Traduzione: dal RNA messaggero alle proteine Sintesi proteica

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2 La traduzione Necessita di: (Codice) mrna trnas Ribosomi Amminoacidi Aminoacil-tRNA sintetasi Fattori di inizio, allungamento, termine ATP GTP

3 5 -ATGCCTAGGTACCTATGA-3 3 -TACGGATCCATGGATACT-5 Transcription 5 -AUGCCUAGGUACCUAUGA-3 decoded as 5 -AUG CCU AGG UAC CUA UGA-3 Translation N-MET-PRO-ARG-TYR-LEU-C DNA mrna Protein

4 CODICE GENETICO passaggio da un codice a 4 lettere (nucleotidi) ad un codice a 20 lettere (amminoacidi) DNA 4 lettere RNA 4 lettere Proteine 20 lettere Come si passa dai nucleotidi agli amminoacidi? D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

5 N o. nucleotidi/a.a. Possibilità =4 4 2 = =64 Minimo codice proponibile

7 U C A G U C A G UUU Phe UUC Phe UUA Leu UUG Leu CUU Leu CUC Leu CUA Leu CUG Leu AUU Ile AUC Ile AUA Ile AUG Met GUU Val GUC Val GUA Val GUG Val UCU Ser UCC Ser UCA Ser UCG Ser CCU Pro CCC Pro CCA Pro CCG Pro ACU Thr ACC Thr ACA Thr ACG Thr GCU Ala GCC Ala GCA Ala GCG Ala UAU Tyr UAC Tyr UAA End UAG End CAU His CAC His CAA Gln CAG Gln AAU Asn AAC Asn AAA Lys AAG Lys GAU Asp GAC Asp GAA Glu GAG Glu UGU Cys UGC Cys UGA End UGG Trp CGU Arg CGC Arg CGA Arg CGG Arg AGU Ser AGC Ser AGA Arg AGG Arg GGU Gly GGC Gly GGA Gly

8 Il codice è di 3 lettere= 64 combinazioni. È degenerato. Il numero dei codici per un particolare amminoacido e correlato alla sua frequenza nelle proteine

9 Quadri di lettura -Reading frames I codoni sono letti senza interruzioni. Esistono tre potenziali reading frames per un mrna Quadro di lettura aperto open reading frame : un quadro di lettura che non presenta un codone di terminazione per piu di 50 nucleotidi consecutivi.

13 APPAIAMENTO CODON-ANTICODON Il numero massimo di codoni che puo essere riconosciuto da un trna= 3 D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2014

14 Appaiamento codon-anticodon ipotesi della oscillazione I base anticodone C A U G I III base del codone G U A o G U o C U, C o A

15 Riconoscimento codon-anticodon Le prime due basi di un codone formano sempre solidi appaiamenti di Watson-Crick con le basi corrispondenti dell anticodone del trna e conferiscono la maggior parte della specificità di codificazione La terza base della maggior parte dei codoni si appaia in «modo libero» con la prima base dell anticodone (ipotesi dell oscillazione). La prima base di alcuni anticodoni determina il numero di codoni letti da uno specifico trna. Il numero massimo di codoni che possono essere letti da un trna sono 3 (quando è presente Inosina nella prima posizione dell anticodone). Per la traduzione di tutti i 61 codoni sono necessari 32 trna.

16 a ATTIVAZIONE DEGLI AMMINOACIDI- FORMAZIONE DELL AMMINOACIL-tRNA

17 Aminoacil-adenilato + trna Aminoacil-tRNA + AMP

19 AMINO-ACYL trna SYNTHETASES One synthetase for each amino acid. A single synthetase may recognize multiple trnas for the same amino acid Two classes of synthetase. Different 3-dimensional structures Differ in which side of the trna they recognize and how they bind ATP Class I - monomeric, acylates the 2 OH on the terminal ribose Class II - dimeric, acylate the 3 OH on the terminal ribose

22 Structure of an amino acyl-trna synthetase bound to a trna

23 L INTERAZIONE TRA UN AMINOACIL-tRNA SINTETASI E UN trna: SECONDO CODICE GENETICO Uguali in tutti i trna D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

25 Accuratezza dell amminoacil-trnasintetasi Alcuni aa sono molto simili (es Ile e Val) Errori 1/10 4

26 ALCUNE AMMINOACIL-tRNA SINTETASI HANNO UN ATTIVITA DI CORREZIONE

27 Editing dell aminoacil-trna Il braccio flessibile contenente CCA di un trna puo spostare l aminoacido dal sito di attivazione al sito di editing D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

28 Two levels of control to ensure that the proper amino acid is incorporated into protein 1) Charging of the proper trna

29 2) Matching the cognate trna to the messenger RNA

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31 and mitochondria

32 Ribosome Assembly: takes place largely in a specialized domain of the nucleus, the nucleolus

33 Ribosomal Proteins decorate the surface of the ribosome The ribosomal proteins are important for maintaining the stability and integrity of the ribosome, but NOT for catalysis ie. the ribosomal RNA acts as a ribozyme Large subunit. Grey = rrna Gold = ribosomal proteins D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

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35 Ribosomal proteins often have extensions that snake into the core of the rrna structure Crystal structure of L19 D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006 L15 (yellow) positioned in a fragment of the rrna (red)

36 The large and small subunits come together to form the ribosome Mitochondrial or Prokaryotic Eukaryotic 60S subunit 80S ribosome 40S subunit rosso e blu: proteine giallo: rrna 23S arancio: rrna 5S verde: rrna 16S D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

37 Three trna binding sites: A site = amino-acyl trna binding site P site = peptidyltrna binding site E site = exit site D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 4/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2006

