Espressione di proteine ricombinanti
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- Taddeo Napolitano
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1 Espressione di proteine ricombinanti
2 Purificazione di una GSTfusion protein (1)
3 Purificazione di una GSTfusion protein (2)
4 GST pull-down Assay gene GST pge express GST-fusion protein in E.coli prepare protein extract from brain mix and incubate
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6 Yeast Two-hybrid System Y
7 Regolazione dell espressione genica nel lievito (1) activation domain DNA binding domain UAS (upstream activation sequence) transcription machinery gene
8 Regolazione dell espressione genica nel lievito (1) Regulation of gene expression in yeast transcription activator activation domain DNA binding domain transcription machinery Do these two protein bind? Y UAS (upstream activation sequence) gene We start with yeast possessing a reporter gene (a gene making a product that is easy to detect). And now we introduce genes coding for two hybrid proteins... reporter gene
9 Regulation of gene expression in yeast transcription activator activation domain DNA binding domain transcription machinery Do these proteins bind? UAS (upstream activation sequence) gene Y Y our two hybrid proteins bind! thus forming a functional transcription activator... Y Y yes, we have expression of the reporter indicating that the proteins bind! do we get expression of the reporter? reporter gene
10 A pesca con il 2HS bait predator Y in other words is there a protein Y? does bind with a protein? To find out we are going to go fishing with the two-hybrid system. We will use as bait... to try to catch Y. As reference in this description, here is how the yeast two-hybrid expression system works. bait Y prey transcription machinery lac 2 -galactosidase -gal blue color
11 bait predator Y bait protein cdna for does bind with a protein? DNAbinding domain yeast plasmid expression vector transfection transformed yeast We'll start by making transformed yeast expressing bait Y prey transcription machinery lac 2 -galactosidase -gal blue color
12 bait predator Y bait protein cdna for predator unknow tissue does bind with a protein? DNAbinding domain transfection yeast plasmid expression vector total mrna reverse transcriptase cdna yeast plasmid expression vector transformed yeast transformed yeast? Y transfection Now we'll make transformed yeast expressing Y, if Y does indeed exist. activation domain bait Y prey transcription machinery lac 2 -galactosidase -gal blue color
13 bait predator Y bait protein cdna for predator unknow tissue does bind with a protein? DNAbinding domain transfection yeast plasmid expression vector total mrna reverse transcriptase cdna yeast plasmid expression vector transformed yeast transfection activation domain transfection re-transformed yeast Y extract plasmids Now we make re-transformed yeast. We have a Y if we have expression of the (lac) reporter gene. bait Y prey transcription machinery lac 2 -galactosidase -gal blue color
14 bait predator Y bait protein cdna for predator unknow tissue does bind with a protein? DNAbinding domain transfection transformed yeast yeast plasmid expression vector transfection total mrna reverse transcriptase cdna yeast plasmid expression vector activation domain transfection re-transformed yeast extract plasmids agar plate positive yeast containing bait plus predator! the fishing was good! bait Y prey transcription machinery lac 2 -galactosidase Y? -gal blue color
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16 Applicazioni Terapeutiche Nel considerare le applicazioni delle tecnologie ricombinanti alla terapia occorre distinguere: Terapia delle malattie genetiche Terapia genetica delle malattie I nuovi approcci terapeutici che si fondano sul bagaglio di conoscenze acquisite nel campo della genetica e delle biotecnologie rappresentano il campo prevalente d interesse della maggior parte dei gruppi di ricerca nel mondo.
17 Terapia delle malattie genetiche In genere, una malattia genetica si considera incurabile sebbene oggi trattamenti terapeutici, anche tradizionali, possono migliorare le aspettative di vita. Per alcuni errori congeniti del metabolismo, la conoscenza dei meccanismi biochimici che sottostanno al difetto genetico ha permesso di definire approcci terapeutici efficaci: Esclusione di determinate sostanze dalla dieta. Nella Fenilchetonuria (deficit di fenilalanina idrossilasi) la fenilalalina e rimossa dalla dieta eliminando le proteine di origine animale. Sostituzione di un prodotto deficitario. Somministrazione dell ormone tiroideo di sintesi in bambini con ipotiroidismo congenito. Utilizzo di percorsi alternativi per rimuovere sostanze tossiche. Nell emocromatosi ereditaria, salassi periodici consentono di eliminare l accumulo di Fe, tossico per diversi tessuti ed organi.
