6. Terapia genica Terapia genica ex vivo ed in vivo

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1 6. Terapia genica 6.1. Terapia genica ex vivo ed in vivo 6.2. Oligonucleotidi (Triple helix-forming Oligonucleotides- TFO, Transcription factor decoy, antisenso/ribozimi, sirna/mirna, aptameri) 6.3. Produzione di animali transgenici Applicazioni della transgenesi animale in campo farmaceutico (animali transgenici produttori di biofarmaci, donatori di tessuti ed organi nello xenotrapianto, modelli di malattie umane nella ricerca biomedica).

2 TERAPIA GENICA uso di acidi nucleici come agenti terapeutici Inserimento di DNA normale direttamente nelle cellule per correggere un difetto genetico. Trattamento di una patologia mediante sostituzione, modificazione o supplementazione di un gene che è assente o anomalo e la cui assenza (funzionale) è responsabile di una malattia. I bersagli ottimali della terapia genica applicata alle cellule somatiche sono le malattie monogeniche un singolo gene mutato può essere sostituito mediante trapianto di un gene sano. Ad oggi, la vera e propria sostituzione dei geni difettivi non è possibile, ma è possibile aggiungere ad un gene mutato (recessivo), copie multiple di un gene sano (dominante). Il trasferimento genico può essere utilizzato anche per aumentare la capacità delle cellule di contrastare alcune patologie, come cancro e malattie infettive.

3 CENNI STORICI ANNI 40: Avery, Mc Leod, McCarty dimostrarono che il principio attivo è il DNA ANNI 70: primi vettori e tecnologie per il trasferimento genico in cellule eucariotiche (prime proposte di terapia genica contro il cancro) ANNI 80: Martine Cline esegue esperimenti di trasferimento genico non autorizzato nell uomo Primi esperimenti di terapia genica autorizzati su bambini con deficienza di ADA ANNI 90: Studi clinici per il deficit da ADA e per la terapia genica antitumorale mediante linfociti ingegnerizzati esprimenti TNF-a. (Human Gene Ther 1: 327, 1990) ORIENTAMENTI ATTUALI 4 indirizzi di sviluppo: malattie ereditarie, oncologiche, infettive, degenerative ed autoimmuni Due società scientifiche: European Society of Gene Therapy (ESGT); American Society of Gene Therapy (ASGT) Riviste internazionali specializzate: Human Gene Therapy, Gene Therapy, J. of Gene Medicine, Molecular Therapy, Cancer Gene Therapy

4 Science Dec 11;214(4526):1220. Cline loses two NIH grants. Sun M. Abstract KIE: To the surprise of some observers, the National Institutes of Health recently issued a second set of sanctions against Martin Cline for violating its regulations governing recombinant DNA research and human experimentation. Cline is the UCLA professor who prematurely conducted the first gene therapy experiments in humans in July Acting NIH director Thomas Malone accepted the recommendations of the advisory councils of the three institutes funding Cline: the Heart Institute terminated its grant to Cline; the Arthritis Institute decided to continue funding him for nonclinical research; and the Cancer Institute terminated one of Cline's two grants. Dr. Martin Cline without the approval of his UCLA IRB, performed recombinant DNA transfer into cells of the bone marrow of two patients with hereditary blood disorders in Italy and Israel.

5 DIVERSI APPROCCI DI TERAPIA GENICA Trapianto genico (a pazienti con delezione genica) Correzione genica (revertire una mutazione specifica nel gene di interesse) Aumento genico (per aumentare l espressione del gene di interesse) Uccisione mirata di cellule specifiche mediante introduzione di un gene killer Ablazione genica (inibizione mirata dell espressione genica)

