Metodi per la rilevazione e quantificazione della resistenza in patogeni fungini

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1 Metodi per la rilevazione e quantificazione della resistenza in patogeni fungini R.M. De Miccolis Angelini, S. Pollastro, S. Toffolatti, A. Vercesi DIPARTIMENTO DI BIOLOGIA E CHIMICA AGRO- FORESTALE ED AMBIENTALE -DiBCA DIPARTIMENTO DI SCIENZE AGRARIE E AMBIENTALI PRODUZIONE, TERRITORIO, AGROENERGIA

2 Perché? Verificare casi di sospetta resistenza Segnalare la comparsa di forme resistenti Seguire l evoluzione della resistenza Verificare l efficacia delle strategie antiresistenza Modulare la scelta dei fungicidi a livello locale Migliorare le conoscenze

3 Obiettivo

4 Sensibilità di base CE 50 MIC (CE 100 ) 100 % Inibizione 50 0

5 Curve dose-risposta Inibizione (%) S LR HR , Risposta di ceppi di Botryotinia fuckeliana a fenhexamid 0, Log concentrazione fungicida Distribuzione di ceppi di P. viticola in funzione dell EC 50 a fenamidone FR = EC EC Resistente Sensibile EC50

6 Campionamento

7 Campionamento Un numero eccessivo di campioni può essere inutile ai fini del monitoraggio

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9 PCR in tempo reale Quantificazione di DNA mutato

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12 Conteggio delle colonie Germinazione conidica Crescita micelica

13 Saggi di germinazione sulle oospore 1 2 Isolamento delle oospore Risospensione in acqua dopo filtrazione Incubazione di 1200 oospore a 20 C su: 1. Substrato di controllo (agar-acqua 1%) 2. Agar-acqua addizionato con fungicida Concentrazione discriminante Concentrazione crescente 3 4 Calcolo delle percentuali di germinazione Conteggio delle oospore germinate nr. oospore germinate G = 100 nr. totale di oospore Trascorsi giorni Calcolo della percentuale di oospore dall inoculazione resistenti (RO) Gfungicida RO = 100 Gagar acqua

14 Piastre per microtitolazione

15 Composizione del substrato Es: Resistenza alle anilinopirimidine, SDHI Saggi in vitro per la resistenza a QoI Colony growth inhibition (%) MEA MEA+SHAM 0,01 0, Trifloxystrobin concentration (μg ml -1 ) Substrato addizionato di inibitori specifici di respirazioni alternative (es. SHAM, n-propyl gallate)

16 Resistenza associata ad una alterazione genica Presenza/assenza di mutazioni (SNPs) Percentuale di allele mutato Interpretazione del risultato (ploidia,eterocariosi,eteroplasmia)

17 Molecolari Eterocariosi e eteroplasmia Resistente DNA mutato DNA wild-type Sensibile Fungicida

18 Tecnica Patogeno Riferimento bibliografico Single-stranded conformational polymorphism PCR (PCR-SSCP) Plant Pathogenic Bacteria; Fusarium sp.; Pyrenophora tritici; Botrytis cinerea Srinivasa et al., 2012; Nahiyan et al., 2011; Patel et al., 2011; Veloukas et al., 2011 Allele-Specific PCR Cercospora beticola Malandrakis et al., 2011 High-resolution melting detection TaqMan real-time PCR Botrytis cinerea Billard et al., 2010 Botrytis cinerea; Plasmopara viticola Billard et al., 2012; Samuel et al., 2011; Valsesia et al., 2005 Luminex Molecular Diagnostics Clinically Relevant Fungi Babady et al., 2011 Nested PCR-RFLP Botrytis cinerea Saito et al., 2007 primer-introduced restriction analysis PCR (PIRA-PCR) Fusarium graminearum Luo et al., 2009 rolling circle amplification amplification (RCA-PCR) Penicillium marneffei Jiufeng et al., 2010 PCR-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) Reverse Transcription PCR Assay Allele-specific probe and primer amplification assay (ASPPAA PCR) Botrytis cinerea; Magnaporthe oryzae; Colletotrichum gloeosporioides Mycosphaerella graminicola Kim et al., 2009; Wei et al., 2009; Chung et al., 2009 Guo et al., 2005 Botrytis cinerea Billard et al., 2012

19 Impiego di enzimi di restrizione Analisi del profilo elettroforetico Discriminazione tra genotipi sensibili (S) o resistenti (R) AluI SR S R 1000 pb 500 pb

20 Primer Allele-Specifici (AS) G 3387 G G Genotipo Sensibile (S) C 3387 G C Genotipo Resistente (R) S R S S S R R S R S R R Rilevazione della mutazione G143A nel gene cytb

21 1 2 SOSPENSIONE DI OOSPORE/CONIDI IN ACQUA 3 ESTRAZIONE E QUANTIFICAZIONE DEL DNA TOTALE Sonde Taqman REAL TIME PCR ALLELE SPECIFICA E QUANTIFICAZIONE DELLA % DI ALLELE MUTATO NELLA POPOLAZIONE (MA)

22 Costruzione curve standard per quantificazione di DNA DNA totale DNA mutato Rilevazione della mutazione G143A nel gene cytb

23 Molecolari Real-time PCR SYBR green

24 Punti critici Metodi standard

25 Punti critici Esempio Botrytis cinerea - Muffa grigia Tipo di saggio Da usare per AP SBI SDHI QoI Altri Proposto da Pianta intera X X Lachase Microtitolazione X Mehl Microtitolazione X X Sierotzki Microtitolazione X X Stammler Crescita radiale delle colonie X Takagaki

26 Comparazione tra metodi esempio: Botrytis cinerea Fenotipo Microtitolazione Substrato liquido Germinazione conidica Substrato agarizzato Crescita micelica CE 50 CE 95 CE 50 CMI CE 50 CMI Bos S 0,2 > 10 < 0,01 0,1 0,29 10 Bos LR > 10 > > 100 > 100 > 100 Bos HR > 10 > 10 > 100 > 100 > 100 > 100 Bos MR 0,94 > ,25 > 100

27 BAE BAA BAD BAS BAG BAF BAZ BAB BAP BAN BAO BAU BAH BAT BAR BAM BBC BAI BBD esempio: oospore e QoI % Oospore resistenti % Allele mutato

28 Conclusioni La tecnica ideale In grado di fornire risultati: - realistici - quantitativi - riproducibili - di facile ed univoca interpretazione Di facile applicabilità (dotazione strumentale, competenze dell operatore, ecc.) Economica, ad elevata processività in tempi brevi