38 Sequenze segnali di inizio per la sintesi proteica nei batteri Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed

39 Sequenze segnali di inizio per la sintesi proteica nei batteri Il sito di inizio della sintesi delle proteine e determinato da due tipi di interazione: l appaiamento di basi tra l mrna e l estremita 3 del rrna 16S L appaiamento del codone d inizio del mrna con l anticodone di una molecola di trna iniziatore D. L. Nelson, M. M. Cox, I PRINCIPI DI BIOCHIMICA DI LEHNINGER 6/E, Zanichelli Editore S.p.A. Copyright 2014

40 LA SINTESI PROTEICA INIZIA CON UNO SPECIFICO AMMINOACIDO AUG: codone unico per la metionina Tutti gli organismi hanno due trna per la metionina: -uno inserisce la metionina come primo amminoacido appaiandosi con l AUG di inizio e si posiziona nel sito P del ribosoma; -l altro inserisce la metionina in posizioni interne della proteina appaiandosi ad AUG interni e si posiziona nel sito A del ribosoma; -la metionina viene legata a questi due trna dalla stessa amminoacil-trna sintetasi.

41 FORMILAZIONE DELLA METIONINA (Procarioti) Metionina + trna fmet +ATP Met-tRNA fmet + AMP + PPi Met-tRNA fmet + N 10- Formiltetraidrofolato fmet-trna fmet + tetraidrofolato enzima transformilasi

42 Formazione del complesso di inizio della traduzione nei batteri Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

43 Fase di allungamento Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

44 FORMAZIONE DEL LEGAME PEPTIDICO I legami peptidici si formano trasferendo la catena polipeptidica da un trna all altro: reazione peptidiltransferasica

45 Fase di allungamento Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

46 Peptidil transferasi Il sito catalitico della peptidil transferasi non e in una proteine ma nell RNA 23S Un Adenina sembra avere un ruolo nell attivare la nucleofilicità dell N del aa

47 Fase di traslocazione EF-Tu-tRNA EFG-GDP trna (verde) Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

49 SINTESI PROTEICA CONFRONTO PROCARIOTI-EUCARIOTI Ribosomi trna di inizio Inizio -selezione AUG -fattori di inizio Struttura del mrna Fattori di rilascio

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51 Fase di inizio negli eucarioti La subunità minore associata al trna iniziatore con legata la Met lega il CAP La subunità minore scorre sul mrna fino a trovare AUG nel contesto giusto (sequenza Kosak, 5 -G/ANNAUGG-3 ) Intervengono 30 proteine, tra cui i fattori di inizio eucariotici (eif2, eif4e, eif4g) Un elicasi elimina le strutture secondarie dell mrna tra il CAP e l AUG d inizio

52 FASE D INIZIO NEGLI EUCARIOTI A) C) B) D) Berg J, Tymoczko JL, Stryer L. Biochimica- Zanichelli 6 ed

53 STRUTTURA CIRCOLARE DEL mrna DEGLI EUCARIOTI Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed. Alterazioni funzionali di eif-4g nella sindrome del cromosoma X fragile e in diversi tumori (es. tumore della prostata)

55 Translation Inhibitors are important antibiotics

56 Interruzione della sintesi proteica: antibiotico puromicina Nelson & Cox I principi di Biochimica di Lehninger- Zanichelli 6 ed.

57 TOSSINA DIFTERICA Corynebacterium diphtheriae

58 ADP-RIBOSILAZIONE

59 TOSSINA DIFTERICA- ADP-RIBOSILAZIONE DEL FATTORE EF-2 (traslocasi)

60 Ricino tossina Proteina eterodimerica Subunita B: legame ad un recettore di membrana Subunita A: rimuove una adenina dal 28S RNA Inibisce l allungamento della sintesi proteica Usata per assassinare il dissidente bulgaro in esilio Georgi Markov, a Londra, nel Un ombrello con un meccanismo a molla per iniettare nel sottocute delle sferette metalliche caricate con la tossina

61 CONTROL OF TRANSLATION Protein synthesis is often regulated at the level of translation initiation

62 AN EXAMPLE OF CONTROL OF SPECIFIC mrnas regulation by iron (Fe) Ferritin is a cytosolic iron binding protein expressed when iron is abundant in the cell. Transferrin receptor is a plasma membrane receptor important for the import of iron into the cytosol. They are coordinately regulated, in opposite directions, by control of protein synthesis.

63 Regulation by iron (Fe):

64 There is also general control of translational initiation ie. all transcripts of the cell are affected (though the relative effect differs between specific mrnas) Global downregulation or upregulation can occur in response to various stimuli, the most common are 1) Nutrient availability low nutrient (amino acids/carbohydrate) downregulates translation 2) Growth factor signals stimulation of cell division upregulates translation

65 GENERAL CONTROL OF TRANSLATIONAL INITIATION IS EXERTED THROUGH TWO PRIMARY MECHANISMS Control of the phosphorylation of eif2 Control of the phosphorylation of eif4 binding proteins

66 FATTORE DI INIZIO EIF2

67 FOSFORILAZIONE DI EIF2 1) chinasi regolata dall eme The regulation of translation by heme controlled inhibitor (HCI).

68 FOSFORILAZIONE DI EIF2 indotta indirettamente dall interferone

69 Control of translation by eif4e availability The 7ME G cap binding subunit of eif4, eif4e, is sequestered by eif4e binding protiens (4E-BPs). The binding of these proteins is regulated by their phosphorylation state Growth Factors Nutrient Limitation

70 Nutritional controls 2 Nutritional signals can control both the recognition of the mrna and loading of the 40S subunit.