6 PATOLOGIE studiate nei trials di terapia genica

7 NUMERO DI TRIALS DI TERAPIA GENICA APPROVATI ( ) Totale = 1559

8 DISTRIBUZIONE GEOGRAFICA

9 PATOLOGIE IN STUDIO NEI TRIALS DI TERAPIA GENICA (I)

10 PATOLOGIE IN STUDIO NEI TRIALS DI TERAPIA GENICA (II)

11 TRIALS DI TERAPIA GENICA APPROVATI: vettori

12 TRIALS DI TERAPIA GENICA APPROVATI: Fase

13 TRIALS CLINICI FASE PRECLINICA: esperimenti sistematici in vitro (in provetta) ed in vivo (animali o colture cellulari) utilizzando un ampio range di dosi del farmaco per ottenere dati preliminari su: efficacia, tossicità, farmacocinetica e farmacodinamica TRIALS DI FASE I: su un piccolo numero (6-10) di pazienti umani; servono spesso a verificare la sicurezza di un prodotto TRIALS DI FASE II: su un numero più ampio di pazienti per verificare l utilità del prodotto TRIALS DI FASE III: su un campione numeroso comprendono l analisi esauriente della sicurezza e dell efficacia del prodotto

14 Terapia genica In vivo Ex vivo

15 Gene transfer technology In vivo Ex vivo Therapeutic Gene Therapeutic Gene Vector or liposomes for in vivo Gene Transfer Biopsy Liver Engraftment Delivery Vector for ex vivo Gene Transfer Growth Factors

16 In vivo gene therapy Il materiale genetico è trasferito direttamente nel corpo del paziente E un processo abbastanza casuale: poco controllo sui siti di espressione; poca manipolazione Utilizzata per la trasduzione dei tessuti che non possono crescere in vitro, oppure se le cellule trasdotte non possono essere ritrasferite nell ospite Ex vivo gene therapy Il materiale genetico è trasferito in cellule cresciute in vitro Processo estremamente controllato: le cellule trasdotte sono selezionate ed espanse; molte manipolazioni Le cellule sono solitamente autologhe e dopo la manipolazione reinfuse nel paziente

17 Administration of Gene Therapy Vectors

18 Il primo prodotto di Terapia Genica approvato: adenovirus ricombinante esprimente il transgene p53

19 PATOLOGIE studiate nei trials di terapia genica AIDS CF; SCID Correction of genetic mutation Immunotherapy Oncolytic viruses

20 Terapia genica del cancro: IMMUNOTERAPIA A. Iniezione diretta di un vettore esprimente molecole immunostimolatorie o antigeni tumore-specifici B. Cellule isolate dal paziente o altre linee tumorali sono trattate con il vettore in coltura, quindi irradiate e reinfuse al paziente C. Cellule T o cellule del midollo osseo del paziente sono mantenute in coltura in presenza di antigeni tumorali: quelle in grado di attaccare e rimuovere le cellule tumorali sono reinfuse al paziente

21 PROBLEMI PIÙ COMUNI NEI TRIALS DI TERAPIA GENICA Tossicità acuta dovuta all introduzione di materiale estraneo Risposta cellulo-mediata verso le cellule trasdotte Riposta umorale verso il prodotto del gene terapeutico Mutagenesi inserzionale (studio di nuovi vettori)

22 DIVERSI SISTEMI PER DIVERSE APPLICAZIONI Sistemi che permettono un espressione del gene terapeutico per lunghi periodi solo da parte di poche cellule (es. disordini genetici) Sistemi che permettono alti livelli di espressione ma solo per determinati periodi ( es. infezioni virali, cancro) Sistemi che permettono di esprimere il transgene solo in un determinato tipo cellulare

23 Come far entrare il DNA nelle cellule? Vettori virali Vettori non virali INTEGRAZIONE casuale sito-specifica

24 Two Types of Transfections Transient Short term No selection required Generally a small percentage of cells have transfected DNA Stable Permanent generates a new cell line Requires selection All cells have transfected DNA

25 Production of a stable cell line requires a Dominant Selectable Marker Promoter Neo G418 Promoter X

26 Il vettore ideale per il trasferimento genico Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato) In grado di garantire una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati) Capace di incorporare DNA di varie dimensioni In grado di garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dell espressione del gene terapeutico Capacità di integrarsi in un sito specifico del cromosoma o di essere mantenuto con successo come episoma Non patogeno Somministrabile direttamente nel paziente In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio Ben tollerato Senza componenti che inducono risposta immune Facile da produrre in maniera riproducibile

27 VETTORI NON VIRALI VIRALI Oligonucleotidi DNA plasmidico Lipidi cationici/dna (lipoplexes e polyplexes) Integranti: Retrovirus (Mo-MLV) Lentivirus (HIV-1) Adeno-Associati Non integranti: Adenovirus Herpesvirus