18 Principi di terapia genica (1) La terapia genica comporta la modifica genetica diretta delle cellule del paziente al fine di ottenere un risultato terapeutico. Possiamo distinguere: Terapia genica della linea germinale, che produce una modificazione permanente e trasmissibile con la modificazione di un gamete, uno zigote o embrione precoce (Tecniche non consentite per motivi etici dalle legislazioni di molti stati). Terapia genica delle cellule somatiche, che punta a modificare cellule o tessuti specifici di un paziente, limitatamente a quel paziente.
19 Principi di terapia genica (2) Sono disponibili diversi approcci per la modifica di cellule somatiche: Integrazione genica, che punta a fornire una copia funzionale del gene difettivo (utile in patologie caratterizzate da perdita di funzione)
20 Principi di terapia genica (3) Sostituzione genica, che punta a sostituire il gene mutante con una copia funzionale del gene (utile in patologie caratterizzate acquisizione di funzione).
21 Principi di terapia genica (4) Inibizione mirata dell espressione genica, che punta spegnere l espressione indesiderata di un gene mutante (silenziamento di oncogeni nei tumori, risposte indesiderate in malattie autoimmuni, acquisizione di funzione in malattie ereditarie).
22 Principi di terapia genica (5) Eliminazione mirata di cellule specifiche, che punta a distruggere le cellule malate (terapia dei tumori).
23 Inserire un gene in una cellula o in un tessuto Il trasferimento genico può essere realizzato secondo due approcci differenti: ex vivo, cioè in laboratorio su cellule prelevate dal paziente che vengono geneticamente modificate in laboratorio, selezionate positivamente in culture e reintrodotte nel paziente (cellule emopoietiche, cellule della pelle, ecc.). in vivo, il costrutto per il trasferimento genico viene direttamente iniettato nel paziente (in genere trasportato da un vettore virale) e, possibilmente, viene captato dalle cellule che richiedono la correzione per inserzione/ricombinazione con il gene trasfettato. E l approccio ideale per corregere errori genetici che coinvolgono cellule non prelevabili e coltivabili in vitro (tessuto muscolare, nervoso, ecc.).
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25 DA TELETHON LA PRIMA TERAPIA GENICA DI SUCCESSO NEL MONDO Presso l istituto Telethon di Terapia genica HSR-TIGET sono stati curati definitivamente sette bambini affetti da ADA-SCID. Il protocollo clinico messo a punto da HSR- TIGET è il primo protocollo di terapia genica al mondo ed è stato adottato dall ente regolatorio statunitense Food and Drug Administration (FDA). A oggi, sono stati condotti circa un migliaio di studi clinici di terapia genica in tutto il mondo Lo studio che ha portato alla cura definitiva di pazienti è stato condotto presso l istituto TELETHON TIGET su sette bambini affetti dalla grave immunodeficienza genetica ADA-SCID.
26 Integrazione genica Per ottenere un espressione genica stabile il gene estraneo deve essere stabilmente integrato in un cromosoma della cellula ospite (preferibilmente una cellula staminale). Questo può comportare dei rischi l integrazione casuale può portare alla distruzione di altri geni. attivazione di oncogeni. ridotta espressione del gene esogeno. Vettori di terapia genica che restano in forma episomale extracromosomica sarebbero preferibili ma hanno lo svantaggio di una espressione genica limitata nel tempo.
27 Vettori virali per la terapia genica (1) Vettori oncoretrovirali I retrovirus sono virus a RNA che, per trascrittasi inversa sono capaci di sintetizzare una copia di cdna del loro genoma. L integrazione nel genoma della cellula ospite richiede che la cellula si divida, consentendo a genoma retrovirale l accesso ai cromosomi. Retrovirus geneticamente modificati, privati cioè di geni non essenziali all integrazione del genoma virale nel genoma dell cellula ospite possono essere utilizzati in terapia genica per veicolare geni esogeni fino a 8 Kb. Rischi connessi con l integrazione casuale.
