Batteri Virus animali Animale Uova embrionate Coltura cellulare animale Virus vegetali Pianta Coltura cellulare vegetale

6 ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE OSPITI PER VIRUS ANIMALI Animale Topo, coniglio, maiale Embrione di pollo (uova embrionate) Ancora usata per la produzione di vaccini (influenzali) Colture cellulari Coltura di cellule adese a substrato (monostrato) oppure in sospensione (tessuto emopoietico: linfociti). Tre tipologie di coltura, a seconda dello spettro di infezione (n specie virali infettanti) e vita media: Colture primarie : cellule ottenute a seguito di separazione chimica/meccanica da campione bioptico. Ampio spettro di infezione virale ma vita a breve termine (1 generazione). Esempio: cellule di rene (canine, umane o di coniglio) per l isolamento di Paramyxovirus, Enterovirus, Adenovirus. Colture semicontinue (diploidi): derivano dall embrione umano. Spettro di infezione simile alle primarie, possono però essere mantenute per più generazioni (fino a 100). Esempio: fibroblasti fetali umani per isolamento di HSV, VZV, CMV, Adenovirus. Colture continue o trasformate : cellule trasformate (immortalizzate) ed aneuploidi, si replicano indefinitamente, sebbene presentino uno spettro di infezione più ridotto. Esempio: cellule HeLa, Caco-2, Hep-2.

7 ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE TECNICA DI ISOLAMENTO Procedura: 1.Trattamento del campione per limitare la inattvazione virale (es. neutralizzazione ph urine; decontaminazione batterica in campioni altamente contaminate) 2.Semina del campione 3.Mantenimento ed ispezione delle colture (33-37 C; 1-2 volte al giorno) 4.Rilevazione di avvenuta replicazione virale. formazione di placche (aree localizzate di lisi/distruzione cellulare) comparsa di effetti citopatici caratteristici (CPE) 5.Tipizzazione del virus

8 ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE TECNICA DI ISOLAMENTO Effetto citopatico (CPE o placca) Esposizione del monostrato cellulare al campione Rilevazione di antigeni virali (virus a crescita lenta o CPE-)

9 ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE MATERIALI BIOLOGICI

10 ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE CYTOPATHIC EFFECT (CPE) Sincizio: cellule giganti multinucleate formate dalla fusione, virus-indotta, di singole cellule. Paramyxovirus, Herpesvirus, HIV, RSV. RSV in coltura cellulare. Virus del morbillo. Sezione istologica di biopsia polmonare in paziente immunocompromesso con polmonite. Virus del morbillo. Cellule A549 (carcinoma gastrico umano).

11 ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE CPE Corpi di inclusione: cambiamenti istopatologici cellulari causati, direttamente od indirettamente, dal virus: corpi del Negri (Rhabdovirus) inclusioni di Cowdry di tipo A (Herpesvirus, varicella-zoster) inclusioni ad occhio di gufo (CMV) CMV: inclusioni ad occhio di gufo

12 ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE PLACCA LITICA Vaiolo su cellule di rene di scimmia (BSC40). Placca singola, 48 h. MOI: 1 Vaiolo su cellule di rene di scimmia (BSC40). Numerose placche, 48 h. MOI: 100 Formazione di placche litiche, evidenziate a seguito di colorazione con cristalvioletto Molteplicità di infezione (Molteplicity Of Infection, MOI): rapporto tra numero di agenti infettanti (batteri, virus) e numero di cellule infettate, presenti in un sistema sperimentale. Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-4

13 ISOLAMENTO (COLTIVAZIONE) VIRALE PRO & CON Consente di isolare, tipizzare e conservare il virus. Possibilità di isolare virus non sospettabili o non conosciuti al momento dell isolamento. Importante per HIV (diagnosi precoce in bambini nati da madri sieropositive) e CMV (diagnosi in bambini da madri con infezione in atto od immunodeficienti) Altamente sensibile e specifica, se associata ad ID sierologica TUTTAVIA: Richiede lunghi tempi di esecuzione, strumentazione dedicata, elevato expertise. E necessario un sospetto eziologico, in quanto i virus presentano un tropismo cellulare. Dipendente dalla presenza di virus vitali nel campione (la refrigerazione inattiva i virus «enveloped»). Impossibilità di coltivare alcuni virus (HPV, EBV, HBV, HCV, rotavirus). Poco sensibile (in caso di infezioni paucivirali) e specifico, se non associata ad altri tests (sierologici).