28 VETTORI NON VIRALI (I)

29 VETTORI NON VIRALI (II) VANTAGGI SVANTAGGI Produzione in grandi quantità Bassa immunogenicità, anche con somministrazioni ripetute Assenza di generazione di nuovi virus patogeni Possibilità di trasdurre molecole di DNA grandi e di trasferire diversi tipi di molecole Bassi costi di produzione Scarsa efficienza di trasduzione Possibilità di mutagenesi inserzionale, in caso di molecole di DNA a doppio filamento

30 Metodi di delivery (NON VIRALI) DNA nudo Calcio-fosfato / DEAE dextrano Lipidi cationici/liposomi Elettroporazione

31 DNA nudo (I) In alcuni casi il DNA può essere iniettato direttamente in un singolo tessuto senza l'utilizzo di nessun vettore (DNA nudo) come ad esempio nel muscolo, per mezzo di una semplice siringa. Quest'approccio è stato utilizzato per la distrofia muscolare di Duchenne.

32 DNA nudo (II) Shot-gun applicato per plasmidi e prodotti di PCR Trials clinici con iniezione intramuscolare Espressione bassa Ricerca di metodi più efficienti: Gene-gun spara DNA rivestito di particelle d oro, utilizzando gas ad elevata pressione Elettroporazione

33 Lipoplexes (I) Il DNA plasmidico può essere ricoperto con lipidi in una struttura organizzata, come unamicella o un liposoma struttura lipidica + DNA = LIPOPLEX 3 tipi di lipidi: 1. Anionici (carichi negativamente) 2. Neutri 3. Cationici (carichi positivamente): sicomplessano naturalmente con il DNA e interagiscono con le membrane cellulari internalizzati per endocitosi DNA rilasciato nel citoplasma proteggono ildna dalla degradazione cellulare.

34 Lipoplexes (II) Liposomi

35 Polimeri cationici: Polyplexes (I) Complesso formato da polimeri + DNA =POLYPLEX sicomplessano con il DNA tramite interazioni ioniche NON possono rilasciare il DNA nel citoplasma internalizzati per endocitosi cotransfezione con un agente litico dell endosoma Polyethylenimine, chitosano e trimetilchitosano hannoil proprio metodo di distruzione dell endosoma

36 Polyplexes (II) Transfezione DNA con Effectene

37 Polyplexes (III) Endocitosi mediata da recettore DNA associato a una molecola in grado di legare uno specifico recettore sulla superficie cellulare, inducendo così l'endocitosi e quindi il trasferimento del DNA all'interno delle cellule bersaglio. associazione ottenuta legando covalentemente polilisina alla molecola che lega il recettore (=ligando) sulla membrana cellulare e poi legando in modo reversibile il DNA del gene esogeno da introdurre alla polilisina stessa (interazioni elettrostatiche). ESEMPIO: epatociti caratterizzati dalla presenza di recettori di membrana per l'asialoglicoproteina. Complessando la polilisina all'asialoglicoproteina ed il DNA alla polilisina, si può veicolare il DNA nelle cellule del fegato, mediante iniezione endovena.

38 VETTORI VIRALI VANTAGGI SVANTAGGI Alta efficienza di trasduzione si tratta sempre di virus difettivi, che possono essere prodotti solo in particolari linee cellulari, capaci di complementare i difetti del virus. Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell ospite Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) Reazioni immunitarie Costi elevati

39 Schema generale per la costruzione di un vettore virale (I) I genomi virali contengono sia geni che sequenze regolatorie che agiscono in cis (sequenze responsabili della replicazione e della incapsidazione). La maggior parte delle sequenze che agiscono in cis si trovano al di fuori dei geni virali. I prodotti dei geni virali agiscono in trans. I geni virali e le sequenze che agiscono in cis sono separate su DNA diversi: le sequenze cis sono associate al gene terapeutico ed introdotte nella stessa cellula i geni virali possono essere forniti da un virus helper, da un plasmide o essere stabilmente integrati nel DNA della cellula packaging produzione di particelle trasducenti difettive nella replicazione

