Struttura, funzione e specificità tessutale dei geni delle mucine

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1 Struttura, funzione e specificità tessutale dei geni delle mucine c. BOTIP, E. SEREGNP, S. MASSARON', A.MARTINETIP, A. BONANATE', D. CANTARELLAI, A. CAPOBIANC02, E. BOMBARDIERI' 'Divisione di Medicina Nucleare, Istituto Nazionale per lo Studio e la Cura dei Tumori, MILANO 2 Laboratorio Analisi Cliniche, Ospedale S. Carlo, POTENZA INTRODUZIONE Le differenti molecole della famiglia delle mucine possiedono precise caratteristiche biochimiche in comune (1). Innanzitutto, le mucine sono costituite da un core proteico (apomucina) che presenta un peso molecolare variable da 40kD a 600kD. Tale scheletro proteico contiene un elevato numero di residui di treonina e serina cui sono legate preferenzialmente le catene glucidiche mediante legame 1-3 O-glicosidico (2). I carboidrati costituiscono più de1l'80% della molecola e la lunghezza delle catene glucidiche laterali varia da uno a più di 20 residui; i principali glucidi sono l'n-acetilgalattosammina, l'n-acetilglucosammina, il galattosio, il fucosio ed infine l'acido sialico (3, 4). Differenti geni apomucinici sono stati recentementi identificati ed è stato possibile evidenziare la loro struttura comune costituita da una porzione centrale affiancata da sequenze 5'-3' (5). Il dominio centrale dello scheletro proteico costituisce più dell'80% dell'intera sequenza aminoacidica codificata, ed è composta da sequenze ripetute ("tandem repeats") variabili per numero e composizione caratterizzate da un elevato numero di residui di serina, treonina e prolina. L'omologia di sequenza del dominio centrale fra i differenti membri della famiglia delle mucine è limitata e ciò significa che la sequenza e le dimensioni del dominio interno sono uniche per ogni tipo di mucina. Omologie di sequenza parziali sono invece presenti fra le differenti mucine nei domini delle regioni N e C- terminali. Molecole mucino-simili sembrano essere largamente diffuse in natura, ma la nostra conoscenza a riguardo è decisamente limitata a causa delle scarse informazioni presenti in letteratura per le specie non appartenenti alla classe dei mammiferi. Ad esempio, geni codificanti per molecole affini alle mucine negli eucarioti inferiori sono stati descritti in Leishmania major e Trypanosoma cruzi (6-8); in particolare in quest'ultimo organismo, che rappresenta l'agente eziologico della malattia di Chagas, è stato osservato che glicoproteine simili alle mucine svolgono un ruolo importante nell'interazione con la superficie delle cellule di mammifero durante il processo di invasione. Molto recentemente una glicoproteina mucino-simile con un peso molecolare apparente di 90kD, denominata mucina D, è stata descritta e parzialmente caratterizzata in cellule embrionali di Drosophila melanogaster (9). In questa s~e cie la mucina D sembra essere coinvolta nel processo di muta poichè la sua sintesi è regolata dall'ormone della muta degli insetti. Nei mammiferi le mucine sono largamente rappresentate, essendo riscontrabili nella maggior parte delle cellule epiteliali secretorie polarizzate (1, 2). Molecole simili alle mucine sono state anche osservate sulla superficie di cellule non-epiteliali, in particolare di origine ematica (10-14). Studi immunoistochimici e biochimici hanno consentito di ottenere interessanti informazioni riguardo alla struttura della componente carboidratica delle mucine epiteliali, ma fino a poco tempo fa molto poco si sapeva sulla struttura e composizione delle apomucine. Infatti l'approccio biochimico si è dimostrato inadeguato in quanto la maggior parte delle procedure di studio si basavano sulla deglicosilazione delle mucine che causava una degradazione massiva dello scheletro apomucinico (4, 15-18). Successivamente, l'avvento delle tecniche di biologia molecolare ha