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29 Vettori virali per la terapia genica (2) Vettori adenovirali gli adenovirus sono virus a DNA che, nell uomo producono infezioni delle prime vie respiratorie. Il genoma virale è a doppio filamento e resta in forma episomale (non si integra al genoma della cellula ospite). Maggiore sicurezza per mancanza d integrazione. Minore efficienza perché l espressione del gene inserito non permane a lungo nel tempo. Rischi correlati all elevata immunogenicità degli edenovirus (morte di un paziente durante un trial clinico) Campo applicativo ideale: terapia dei tumori in cui si richiedono elevati livelli di espressione del gene inserito per brevi periodi.
30 Vettori virali per la terapia genica (3) Vettori basati su virus adeno-associati I virus AAV sono a DNA a singolo filamento e necessitano di un virus helper (adenovirus, HSV) coinfettante per un infezione produttiva. L AAV umano si integra specificamente a 19q13.3-qter (espressione a lungo termine senza rischio di mutagenesi) Nei vettori AAV il 96% del genoma virale è rimosso e sostituito con il gene esogeno (elevato grado di sicurezza) La capacità e limitata a massimo 4.5 Kb.
31 Lentivirus Vettori virali per la terapia genica (4) I lentivirus sono una famiglia di retrovirus che presentano la caratteristica d infettare cellule che non si dividono. Come per gli altri retrovirus il genoma virale modificato è integrato nel genoma dell ospite con in rischi che ciò comporta. La maggior parte dei vettori lentivirali sono derivati dall HIV. Vettori basati sull HSV Sono vettori ancora in fase di studio che presentano però il vantaggio dello specifico organotropismo dell HSV per il SNC.
32 Oltre il 60% dei trial di terapia genica è dedicato alla cura dei tumori.
33 Terapia genica della LGMD2F La LGMD2F è una grave forma di distrofia muscolare dei cingoli autosomica recessiva, caratterizzata da mutazione nel gene del d-sarcoglicano. Normal tissue LGMD Centralized nuclei Necrotic areas
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35 Modello animale: Hamster BIO14.6 Stages of the disease Clinical Effects days days days 100 days 150 days 180 days 7-12 months 14 months Tongue calcifications Cardiac necrosis Muscular necrotic lesions Myocardial hypertrophy Severe myocardial hypertrophy Muscular lesions are replaced by Muscular and cardiac lesions are replaced by fibrosys and calcifications Heart failure Premature death
36 AAV vectors AAV is a small (4.7Kb), single stranded DNA virus Contains two open reading frames (Rep and Cap) between T-shaped palindromic elements, the inverted terminal repeats (ITRs) Replication defective in the absence of a helper virus Advantages: 5 3 REP Non-pathogenic virus Transduces both dividing and non-dividing cells The expression of exogen gene is long-lived Dozens serotypes described pseudotyped AAV vectors ITR CAP ITR
37 Sierotipi dei vettori AAV disponibili AAV genome plasmid Packaging plasmid Virion Target Tissue Rep 2 Cap 1 AAV2/1 Muscle Rep 2 Cap 2 AAV2/2 Muscle-Liver-Retina Rep 2 Cap 3 AAV2/3 Inner ear ITR Hs d-sg ITR Rep 2 Cap 4 AAV2/4 SNC, Retina Rep 2 Cap 5 AAV2/5 Lung Rep 2 Cap 7 AAV2/7 Muscle Rep 2 Cap 8 AAV2/8 Muscle-Liver Rep 2 Cap 9 AAV2/9 Heart, Lung
38 BIO14.6 AAV2/1 d-sarcoglycan
39 Immunofluorescenza (1) WT NT -Hs Heart Gastr. Tongue
40 Immunofluorescenza (2) 2 w 2/8 2 w 2/9 -Hs -Hs Heart Gastr. Tongue
41 Immunofluorescenza (3) 2/8-2/1 -Hs Heart Gastr. Tongue
42 Il cuore a 5 mesi di età
43 Dopo 40 minuti di esercizio fisico BIO14.6 Single Injection Double Injection
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