14 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI OSSERVAZIONE MICROSCOPICA Le ridotte dimensioni virali ( nm) richiedono l utilizzo della microscopia elettronica. Il campione viene attraversato da un fascio di elettroni in un sistema sotto vuoto; in tal modo, viene proiettata una immagine, ingrandita centinaia di migliaia di volte, su uno schermo a fluorescenza. L osservazione microscopica ha valore identificativo in quanto fornisce informazioni sulla forma, dimensioni, struttura ed organizzazione virale. Causa scarsa sensibilità della tecnica, il campione viene generalmente concentrato (ultracentrifugazione) prima dell osservazione, tranne che per campioni fecali o lesioni da HSV (10 11 virioni/ml). E possibile aumentare la sensibilità mediante utilizzo di anticorpi specifici (immunomicroscopia elettronica). La tecnica della colorazione negativa è quella più frequentemente utilizzata: adsorbimento virale su retino, quindi colorazione con un sale metallico pesante elettron-denso (acetato di uranile, acido fosfotungstico). colorazione del fondo ma non delle particelle virali (contrasto negativo); in realtà, anche i virus assorbono una piccola quantità di colorante che ne mette in evidenza alcuni dettagli strutturali.

15 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI OSSERVAZIONE MICROSCOPICA HIV Ebola virus SARS HBV

16 MICROSCOPIA ELETTRONICA PRO & CON Consente di identificare nuovi virus (es. coronavirus della SARS) Rapida (15-30 min) Specifica TUTTAVIA: Scarsa sensibilità: virioni/ml Elevati costi di gestione Richiesta di elevato expertise

17 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RICERCA DI ANTIGENI VIRALI E necessario disporre di sieri immuni (anticorpi anti-antigene) specifici. Tecnica impiegata nella diagnosi di numerose infezioni: A seconda del virus e, quindi, della tipologia del materiale da esaminare (cellule, feci, sangue-siero) possono essere applicate differenti tecniche: Immunofluorescenza (IF) Immunoperossidasi Immunoenzimatica In genere, la sensibilità di queste tecniche è maggiore di quella associata all isolamento virale.

18 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RICERCA DI ANTIGENI VIRALI Immunofluorescenza (IF): rivelazione fluorescente del complesso Ag-Ab mediante tecnica «diretta» od «indiretta» IF impiegata per la ricerca di: antigeni virali presenti nelle cellule epiteliali di sfaldamento delle vie respiratorie (BAL, aspirato naso-faringeo) (adenovirus, coronavirus, VRS, virus influenzali e para) o di occhio e cute (HSV, VZV); antigene precoce pp65 di CMV nei leucociti infetti. Coronavirus in cellule epiteliali di sfaldamento CMV all interno di leucociti

19 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RICERCA DI ANTIGENI VIRALI Immunoperossidasi (IP): rivelazione colorimetrica del complesso Ag-Ab similare alla IF, sebbene l anticorpo sia marcato con perossidasi di rafano che, in presenza di idoneo substrato, sviluppa una reazione colorimetrica molto utile se applicata a tessuti integri, colorati per l istochimica (definizione delle relazioni spaziali tra antigene virale e strutture cellulari). Ricerca di antigeni specifici mediante ELISA Ricerca immunoistochimica antigenica del West Nile virus nel cervello di hamsters infetti

20 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RICERCA DI ANTIGENI VIRALI Immunoenzimatica (ELISA, EIA): rivelazione colorimetrica complex Ag-Ab. sandwich test : anticorpo (specifico per un antigene) di cattura adsorbito ad una superficie plastica (pozzetto o biglia); legame con anticorpo di rilevazione direttamente marcato con un enzima o viene riconosciuto da un terzo anticorpo marcato in grado di legare Fc delle Ig utilizzabile anche per antigeni solubili non è influenzata dalla qualità (prelievo, trasporto) del campione E la metodica più frequentemente impiegata nei laboratori di virologia. Adatta per la ricerca di antigeni virali cellulo-associati, antigeni in fase fluida (sangue, liquor, siero) od antigeni rilasciati nel surnatante delle co-colture infette. Impiegata nella diagnosi rapida di virus respiratori (influenza, RSV), enterici (rotavirus), epatici (HBV) e HIV.