consentito finalmente di fare luce sulla componente apomucinica e i geni che la codificano. Questi studi hanno rivelato l'esistenza di differenti geni mucinici che codificano per almeno 8 apomucine (denominate rispettivamente MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5, MUC5AC, MUC5B, MUC6 e MUC7). Grazie ai risultati ottenuti da studi genetici, immunologici e biochimici, è oggi possibile classificare le mucine in due gruppi principali : mucine associate alle membrane cellulari e mucine secretorie. A loro volta le mucine secretorie possono essere suddivise in due altri sottogruppi in base alla loro funzione fisiologica, cioè che vadano o meno a costituire il gel viscoso ch e ricopre la superficie dei tratti respiratorio, gastrointestinale e genitourinario. Questo gel mucinoso svolge importanti funzioni che includono il mantenimento della viscosità e la protezione contro insulti meccanici, chimici, fisici, biologici e contro l'azione di enzimi proteolitici e di variazione di ph (19-21). Di seguito verranno analizzate e discusse le principali caratteristiche delle differenti mucine, con particolare enfasi nei riguardi delle loro rispettive strutture, funzioni ed epressione dei geni che le codoficano. MUC1 MUC1 è tra le mucine associate alla membrana la più conosciuta, ed è chiamata anche "polymorphic epithelial mucin" (PEM) o "episialina". Il gene, che è stato il primo gene mucinico ad essere clonato e sequenziato nell'uomo e nei topi, è localizzato sul cromosoma 1 q21-24 e codifica per una glicoproteina ad elevato PM ( kd) di tran- LlGAN D ASSAY VOL. 1 NUMERO 4 ANNO 1996

2 smembrana altamente glicosilata (22-26). La mucina MUC1 risulta espressa in molti tessuti epiteliali normali (mammella, pancreas, polmone) ed in modo aberrante nei carcinomi di questi distretti (23-25, 27, 28). Il dominio centrale è caratteristico dei geni mucinici ed è costitutito da un numero variabile di tandem repeats (VNTR). L'analisi genica di MUC1 utilizzando un cdna ha rivelato la presenza di 7 esoni. Nel gene possono essere identificate 4 regioni: una regione N-terminale contenente una sequenza segnale idrofobica; un dominio centrale costitutito dalle tandem repeats; una regione C-terminale che codifica sequenze transmembrana e una porzione citoplasmatica di 69 aminoacidi. Il dominio centrale VNTR è localizzato nel secondo esone e consiste di 60 paia di basi ripetute che codificano per tandem repeats costituite da 20 aminoacidi (tabella 2). In ogni tandem repeat esistono 5 potenziali siti di O-glicosilazione, rappresentati dagli aminoacidi serina e treonina. MUC1 presenta un elevato grado di eterogeneità individuale sia a livello genico che di apomucina nel numero di tandem repeats, pertanto questo gene è altamente polimorfico nella popolazione (29-31). Questo polimorfismo suggerisce che la lunghezza del dominio VNTR è essenziale solo per il legame degli O-glicani ma non per la funzione della mucina stessa. In Fig. 1 è riportata la struttura del gene MUC1 e di altri due geni mucinici MUC2 e MUC5AC. Nella tabella 1 sono invece riportate le principali caratteristiche delle mucine epiteliali fino ad ora identificate. Riguardo alla biosintesi, è stato osservato che la molecola è inizialmente sintetizzata come un precursore ad alto peso molecolare nel reticolo endoplasmico; poi il precursore subisce un taglio proteolitico a carico della regione C-terminale della molecola con la conseguente formazione di due prodotti che rimangono associati, sebbene non siano legati da legami covalenti. Il primo prodotto, derivato dalla regione N-terminale, comprende la maggior parte del dominio extracellulare, mentre il secondo, più piccolo, è composto da soli 65 aminoacidi del dominio extracellulare (2, 32-35). E' probabile che tagli enzimatici addizionali siano necessari per il rilascio di MUC1 dalla superficie cellulare e che avvengano