40 Schema generale per la costruzione di un vettore virale

41 Schema generale per la costruzione di un vettore virale

42 Differences in Viral Delivery of Transgenes Adenovirus: ds DNA Episomal ds DNA element Adeno-associated Virus: ss DNA Potentially selective integration into chromosome 19 (human) Retrovirus: ss RNA Random integration into chromosomes - -

43 Vettori Adenovirali (I) ADENOVIRUS: struttura base struttura icosaedrica regolare (70-90 nm diametro), senza envelope Capside: 252 componenti proteiche, di cui la maggioranza costituita da: fiber e penton based proteins importanti per il legame ai recettori e per l internalizzazione; hexon comprende la maggior parte del capside genoma: DNA lineare ds di Kb il genoma è fiancheggiato da sequenze ITR (inverted terminal repeats) che servono come origine di replicazione dopo l infezione il DNA virale entra nel nucleo della cellula ospite e viene replicato e trascritto il DNA adenovirale non si integra nel genoma dell ospite (resta episomale), pertanto non si ha mutagenesi inserzionale, ma sono necessari trattamenti ripetuti.

44 Adenovirus

45 Raty, Curr Mol Pharmacol 1: (2008)

46 Adenovirus transduction of target cells Adenovirus receptor Raty, Curr Mol Pharmacol 1: (2008)

47 Vettori Adenovirali (II) ADENOVIRUS: ciclo vitale legame del virus ai recettori cellulari internalizzazione: endocitosi mediata da recettori rilascio dall endosoma disassemblaggio del capside ingresso del DNA nel nucleo il DNA adenovirale non si integra nel genoma dell ospite (resta episomale) infetta sia cellule in divisione che non facile produrli ad alto titolo dotato di ampio trofismo solitamente causano patologie respiratorie benigne sierotipi 2 e 5 utilizzati come vettori

48 ADENOVIRUS: ciclo vitale 1. legame del virus ai recettori cellulari (Ad receptor/fiber; integrin receptor/penton) 2. internalizzazione: endocitosi mediata da recettori rilascio dall endosoma 3. uncoating = disassemblaggio del capside ingresso del DNA nel nucleo 4. trascrizione 5. traduzione 2 ore totali

49 Vettori Adenovirali (III) Adenovirus incompetenti per la replicazione sono generati sostituendo i geni E1 o E3, essenziali per la replicazione Vettori ricombinanti replicati in cellule che esprimono i prodotti del gene E1 o E3 (ad elevate concentrazioni) Cellule infettate con l adenovirus ricombinante possono esprimere il gene terapeutico, ma il vettore, mancando di geni essenziali, non può replicarsi

50 Vettori Adenovirali (IV) VANTAGGI SVANTAGGI Elevata efficienza di trasduzione Infetta sia cellule in divisione che cellule differenziate (in vitro ed in vivo) Alto titolo virale ( ) Espressione transiente (5-10 giorni post-infezione) Proteine virali espresse nell ospite (tossicità) Risposta immunologica potente (cellulare e umorale) ne ostacola l impiego in vivo Inserti fino a 8 kbp

51 Vettori Adenovirali di prima generazione ( E1) Cellule di packaging I gene a valle di E1 vengono comunque espressi a basso livello nelle cellule trasdotte, causando: lisi immuno-mediata delle cellule trasdotte; espressione del transgene terapeutico di breve durata; tossicità dopo somministrazione sistemica (infiammazione e necrosi epatica, danno endoteliale) Vettori Adenovirali di seconda generazione (delezione del gene E2) Il virus non ha alcuna capacità di replicarsi, ma risulta ancora immunogeno

52 Vettori Adenovirali di terza generazione (restano solo le sequenze ITR e ) Necessità di un virus helper per la replicazione VANTAGGI: vettori ad alta capacità (transgene da 100 bp a 36 kbp) PROBLEMI: contaminazione del virus helper, instabilità del vettore, produzione tecnicamente complessa e poco riproducibile Vettori Adenovirali di quarta generazione (vettori ibridi, sierotipi alternativi)

53 Produzione di vettori GUTLESS 1. Vettore virale: contiene solo sequenze ITRs e + la cassetta di espressione del transgene posto sotto il controllo di un elemento enhancer e di un promotore. 2. Cellule di packaging (293): esprimono gene E1 (integrato stabilmente) 3. Virus Helper: E1-deleto, privo di sequenza. Fornisce elementi strutturali