21 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RICERCA DI ACIDI NUCLEICI Permettono la rilevazione di quantità infinitesimali di acidi nucleici virali Tecnica rapida ed altamente sensibile (sensibilità teorica: 1 virione) Trovano particolare applicazione nella ricerca di virus: difficili o impossibili da coltivare (HPV, HIV, poliomavirus) a lenta crescita (CMV, VZV) ad elevata (enterovirus) o scarsa variabilità antigenica Non influenzata dalla qualità del campione e dalla sua vitalità Differenti tipologie di saggi molecolari: Tecniche che amplificano la sequenza bersaglio (PCR, TMA) Polymerase Chain Reaction (PCR): amplificazione di DNA target e rivelazione elettroforetica Transcription Mediated Amplification (TMA): amplificazione isotermica che impiega una transcrittasi inversa e T7 RNA polimerasi (maggiore efficienza di amplificazione vs PCR) Tecniche che amplificano il segnale di rilevazione (bdna, HC): bdna: rilevazione in chemioluminescenza (sonde marcate con fosfatasi alcalina complementari alla molecola di bdna) Hybrid capture (HC): ibridazione in fase liquida del DNA target denaturato con sonda a RNA specifica per la sequenza in esame

22 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RICERCA DI ACIDI NUCLEICI

23 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RICERCA DI ACIDI NUCLEICI: PCR

24 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RICERCA DI ACIDI NUCLEICI: HYBRID CAPTURE (HC) HC assay: utilizzato per la ricerca e la genotipizzazione di HPV

25 DIAGNOSI SIEROLOGICA DELLE INFEZIONI VIRALI

26 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RISPOSTA UMORALE (PRODUZIONE ANTICORPALE) La prevalente componente proteica della struttura virale rende il virione altamente immunogeno. Nel corso dell infezione virale vengono prodotte tutte le tipologie anticorpali: IgM, si manifestano precocemente (indice di infezione in atto/recente) e solo nella prima infezione di soggetto non immune. Scompaiono dopo alcune settimane. IgG, si presentano più tardivamente ma persistono per anni. Sono prontamente mobilizzate a seguito dei possibili successivi contatti con l antigene. Controllo virale a livello sierico. Più efficaci delle IgM. IgA secretorie mucosali, che svolgono un importante ruolo di barriera alla penetrazione virale delle mucose. La diagnosi sierologica si basa essenzialmente sulla ricerca di IgM o alternativamente: sieroconversione (comparsa di Ab specifici): indice di infezione (primaria) in atto aumento ( 4-fold) del titolo anticorpale (2 campioni: fase acuta vs convalescenza): indice di infezione (riattivazione o reinfezione) in atto. Generalmente preferita all isolamento, la diagnosi sierologica risente della reattività crociata tra virus appartenenti alla stessa famiglia (sierotipi) Le tecniche immunologiche per la ricerca di anticorpi virali comprendono: saggi FUNZIONALI saggi su MEMBRANA saggi di LEGAME

27 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RISPOSTA UMORALE (PRODUZIONE ANTICORPALE)

28 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RISPOSTA ANTICORPALE SAGGI FUNZIONALI: evidenziazione di specifiche attività derivanti dalla formazione dell immunocomplex: Saggio di neutralizzazione: Abs specifici neutralizzano un caratteristico effetto citopatico (CPE). Rappresenta il gold standard, sebbene costoso e timeconsuming. Reazione di inibizione dell emoagglutinazione: Abs specifici in grado di inibire l attività emoagglutinante di alcuni virus (influenza, parainfluenza, morbillo). Reazione di fissazione del Complemento: in presenza di Abs specifici si forma un immunocomplesso che lega il Complemento. In queste condizioni, il Complemento non può lisare gli eritrociti (sistema di rilevazione della formazione dell immunocomplesso: Ag + eritrociti).

29 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RISPOSTA ANTICORPALE Titolo anticorpale. Il titolo è il reciproco della più alta diluizione del siero del paziente che mantiene attività rilevabile nei confronti di un antigene noto: neutralizzare un CPE inibire la reazione di emoagglutinazione Nella diagnosi sierologica, il titolo anticorpale ci da informazioni sulla: sieroconversione (comparsa di Ab specifici): indice di infezione (primaria) in atto aumento ( 4-fold) del titolo anticorpale misurato in 2 campioni (fase acuta vs convalescenza): indice di infezione (riattivazione o reinfezione) in atto.

30 DIAGNOSI SIEROLOGICA DELLE INFEZIONI VIRALI SAGGIO DI NEUTRALIZZAZIONE CPE

31 DIAGNOSI SIEROLOGICA DELLE INFEZIONI VIRALI SAGGI DI INIBIZIONE EMOAGGLUTINAZIONE

32 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RISPOSTA ANTICORPALE SAGGIO SU MEMBRANA (Western blot): identificazione di Abs diretti verso singole e specifiche proteine virali. Procedura 1. separazione degli Ags virali (da cellule infette) mediante elettroforesi 2. trasferimento Ags su membrana 3. esposizione al siero in esame 4. sistema di rilevazione colorimetrica dell immunocomplex: Abs anti-ig umane marcati con enzima 5. aggiunta del substrato per l enzima 6. rilevazione segnale (colorimetrico, chemiluminescenza)