sulla superficie cellulare stessa o durante il processo di riciclaggio di proteine di membrana. E' stato dimostrato che le regioni transmembrana e citoplasmatica dell'apomucina MUC1 sono altamente conservate nella specie umana e in altre specie di mammifero, e ciò suggerisce un ruolo funzionale importante di queste regioni. In particolare è stato osservato che il dominio intracellulare C-terminale interagisce con i filamenti di actina del citoscheletro. Inoltre il dominio citoplasmatico di MUC1 è fortemente fosfori lato in serina e tale fosforilazione può essere aumentata mediante trattamento con vari fattori; questa evidenza suggerisce che la molecola può essere coinvolta nel trasferimento di segnali dall'ambiente esterno al citoplasma; questi segnali potrebbero essere di non-adesione e portare quindi alla perdita dei contatti cellula-cellula (36). Tuttavia su questo punto esistono delle controversie. Alcuni Autori ritengono infatti che MUC1 abbia funzioni antiadesive mediate tramite l'ingombro sterico e una carica globale negativa per la presenza dei residui di acidi sialici (36, 37). Tuttavia l'evidenza che il dominio extracellulare protru- de nm sopra la membrana plasmatica estendendosi maggiormente verso lo spazio pericellulare rispetto ad altre componenti, induce a pensare che la molecola possieda proprietà adesive favorendo l'adesione con quelle cellule che possiedono appropriati controrecettori. Questa ipotesi sembra essere confermata da un lavoro molto recente di Regimbald (38), in cui è stato dimostrato che MUC1 nelle cellule di carcinoma mammario rappresenterebbe il ligando per la molecola di adesione intercellulare endoteliale ICAM-1; quindi la mucina di membrana MUC1 medierebbe l'adesione delle cellule tumorali alle cellule endoteliali attraverso ICAM-1 e tale interazione può essere il momento critico nel processo di diffusione metastatica sistemica nel carcinoma mammario. Una esaltata espressione della mucina MUC1 d'altro canto può permettere alle cellule tumorali di eludere il sistema immunitario sia creando un possibile stato immunosoppressivo mediante induzione di un'anergia delle cellule-t, sia bloccando stericamente l'accesso delle cellule immunitarie effettrici verso altre componenti della membrana plasmatica delle cellule neoplastiche (39-41). Questa ipotesi spiegherebbe la prognosi sfavorevole associata ad una overespressione di MUC1 osservata in certi tumori umani. Vari studi sono attualmente in corso con l'obiettivo di identificare i meccanismi ed i fattori coinvolti nella regolazione dell' espressione genica di MUC1. Nella regione non codificante 5'(promotore) di questo gene sono state identificate numerose sequenze regolatorie. Inoltre nel gene sono stati descritti differenti siti di legame potenziale per fattori di trascrizione (es. SP1) e possibili sequenze consenso per il legame dei complessi recettoriali estrogenici e progestinici (42-44). Queste evidenze suggeriscono che l'espressione del gene MUC1 possa essere regolata dagli ormoni sessuali. Tale ipotesi ha trovato conferma in studi condotti sull'endometrio umano e di topo. Nell'endometrio umano i livelli di mrna specifico sono risultati bassi nella fase proliferativa e aumentano significativamente durante la fase secretoria, con una massima concentrazione nella fase d'impianto (45). Questo depone per una stimolazione della espressione del gene MUC1 da parte del progesterone esercitata in maniera diretta od indiretta. Nell'endometrio del topo la situazione è esattamente opposta, dove i più elevati livelli di MUC1 mrna si riscontrano nella fase estrogenica e pre-estrogenica, cioè quando i livelli ematici di estrogeni sono al loro massimo. I livelli più bassi di mrna si osservano invece nella fase d'impianto e durante questa fase l'espressione di MUC1 sembra modulata in senso negativo dal progesterone (46). Quindi è probabile