54 Vettori Adenovirali: problemi e prospettive future IMMUNOGENICITÀ DEL VETTORE (vettori di prima generazione: alta) IMMUNITÀ PREESISTENTE sierotipi alternativi TROFISMO PROMISCUO modificazione del trofismo naturale re-direzionamento verso le cellule desiderate ( targeting ) Un esempio di targeting: sostituzione del promotore E1 di AdV con il promotore della trascrittasi inversa dei telomeri umani (htert), in modo da restringere la replicazione virale nelle cellule che esprimono la telomerasi (es. cellule tumorali).

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56 Different approaches in currently available gene therapy agents a). Gene delivery starts with administration of the viruses, which carry a therapeutic gene. In the target cells, viruses release the therapeutics genes, which are then processed by the host cells and translated into therapeutic protein, causing the desired treatment effect. b). In p53 therapy, therapeutic gene is a tumor suppressor gene p53 whose deactivation is known to promote cancer. Reintroduction of p53 protein to cancer cells suppresses cancer activity, prevents cell growth and proliferation and induces apoptosis. However the effect is limited only to the transduced cells. Apoptotic cell Cancer cell c). Conditionally replicating adenoviruses contain alterations in their genome, which direct virus replication only to p53- deactivated cells. After the initial transduction, replication continues into neighbouring p53-deficient cells, increasing the treatment effect. Raty, Curr Mol Pharmacol 1: (2008)

57 Treating malignant glioma with thymidine kinase gene therapy d). With thymidine kinase gene therapy, the ganciclovir prodrug is administered (ball) when the thymidine kinase expression levels peak. The enzyme converts ganciclovir to a guanine analogue (star), which will be incorporated in cellular DNA, thus preventing cell proliferation and promoting apoptosis in actively dividing cancer cells. When cells die, guanine analogues are released into neighbouring cells and spread the effect (bystander effect), increasing treatment efficacy. Raty, Curr Mol Pharmacol 1: (2008)

58 ADENOVIRUS ONCOLITICI ADENOVIRUS Onyx (dl1520) ITR * E1A/B VA E2A/B L1 L2 L3 L4 E3 L5 Russell WC. Update on adenovirus and its vectors. J Gen Virol. 2000, 81: ONYX 015 chimera tra il sierogruppo 2 e 5 usato in clinical trials in un sistema di targeting. Manca del locus E1b. E4 ITR genoma Ad *non esprime E1B 55K delezione di 827-bp nel gene E1B e parte della regione E3 (gp19k) Onyx (dl1520) replica solo in cellule difettive per p53 p53 è inattiva nel 50% dei tumori umani e nel 70% dei tumori della testa e del collo Trials clinici in fase III per carcinomi squamosi della testa e del collo (somministrazione del mutante virale nella massa tumorale)

59 Vettori Adeno-associati (AAV)(I) proteine per la replicazione e l integrazione proteine del capside Adeno-associated viruses (AAV) Virus satelliti di altri virus umani Richiedono la co-infezione con Adenovirus o Herpes Simplex Virus (HSV) per replicarsi. Sono Parvovirus. Virione icosaedrico di nm diametro. Genoma: DNAss (4-5 kbp), senza preferenza per la strand da incorporare nel virione. La molecola di DNA contiene una sequenza palindroma a ciascuna estremità, definita sequenza terminale invertita (ITR). Le ITRs detrminano l integrazione sito-specifica in un sito specifico del cromosoma 19 (19q13,3q-ter) ciò li rende candidati attraenti come vettori per la terapia genica. Nei vettori adeno-associati il gene di interesse prende il posto dei geni REP e CAP.