33 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI WESTERN BLOT

34 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI RISPOSTA ANTICORPALE SAGGI DI LEGAME (immunoenzimatico e radiometrico): 1. adsorbimento Ags su supporto solido (pozzetto o microsferule di polistirene) 2. aggiunta del siero in esame 3. rilevazione immunocomplex mediante aggiunta Ab 2 ario anti-igg umane marcato con: EIA (saggio immunoenzimatico): enzima in grado di reagire con idonei substrati; reazione colorimetrica, misurata allo spettrotometro. RIA (saggio immunoradiometrico): isotopo radioattivo ( 125 I); segnale misurato con un contatore di raggi. Sensibilità RIA > EIA. Tuttavia, il saggio EIA viene comunemente preferito perchè automatizzabile, versatile, standardizzabile.

35 DIAGNOSI DI LABORATORIO DELLE INFEZIONI VIRALI EIA RIA

36 DETERMINAZIONE DEL TITOLO VIRALE

37 DETERMINAZIONE DEL TITOLO VIRALE MICROSCOPIA ELETTRONICA La microscopia elettronica può essere utilizzata anche per valutare il titolo virale presente in un campione. 1. La sospensione virale viene posta su un retino per ME e colorato. 2. Alla sospensione viene aggiunta una quantità nota di sfere di latex. 3. Il rapporto relativo sfere-virus fornisce una stima della carica virale. Non è una tecnica standardizzata e di uso frequente Richiede un sufficiente numero di particelle virali. Adatto per diagnosi di infezioni con massiva eliminazione virale (Rotavirus) Aggiunta di anticorpi specifici per aumentare la sensibilità (immunoelettromicroscopia) Sovrastima del titolo Microfotografia di una goccia contenente microsfere in lattice (sferiche) ed unità di virus vaccinico (Poxvirus) (più piccole, forma a mattone ). (Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, 2001)

38 MISURAZIONE DELLA CONCENTRAZIONE DELLE UNITÀ (VIRALI) INFETTANTI Titolo virale (ufp/ml) Concentrazione di unità infettanti in grado di indurre la formazione di placche (ufp) in cellule animali in coltura od in uova embrionate Dose letale 50 (LD 50 ) Numero (titolo) di virus che uccide il 50% di un gruppo di cavie infettate sperimentalmente Dose di coltura tessutale (TVD) Numero di virus che causa effetto citopatico in coltura cellulare Dose infettante (ID 50 ) Numero di virus che dà inizio a sintomi rivelabili, o risposta anticorpale, nel 50% di un gruppo di cavie infettate sperimentalmente

39 CALCOLO DI LD 50

40 DETERMINAZIONE DEL TITOLO VIRALE SAGGIO DI PLACCA (PLAQUE ASSAY) Titolo virale = 100 ufp (unità formanti placca) x 10 5 (fattore diluizione) = 1 x 10 7 ufp/ml Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-5

41 DETERMINAZIONE DEL TITOLO VIRALE INOCULAZIONE DI UOVA EMBRIONATE Davis, Duylbecco, Eisen, Ginsberg Microbiology 4 th ed, J.B. Lippincott 1990, Fig Formazione di pocks emorragici indotte da cowpox virus sulla membrana corion-allantoidea (CAM) di embrioni di pollo, a seguito di incubazione per 3 gg a 37.5 C. Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-1

42 DETERMINAZIONE DEL TITOLO VIRALE SAGGIO DI EMOAGGLUTINAZIONE 1. Allestire diluizioni seriali 2-fold del campione (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, ) 2. Aggiungere 1% RBC animali (maiale, pollo) 3. Incubare a +4 C per 1-2 h 4. Lettura risultati Titolo virale = reciproco della max diluizione virale che causa emoagglutinazione = 32 unità HA/ml

43 DETERMINAZIONE DEL TITOLO VIRALE SAGGIO DI EMOAGGLUTINAZIONE Saggio di emoagglutinazione. Sette differenti campioni, numerati da 1 a 7, sono stati diluiti serialmente come indicato nella prima riga, esposti ad eritrociti di pollo, ed incubati in ghiaccio per 1-2 h. I pozzetti dell ultima riga non contengono virus (ctrl negativo). Il Titolo è indicato a destra dell ultima colonna. (Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Fig. 2-8)

44 sensibilità DETERMINAZIONE DEL TITOLO VIRALE SENSIBILITA TECNICA Tecnica Conta al microscopio elettronico Quantità (per ml) particelle EM Saggio in uova embrionate 10 9 egg ID 50 Saggio di formazione di placca Saggio di emoagglutinazione 10 8 ufp 10 3 unità HA Fields Virology, 4th ed, Knipe & Howley, eds, Lippincott Williams & Wilkins, 2001, Table 2-4