che nel topo MUC1 agisca da barriera contro l'impianto dell'ovulo e che una diminuzione di espressione sia necessaria per generare una mucosa uterina recettiva. Anche il nostro gruppo, utilizzando come modello di studio cellule di carcinoma mammario ormone-dipendenti MCF7, si è dedicato allo studio in vitro della regolazione della espressione genica di MUC1 da parte di ormoni steroidei (estradiolo e progesterone) e di siero fetale privato della componente steroidea (47). I risultati nelle nostre mani indicano che i livelli di MUC1 mrna, determinati con la tecnica di northern-blot, sono maggiormente elevati in cellule coltivate in un medium contenente una concentra- LlGAND AS SAY VOL. 1 NUMERO 4 ANNO 1996

3 Tabella i Principali caratteristiche delle mucine e dei loro prodotti Gene Localizzazione cromosomica Lunghezza tandem repeats (n. aa) Mucina codificata MUCI Iq21 20 Secretoria; di membrana MUC2 llpl5 233 Secretoria; costitutiva del gel MUC3 7q22 17 Secretoria; costitutiva del gel MUC4 3q29 16 Secretoria MUC5AC llpls 8 Secretoria; costitutiva del gel MUC5B IlplS variabile Secretoria; costituti va del gel MUC6 llpls 169 Secretoria; non costitutiva del gel MUC Secretoria; non costitutiva del gel Tabella 2 Sequenze aminoacidiche delle unità tandem repeats Gene MUCI MUC2 MUC3 MUC4 MUCSC MUC5B MUC6 MUC7 Sequenza GSTAPPAHGVTSAPDTRPAP PTTTPITTTTTDTPPPTPTGTQT HSTPSFTSSITTTETTS TSSASTGHATPLPVTD TTSTTSAP VARIABILE SPFSSTGPNTA TSFQTTTTYPTPSHPQTTLPTHVPPFSTSL VTPSTGTVITPTHA WM A TSAS IHSTPT GTIPPPTTLKA TGSTHTAPPMTPTTSGTSQAHSSFST AKTSTSLHSHTSSTHHPEVTPTSTTTITPNP TSTGTSTPVHATTSATSSRLPTPFTTHSPPTGS TTAAPPTPSATTPAPPSSSAPPG zione 10% di siero fetale privo di steroidi, rispetto ai livelli di mrna riscontrabili in cellule coltivate in medium contenente solo il 2% di siero. Non è chiaro quale sostanza presente nel siero eserciti un effetto stimolatorio su MUC1, ma è altamente probabile che sia coinvolto l'lnsulin-like growth factor-1 (IG F-1), dal momento che recettori per l'igf sono stati identificati nelle cellule MCF7 e che questo fattore di crescita risulta estremamente importante per la proliferazione delle cellule di carcinoma mammario e per il loro comportamento biologico. Per quanto riguarda l'estradiolo ed il progesterone, noi non abbiamo osservato alcuna variazione dei livelli di mrna specifico in cellule trattate a differenti concentrazioni di tali steroidi. Tuttavia la mancanza di una "up-regulation" osservabile può essere correlata al fatto che i tempi utilizzati nel nostro studio siano stati troppo lunghi (dal momento che una possibile stimolazione della espressione genica può verificarsi per tempi limitati solo nelle prime fasi del trattamento), oppure la concentrazione di siero usata (2%) che non è ottimale e non ha consentito una apprezzabile regolazione genica. tandem repeat è composto da 23 aminoacici con 14 siti potenziali di glicosilazione (tabella 2). Oltre al dominio centrale che codifica per i tandem repeats, è presente anche un altro dominio di 347 aminoacidi che codifica tandem repeats ad elevato contenuto di serina, treonina e ( MUC1 ) ( MUC2 ) ( MUC5AC ) MUC2 Il gene MUC2 codifica per una tipica mucina costitutiva del gel viscoso. Il cdna di MUC2 è stato isolato da una libreria genomica ottenuta da tessuto intestinale umano (48, 49). Analizzando la organizzazione del gene MUC2, si riscontrano sia omologie sia differenze rispetto al gene MUC1. Analogamente a MUC1, MUC2 presenta un dominio centrale VNTR ricco in serina, treonina e prolina. Ogni FiGURA i Organizzazione schematica dei geni mucinici MUCi, MUC2 e MUC5AC. VNTR: numero variabile di tandem repeats; TMD: dominio tram-membrana; CTD: dominio citoplasmatico; TSRD: dominio ad alto contenuto di treonina/cisteina; CRD: dominio ad alto contenuto di cisteina. ligand ASSAY VOL. 1 NUMERO 4 ANNO 1996