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61 Vettori Adeno-associati (AAV)(II) Le ITRs contengono tutte le informazioni necessarie per l integrazione e per il packaging Cellule di packaging: linea cellulare 293 transfettata con un plasmide contenente i geni cap e rep e successivamente infettata con un adenovirus helper difettivo per E1 e privo della sequenza. Recentemente è stato sviluppato un nuovo sistema di produzione: il virus helper è sostituito con un plasmide mini-ad (contiene parte del genoma di adenovirus)

62 Vettori Adeno-associati (AAV)(III) VANTAGGI SVANTAGGI Non patogeni Dimensioni ridotte del transgene (max 5 kb) Non innescano una risposta immunitaria Il vettore ricombinante non ha integrazione sito-specifica (?) Capacità di infettare cellule in divisione e non Il vettore a volte resta episomale Stabilità Screening richiesti per escludere contaminazioni adenovirali o da HSV Integrazione sito-specifica del transgene (?)

63 Vettori basati su Herpes Simplex Virus (HSV) (I) Virus herpes Simplex (HSV) HSV-1 virione: 20 nm di diametro. 4 componenti: envelope, tegumento, capside e genoma virale. Envelope derivato dalla membrana cellulare, contiene approssimativamente 12 glicoproteine virali, essenziali per l ingresso del virus. Tegumento (fra capside ed envelope): contiene almeno 10 proteine virali coinvolte nel shut-off della sintesi proteica dell ospite, nell attivazione dei geni virali immediate early e nell assemblaggio (es. VP16, VP22). Capside icosaedrico: consiste di 7 proteine virali e contiene il genoma lineare a dsdna, che è lungo 152 Kb ed è diviso nelle regioni unique long (UL) e unique short (US), fiancheggiate da ripetizioni terminali (TR). VANTAGGI Alto titolo Neurotropico SVANTAGGI Costruzione complessa No linee cellulari di packaging

64 Vettori basati su Herpes Simplex Virus (HSV) (II) Tropismo specifico per il sistema nervoso centrale (SNC) Possono instaurare nei neuroni infezioni latenti che durano anche tutta la vita. Non sono in grado di integrarsi e quindi non è possibile avere un'espressione a lungo termine dei geni inseriti. Possono ospitare inserti piuttosto grandi anche di 20kb. Ruolo principale nella terapia genica: veicolare i geni ai neuroni per la terapia di patologie neurologiche quali il morbo di Parkinson, di Alzheimer e di Huntington.

65 Vettori Retrovirali (I) Basics of the retrovirus virion and infection. Diametro dei virioni: da 80 a 130 nm. Capside proteico incapsulato nei lipidi; contiene il genoma virale insieme alle proteine integrasi e transcriptasi inversa (RT). Genoma: 2 molecole identiche positive (sense) di RNA single-strand che vanno da 3.5 a 10 kb. Dopo l entrata nella cellula, RT sintetizza il DNA virale dallo stampo di RNA. Il macchinario cellulare sintetizza il DNA complementare, che viene poi circolarizzato e inserito nel genoma della cellula ospite. Il genoma virale è trascritto e la replicazione virale è completata. La maggior parte dei retrovirus è oncogenica. Vettori Retrovirali derivati da: Retrovirus dei mammiferi e degli uccelli (Moloney Leukemia virus-mlv) spumavirus lentivirus (derivati da HIV-1) sono basati su MLV i trials: TK, X-SCID, ADA)

66 Vettori Retrovirali (II) RETROVIRUS: struttura generale RETROVIRUS: genoma

67 Vettori Retrovirali (III) RETROVIRUS: ciclo vitale 1. Adsorption 2. Penetration 3. Uncoating 4. Reverse Transcription 5. Nuclear Import 6. Proviral Integration 7. Transcription 8. Translation 9. Capsid assembly 10. Budding 11. Release new virion

68 Vettori Retrovirali (III) RETROVIRUS: ciclo vitale 1 1. Adsorption 2. Penetration Uncoating 4. Reverse Transcription 5. Nuclear Import Proviral Integration 7. Transcription 8. Translation 5 9. Capsid assembly Budding Release new virion 9 10

69 Vettori Retrovirali (IV) Costruzione di un vettore retrovirale: Geni virali (gag, pol, env) sostituiti con iltransgene di interesse Geni virali espressi, da plasmidi, in una linea cellulare di packaging Poichè i geni virali mancano del segnale di packaging, non sono inclusi nel virione Per prevenire la ricombinazione (con formazione di retrovirus competenti per la replicazione), tutte le regioni di omologia con lo scheletro del vettore sono rimosse