4 prolina. La caratteristica più importante del gene MUC2 comunque è rappresentata dalla presenza di quattro domini ad elevato contenuto di cisteina. Questi domini (3 nella regione N-terminale e 1 nella regione C-terminale) sono costitutiti da elementi ripetitivi che presentano un elevato grado di omologia col dominio codificante il fattore di pre-pro von Willebrand (vwf) (dominio D). I domini D sono coinvolti nella oligomerizzazione del vwf e del suo immagazzinamento negli organelli di accumulo (corpi di Weibel-Palade). E' molto probabile che i domini D nel gene MUC2 svolgano un ruolo analogo dei domini D del pre-pro vwf: in particolare i residui nella regione D sono coinvolti nella formazione di ponti disolfuro intra- ed extra molecolari. Di particolare rilievo è il fatto che il gene MUC2 è localizzato in un locus sul cromosoma 11p15, vicino ai geni che codificano le mucine MUC5AC, MUC5B e MUC6. Tutti questi geni risultano espressi nelle cellule in cui immunoistochimicamente è riscontrabile del muco. Pertanto qj.leste evidenze suggeriscono che questi geni mucinici sul cromosoma 11 p15 farebbero parte di una famiglia poligenica i cui membri codificano per mucine secretorie costitutive il gel di rivestimento. MUC2 è la mucina predominante nel tessuto intestinale dove viene prodotta dalle cellule caliciformi mucipare. Alcuni dettagli sono stati ottenuti riguardo alla sintesi della glicoproteina (50-52). Innanzitutto, MUC2 è sintetizzata dapprima a livello del reticolo endoplasmico ruvido (RER) come precursore proteico con un peso molecolare apparente di 600 kd e con un elevato contenuto di mannosio; molto probabilmente anche il processo di oligomerizazione avviene nel RER. Successivamente MUC2 è poi trasportata nell'apparato di Golgi dove avvengono le O-glicosilazioni e l'aggiunta di residui di acido sialico, di fucosio e solfati. La molecola neosintetizzata viene quindi immagazzinata in vescicole che poi matureranno in granuli definitivi di accumulo durante il trasporto verso la porzione apicale della cellula. Il contenuto dei granuli verrà alla fine riversato nel lume intestinale per esocitosi. Alcuni studi recenti, in cui come modello è stata utilizzata una linea cellulare di adenocarcinoma del colon umano, hanno dimostrato come la secrezione di MUC2 possa avvenire sia in condizioni basali e regolate, che in condizioni stimolate e non regolate. Varie sostanze hanno la capacità di stimolare la secrezione della mucina, tra le quali quelle colinergiche sembrano rivestire il ruolo più importante (53, 54). MUC3 Il gene che codifica per la mucina MUC3 è molto grande ed è localizzato sul cromosoma 7q22 (55, 56). Ogni tandem repeat del dominio centrale è composto da 51 nucleotidi che codificano un peptide ripetitivo di 17 aminoacidi con 12 siti potenziali di glicosilazione (tabella 2). Molto poco si sa riguardo alla sintesi ed epressione di MUC3. L'apomucina MUC3 è prodotta dalle cellule caliciformi mucipare e, in quantità maggiori, dalle cellule intestinali assorbenti (57, 58). A differenza di MUC2, la mucina MUC3 non viene immagazzinata in granuli, ma probabilmente in microvescicole che rilasciano il contenuto nel glicocalice o direttamente nel lume intestinale. Studi di immunoistochimica e di ibridizzazione in situ indicano che nelle cellule intestinali assorbenti l'espressione di MUC3 è regolata spazialmente (59) ; infatti le cellule epiteliali cominciano ad esprimere MUC3 durante la migrazione dagli strati inferiori delle cripte del Lieberkuhn verso la superficie del colon. MUC4 Il gene MUC4 è stato isolato da una libreria di cdna estratto da tessuto bronchiale (60-62). Il gene è localizzato sul cromosoma 3q29 e anch'esso presenta la regione VNTR. Ogni tandem repeat è composta da 16 aminoacidi con 8 siti potenziali di glicosilazione (tabella 2). Anche per il gene MUC4 le informazioni riguardo la struttura e la biologia di questa mucina non sono molte. I dati disponibili indicano comunque che MUC4 è una mucina secretoria sintetizzata dalla maggior parte delle cellule epiteliali e ghiandolari dei tratti respiratorio, digestivo e genito-urinario. MUC5 Oltre a MUC4 altri 3 cdna sono stati ottenuti dalla mucosa umana tracheobronchiale e mappati sul cromosoma 11 p15 (60,63). Questi tre geni sono stati chiamati, per la loro origine comune, MUC5A, MUC5B e MUC5C, rispettivamente. Ulteriori studi hanno dimostrato che MUC5A e MUC5C fanno parte di uno stesso gene, denominato MUC5AC e che questo gene è differente da MUC5B. Il gene MUC5AC è preferenzialmente espresso nel tratto respiratorio e nelle mucose gastrica (antro e fondo) e riproduttiva; per contro il gene MUC5B è fortemente espresso nelle ghiandole bronchiali. Nel gene MUC5AC è possibile distinguere un dominio VNTR composto di sequenze ripetute di 24 paia di basi che codificano per la sequenza aminoacidica TTVTIAP (64, 65) (tabella 2). Oltre al dominio VNTR, nella proteina MUC5AC sono presenti vari domini ricchi in cisteina. E' probabile che questi domini ad alto contenuto cisteinico svolgano un ruolo nel processo di polimerizzazione, analogamente a quanto descritto per il gene MUC2. In ogni caso comunque, a differenza di MUC2, i domini ricchi in cisteina sono inseriti nel dominio VNTR o in un dominio non-ripetitivo ricco in treonina/serina, per cui nella struttura dell'apomucina MUC5AC è possibile riconoscere un grande dominio altamente glicosilato che contiene dei subdomini ricchi in cisteina ma scarsamente glicosilati. Il gene MUC5B presenta una caratteristica unica rispetto agli altri geni mucinici; infatti è l'unico gene mucinico umano ad esibire lunghezze variabili delle unità nucleotidiche ripetute nel dominio VNTR. Il significato biologico di questo peptide degenerato è tuttora ignoto. MUC6 Il gene MUC6 è stato isolato e caratterizzato usando una libreria di cdna da tessuto gastrico umano (66). Oltre ai geni MUC2, MUCAC e MUC5B, MUC6 è il quarto gene ad essere localizzato nel locus 11 p15. La sequenza del cdna è caratterizzata dalla presenza di un dominio VNTR di cui la singola unità ripetuta è lunga 507 nucleotidi (169 aminoacidi) (tabella 2). La lunghezza della singola unità ripetuta rende MUC6 abbastanza peculiare fra le mucine. L1GAND ASSAY VOL. 1 NUMERO 4 ANNO 1996

5 Infatti, la lunghezza del tandem repeat risulta 5 volte superiore rispetto alle unità ripetute nelle altre mucine umane. Inoltre, il dominio VNTR è costituito da varie unità, con la conseguenza che l'apomucina MUC6 è molto grande. Osservazioni biochimiche suggeriscono che lo scheletro proteico di MUC6 abbia un PM superiore a 600kO, che, fra quelli riportati fino ad ora per le apomucine, è il più elevato. MUC6 e MUC5AC sono le due specie maggiormente rappresentate nello stomaco. Studi di immunoistochimica, comunque, hanno dimostrato che la distribuzione tessutale di queste due mucine è differente e rispettivamente esclusiva (67). Infatti, MUC5AC è sintetizzata dalla superficie delle cellule mucose dell'antro e del fondo, mentre MUC6 è prevalentemente espressa nelle cellule mucose delle ghiandole gastriche e nelle cellule delle ghiandole piloriche. Poichè le cellule epiteliali mucose gastriche producono una mucina neutra e le ghiandole mucose gastriche producono una mucina acida, è molto probabile che MUC5AC e MUC6 rappresentino i rispettivi scheletri proteici. MUC7 Il gene MUC7, demoninato anche MG2, è stato recentemente clonato e sequenziato usando una libreria genomica di cona da ghiandola salivare (68). MUC7 è localizzato sul cromosoma 4 e contiene tandem repeats di 23 residui aminoacidici (tabella 2). Inoltre due residui di cisteina precedono i tandem repeats. La più vistosa caratteristica di MUC7 è il suo basso peso molecolare. La regione trascritta infatti, comprendente 1131 nucleotidi, codifica una proteina di soli 377 aminoacidi, con