70 Generation of a Packaged Replication-deficient Retrovirus Expression Vector

71 Vettori Retrovirali (V) VANTAGGI SVANTAGGI Elevata efficienza di trasduzione Infetta solo cellule in divisione Inserti fino a 8 kb Basso titolo virale ( ) Integrazione nel genoma dell ospite Integrazione random Elevata espressione del vettore Inefficiente delivery in vivo Proteine del vettore non espresse nell ospite Sistema molto caratterizzato

72 Vettori Lentivirali (HIV-derived) (I) Struttura del Virione HIV-1 e del DNA Provirale LTR SD GAG PRO POL VIF R U TAT REV ENV RRE NEF LTR NEF HIV provirus

73 Vettori Lentivirali (HIV-derived) (II) CMV GAG 1. Core Packaging RRE PRO POL polya 2. Envelope CMV envelope polya SDSA 5 LTR U3 R U5 3. Transfer Vector RRE transgene SD SA 3 LTR U3 R U5 SD Transient transfection 293T cells Supernatant harvest hours Pseudotyped Virion Target cell 1. Packaging construct: structural and enzymatic proteins 2. Envelope construct: non correlate envelope 3. Transfer construct: transgene + cis-acting sequence (NO other viral gene) To target cell

74 Vettori Lentivirali (HIV-derived) (II cont) Packaging cell line Trasfezione transiente Cellule 293T Raccolta a 24 e 48 ore Target cell line Cellule HeLa Titolazione per diluizioni seriali Concentrazione per ultracentrifugazione

75 LENTIVIRUS Genoma complesso: geni strutturali gag pol env geni regolatori tat rev geni accessori nef vpr vpu vif Tropismo per linfociti e macrofagi Infezione persistente / malattia cronica progressiva Particelle virali ibride difettive per la replicazione (vettori lentivirali) costituite da: Un set minimo di proteine del core derivate da HIV-1 Il pericapside di un virus non correlato (VSV or MLV) Un genoma contenente: una cassetta di espressione per il transgene sequenze cis-regolatorie di HIV-1 non sono presenti geni virali

76 LENTIVIRUS: costruzione Costrutto di trasferimento RSV GA RRE GAcPPT RRE PROMOTORE GFP TRANSGENE SD SA sequenze attive in cis Provirus HIV-1 LTR SD GAG PRO POL VIF R U TAT REV ENV RRE NEF LTR sequenze attive in trans Costrutto d incapsidazione CMV GAG PRO POL RRE TAT polya SD REV

77 Vettore lentivirale di ultima generazione CMV GAG PRO POL RRE polya RSV REV polya SD SA Costrutti d incapsidazione CMV CMV SD SA VSV-G polya Costrutto codificante il pericapside RSV GA RRE GA cppt RRE hpgk PROMOTER GFP egfp Wpre Costrutto di trasferimento SIN (Self-inactivating) SD SA 3 -LTR NO no virus assembly

78 BIOSAFETY of Lentiviral vectors Replication-defective by design No viral genes transferred to target cells Pseudotyped by the Env of unrelated virus - wild-type virus cannot be generated - recombinant among constructs unlikely because of lack of homology Safety Concerns - generation of RCL - mobilization and recombination of vector with wt HIV in infected hosts - insertional mutagenesis - germline transmission

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80 Principali malattie oggetto distudio per la terapia genica: Malattie Deficit Incidenza Cellule bersaglio GENETICHE SCID Adenosina deaminasi Rara Midollo osseo IL-2R gamma Linfociti T Emofilia A e B Fattori VIII o IX 1:10,000 maschi Fegato, muscolo Ipercolesterolemia familiare Recettore per LDL 1:1,000,000 Fegato Fibrosi cistica (MONOGENICA) Gene CFTR 1:3,000 caucasici Vie respiratorie Emoglobinopatie (tal., SCA) Difetti in - o -globina Fino a 1:600 Midollo osseo Enfisema ereditario 1-antitripsina 1:3,500 Polmoni, fegato ACQUISITE Cancro Vari > 1 milione/anno Vari tipi Malattie neurologiche Parkinson, Alzheimer,SLA 1 milione/anno Neuroni, glia Malattie infettive AIDS, epatite C 1 milione/anno CellT, MF,feg. Malattie dell occhio Retinopatia diabetica Degenerazione maculare 1 milione/anno Epitelio retinico