un peso molecolare apparente di 39 ko. I primi 20 residui costituisco il pepetide principale, mentre i rimanenti aminoacidi costituiscon la proteina secretoria. La molecola è secreta come monomero e pertanto i due residui di cisteina, localizzati prima del dominio delle tandem repeats, sono probabilmente coinvolti nei ponti disolfuro intramolecolari. La espressione di MUC7 è tessuto e cellulo-specifica. Studi di ibridizzazione in situ hanno rivelato che questo gene è espresso nei tessuti della ghiandola salivare umana ed esclusivamente in quelli contenenti cellule acinari mucose (68, 69). MUC7 è presente, per esempio, nelle ghiandole sottolinguali e sottomandibolari ma non nelle ghiandole paratiroidee in cui sono presenti cellule acinari sierose. Recentemente, una nuova mucina ad alto PM (MG 1) è stata clonata e parzialmente sequenziata utiliz- zando una libreria di cona di ghiandola sottolinguale umana (70). La regione C-terminale contiene sequenze ricche in cisteina, e ciò suggerisce che anche questa mucina è secreta come polimero. Dati preliminari indicano che MG1 risulta fortemente espressa solo nelle ghiandole sottolinguali. ESPRESSIONE DEI GENI MUCINICI NEI TESSUTI TUMORALI Una delle caratteristiche più importanti della espressione dei geni mucinici è il loro grado di specificità cellulare e tessutale. Come abbiamo già affermato in precedenza, alcune mucine, come ad es. MUC1 e MUC4, sono espresse in differenti tessuti, mentre altre, come ad es. MUC2, MUC3 e MUC7 presentano una espressione cellulare più ristretta. Nella tabella 3 sono riportati i siti preferenziali di espressione relativi ad ogni gene apomucinico. Una problematica importante è se questa specificità di espressione è mantenuta anche in condizioni patologiche differenti, tra cui la trasformazione neoplastica. Studi di immunoistochimica con anticorpi specifici per ogni apomucina e di ibridizzazione in situ con sonde nucleotidiche specifiche hanno dato alcuni chiarimenti iniziali riguardo a questi aspetti. Attualmente sono disponibili dati sulla espressione dei geni mucinici nei tessuti pancreatici, gastrici ed intestinali normali e nelle controparti trasformate. Per quanto riguarda i tessuti di altri distretti le conoscenze nelle nostre mani sono ancora limitate. Studi di ibridazione in situ hanno dimostrato che le cellule degli acici pancreatici esprimono solamente MUC1, mentre i dotti pancreatici normali mostrano reattività anche per sonde anti-muc3 e MUC5B (57, 71, 72). Per contro, MUC2, MUC4 e MUC5AC generalmente non sono espressi in cellule pancreatiche normali. La trasformazione neo plastica del pancreas esocrino è accompagnata da modificazione del pannello di espressione dei geni mucinici. Infatti, in seguito alla trasformazione neoplastica si verifica un sovvertimento della espressione di tali geni, per cui spesso si può riscontrare nel tessuto tumorale la presenza di MUC2, MUC4, MUC5AC. Il significato di questa alterazione di espressione è tuttora oscuro. Tuttavia è possibile che l'espressione di MUC2 e MUC5AC derivi da una differenziazione gastrointestinale spesso osservata nei tessuti tumorali pancreatici. Un altro esempio interessante è costituito dall'epitelio gastrico (73). Come descritto precedentemente, tre geni mucinici, cioè MUC1, MUC5AC e MUC6 so no fortemente Tabella 3 Siti preferenziali di espressione delle mucine Gene MUCI MUC2 MUC3 MUC4 MUC5AC MUC5B MUC6 MUC7 Locali zzazione tessutale Superficie apicale della maggior parte delle cellule epiteliali polarizzate dei tratti respiratorio, diges ti vo e genitourinario, incluso il tessuto mammario Intestino tenue e colon (cellule caliciformi mucipare), epitelio bronchiale (cellule calicoformi mu cipare) Intestino tenue (cellule assorbenti) Cellule epiteliali e ghiandolari dei tratti respiratorio, diges ti vo e genitourinario Stomaco (superficie delle cellule mucipare); tratti res piratori e genitourinari Epitelio bronchiale; dotti pancreatici Stomaco (cellule mucipare e ghiandolari); piloro (ghiandole del Brunner) Ghiandole sali vari (cellule mu cipare) LlGAND ASSAY VOlo 1 NUMERO 4 ANNO 1996