81 Malattia ereditaria caratterizzata dalla mutazione del gene codificante un canale del cloro, denominato CTFR (Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator) espresso un cellule dell epitelio di diversi organi MODELLO ANIMALE : Topo knock-out per CTFR RISULTATI SPERIMENTALI FIBROSI CISTICA IN VITRO correzione del difetto del trasporto degli ioni Cl- tramite trasferimento genico di CTFR in cellule epiteliali delle vie respiratorie (vettore adenovirale) IN VIVO nel topo knock-out: correzione dell alterazione tramite instillazione di una miscela DNA/LIPOSOMA PROTOCOLLI CLINICI AVVIATI: Somministrazione in vivo del gene utilizzando un vettore adenovirale (USA) o complesso DNA/liposoma (UK)

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83 FIBROSI CISTICA: AFFEZIONI POLMONARI La proteina CFTR è un trasportatore ionico, ma è anche un recettore batterico

84 Le mutazioni del gene CFTR possono essere suddivise in 5 classi principali in funzione del danno causato alla proteina: 1. Mancata produzione della proteina. 2. Difetto di maturazione ("processing") della proteina. 3. Anomala regolazione del canale. 4. Difetto di conduzione (anomalo passaggio del cloro). 5. Anomalie di sintesi del normale messaggero del CFTR (splicing).

85 Data la struttura delle cellule epiteliali il virus ha difficoltà ad entrare nelle cellule. Il glicocalice (insieme denso di carboidrati, glicoproteine e polisaccaridi simil-muco) che risiede sulla superficie luminale dell epitelio delle vie aeree, ha funzione di barriera alla penetrazione di vettori virali e non. Per migliorare l uptake del virus si è cercato di permeabilizzare tali cellule con uno shock ipoosmotico Con AdV si ha un alta efficienza di transfezione ma l espressione transiente e l immunogenicità sono un limite per ulteriori somministrazioni. Infatti, a causa della malattia, c è già un infiammazione cronica delle vie aeree che verrebbe aumentata dall immunogenicità del virus, incrementando la tossicità e la necrosi del tessuto. Inoltre la formazione di anticorpi neutralizzanti causerebbe l inefficacia del trattamento. Altre strategie utilizzo di liposomi sintetici cationici in grado di inglobare vettori di DNA I liposomi non sono immunogenici ma le sequenze CpG associate a DNA non umano inducono una significativa risposta immune e di conseguenza l efficienza di espressione del transgene è molto bassa

86 GDEPT (Gene Directed Enzyme Prodrug Therapy) The bystander effect somministrazione di un vettore esprimente un enzima (in determinate cellule target) somministrazione di un pro-farmaco trasformazione del profarmaco in un composto tossico uccisione della cellula direttamente coinvolta rilascio del composto tossico uccisione cellule circostanti

87 GDEPT (Gene Directed Enzyme Prodrug Therapy)

88 Models of Gene Directed Enzyme Prodrug Therapy Nitroreductase -CB1954 system A vector expressing NTR enters a cellular target. NTR converts the compound CB1954 to a potent DNA cross-linking agent HSV-TK system A vector expressing tk enters a cellular target. Tk phosphorylates the drug gancyclovir (GCV), converted to a triphosphate by cell enzymes. The triphosphate causes single strand break Cytosine deaminase (CD)/5 fluorocytosine system A vector expressing cytosine deaminase enters a cellular target. CD activates 5-FC to 5-FU, converted to a triphosphate by cell enzymes. Each of these compounds are cytotoxic.

89 Treating malignant glioma with thymidine kinase gene therapy d). With thymidine kinase gene therapy, the ganciclovir prodrug is administered (ball) when the thymidine kinase expression levels peak. The enzyme converts ganciclovir to a guanine analogue (star), which will be incorporated in cellular DNA, thus preventing cell proliferation and promoting apoptosis in actively dividing cancer cells. When cells die, guanine analogues are released into neighbouring cells and spread the effect (bystander effect), increasing treatment efficacy. Raty, Curr Mol Pharmacol 1: (2008)

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