6 Tabella 4 Positività di espressione del gene MUC4 nel tessuto polmonare normale e tumorale Espressione elevata (++) Espressione intermedia (+) Espressione debole (±) Espressione assente Tessuto normale Tessuto tumora[e 0/10 3/18 3/10 9/ [11 8 espressi nello stomaco in condizioni normali. Il carcinoma gastrico, ed in particolare il tipo intestinale, è associato ad una diminuzione dell'espressione di queste mucine e alla comparsa ectopica di mucine tipiche dell'intestino quali MUC2, MUC3 e MUC4. Come avviene nel carcinoma pancreatico, anche nel caso del carcinoma gastrico la spiegazione per questa aberrante espressione può essere ricercata nella capacità delle cellule tumorali di acquisire caratteristiche intestinali e coloniche, attivando le vie metaboliche silenti. Inoltre, è stato osservato che l'espressione multipla delle apomucine è più frequente nel carcinoma gastrico avanzato che non in quello ai primi stadi. Attualmente, non è ancora chiaro se l'espressione multipla dei core peptidici di tali mucine rappresenti un indicatore di aggressività biologica o sia solo un evento secondario all'alterazione genetica spesso osservata nei tumori a stadio avanzato. Vari geni mucinici sono espressi nei tessuti intestinali e del colon normali. Come accennato prima, MUC1 è largamente espresso nelle cellule epiteliali, MUC2 è presente limitatamente alle cellule di globet, mentre MUC3 è distribuito uniformemente in tutto l'epitelio assorbente. La trasformazione neoplastica generalmente determina una riduzione dell'espressione di MUC2 e MUC3, accompagnata da un incremento della sintesi di MUC1 e MUC4 (74-76). Quest'ultima alterazione metabolica è stata descritta anche nel cancro polmonare. In un lavoro recente condotto dal nostro gruppo (28) è stata evidenziato come il gene MUC4 sia fortemente associato al cancro polmonare: infatti la espressione di MUC4, insieme a quella del gene MUC1, è risultata decisamente superiore nel tessuto polmonare tu morale rispetto alla controparte normale (tabella 4); in particolare, i più elevati livelli di RNA specifico sono stati osservati nell'istotipo adenocarcinoma che, come noto, è un tumore producente mucine. Ulteriori studi sono comunque necessari allo scopo di valutare il ruolo del gene MUC4 gene nel cancro polmonare e di correlare la sua espressione con altri parametri biologici, quali il grado istologico e lo stadio clinico. Nel carcinoma colo-rettale la diminuzione dell'espressione del gene MUC1 sembra avere un significato prognostico in quanto è associata alla progressione tumorale e agli stadi avanzati di malattia (77). Un significato prognostico della aumentata espressione di MUC1 è stato anche attribuito nel cancro della mammella (78-80). Molti autori, hanno dimostrato che pazienti con tumori ad elevata espressione di MUC1 spesso presentano una prognosi più sfavorevole, (cioè intervalli liberi da malattia più brevi e una sopravvivenza media generalmente ridotta). Risultati analoghi sono stati ottenuti in relazione alla espressione ectopica di MUC2, gene normalmente non espresso nei tessuti mammari (81). Tuttavia, va sottolineato che il peso dell'espressione aberrante di questi geni mucinici come indicatore prognostico nel cancro della mammella deve essere validato da ulteriori e più estesi studi clinici. RINGRAZIAMENTI Questo lavoro è stato in parte eseguito con il supporto finanziario del CNR-Prog. Finalizzato ACRO. Si ringrazia la Sig.ra Françoise Bonetti per la assistenza redazionale. BIBLIOGRAFIA 1. Strouss GJ, Dekker J. Mucin-type glycoproteins. Crit Rev Biochem Moi Biol, 1992; 27: Jentoft N. 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