Citogenetica dei tumori

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1 Citogenetica dei tumori Teoria più accreditata The prevailing dogma of cancer evolution was one of gradualism in which acquisition of driver mutations occurs cumulatively over years to decades, resulting in incremental progression through increasingly malignant phenotypes 1 Lewin Il Gene VIII 2006

2 Chromothripsis appears to be a cataclysmic event in which a single chromosome is fragmented and then reassembled. The phenomenon raises important questions of how chromosome rearrangements can be confined to defined genome segments. Meyerson and Pellman, Cancer Genomes Evolve by Pulverizing Single Chromosomes. Cell 144, 9-10, January 7, DOI /j.cell Stephens et al., Massive Genomic Rearrangement Acquired in a Single Catastrophic Event during Cancer Development. Cell 144, 27 40, Janu 7, DOI /j.cell Figure 1. Stitching Together Shattered Chromosomes by Chromothripsis Chromothripsis is proposed to involve the shattering of a single chromosome, a small group of chromosomes, or a single chromosome arm. The fragments, or a subset of the fragments, are then stitched together by nonhomologous end-joining. The mechanism by which these alterations are confined to a small segment of the genome is not defined. 2% 3% cancers show s of rearrangements localized to specific genomic regions Genomic features imply chromosome breaks occur in one-off crisis ( chromothripsis ) Found across all tumor types, especially common in bone cancers (up to 25%) Can generate several genomic lesions with 2 potential to drive cancer in single event

3 Stephens et al., Massive Genomic Rearrangement Acquired in a Single Catastrophic Event during Cancer Development. Cell 144, 27 40, Jan 7, DOI /j.cell Genome-wide telomere attrition in somatic cells, for example, may generate naked DNA ends that act as a nidus for on-going genomic rearrangement. End-to-end chromosome fusions resulting from telomere loss can lead to spiraling cycles of dsdna breakage, aberrant repair and further chromosomal damage in both daughter cells. Iteration of this breakage and repair process can lead to extensive genomic remodeling in multiple competing subclones in only a few cell cycles. Under these scenarios, bursts of somatic mutation may accrue in relatively short periods of chronological time. Such genomic rearrangements can drive the development of cancer through several mechanisms. They may result in copy number changes, including: deletion of tumor suppressor genes and increased copy number (amplification) of genes promoting malignant cellular processes. In addition, chromosomal rearrangements can: juxtapose portions of coding sequence from two genes in the same orientation, leading to oncogenic fusion genes, or bring together an intact gene with the regulatory machinery of another gene, causing dysregulated gene expression. Here, we describe multiple cancer samples in which tens to hundreds of genomic rearrangements have been acquired in a single catastrophic event, a phenomenon we have termed chromothripsis (Greek, chromos for chromosome; thripsis, shattering into pieces). 3

4 Stephens et al., Massive Genomic Rearrangement Acquired in a Single Catastrophic Event during Cancer Development. Cell 144, 27 40, Janu 7, DOI /j.cell CHROMOTHRIPSIS La chromothripsis è un evento catastrofico che interessa uno o pochi cromosomi della cellula e comporta l insorgenza contemporanea di centinaia di mutazioni che possono guidare la cancerogenesi. CARATTERISTICHE: Riordinamenti ristretti a uno o pochi cromosomi Formazione di cromosomi derivati (lineari o circolari) e double minutes C Figure 6. Generation of a Double Minute Chromosome Containing MYC by Chromothripsis in a Small Cell Lung Cancer Cell Line, SCLC-21H D (C) Three color FISH for three regions of chromosome 8 (predicted to be linked by the rearrangement data, but not amplified; green, 13 Mb; red, 41 Mb; pale pink, 49 Mb). (D) FISH for three heavily amplified regions (chr 8). (Red, 66.5 Mb; White, 99.3 Mb; Green, Mb). 20/11/2014 Instabilità genomica e cancro Pagina 4

5 Stephens et al., Massive Genomic Rearrangement Acquired in a Single Catastrophic Event during Cancer Development. Cell 144, 27 40, Janu 7, DOI /j.cell A Figure S6. Marker Chromosomes Created by Chromothripsis, Related to Figure 6 SCLC-21H FISH B PD3646a PD3646a spectral karyotype C A) Multicolor FISH for the three heavily amplified probes in SCLC-21H (shown in Fig 6B) together with whole chromosome paint for chromosome 8 (purple). The normal chromosome 8 has the three probes in the correct orientation, whereas the probes do not hybridize to the two derivative chromosomes. (B) A rearrangement screen from a pancreatic cancer, PD3646a, previously published, shows 41 rearrangements involving chromosomes 1, 4, 10 and 14. Copy number profiles for the relevant chromosomes are in the outer ring with somatically acquired genomic rearrangements shown as arcs in the centre. (C) Spectral karyotype for PD3646a shows a striped marker chromosome, with at least 6 cytogenetically visible segments arising from multiple chromosomes. The bright yellow signal corresponds to paint from chromosome 22, but the other stripes are characteristic of signals from chromosomes 1, 4, 10 and 14. 5

6 Stephens et al., Massive Genomic Rearrangement Acquired in a Single Catastrophic Event during Cancer Development. Cell 144, 27 40, Janu 7, DOI /j.cell PRINCIPALI IPOTESI SULL INSORGENZA DI EVENTI DI CHROMOTHRIPSIS Mancata ripresa della replicazione del DNA bloccato in fase S o G2 del ciclo cellulare prima di entrare in mitosi. Reinserimento, nei nuclei normali, di frammenti di DNA derivati da micronuclei formatesi durante la divisione mitotica. Esposizione a radiazioni ionizzanti che inducono rotture a doppio filamento sul cromosoma condensato, durante la mitosi. Cicli di rottura-fusione-ponte associati al logoramento dei telomeri. 20/11/2014 Instabilità genomica e cancro Pagina 6

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9 Caratteristiche di una cellula tumorale: cambiamenti che producono instabilità genomica e cariotipica 1) Difetti nei meccanismi della replicazione e della riparazione del DNA: il cancro spesso si origina da cellule che hanno perso la capacità di replicare fedelmente il proprio genoma o che sono difettive nei sistemi di riparazione del DNA 2) Aumento delle aberrazioni cromosomiche: il cariotipo delle cellule tumorali spesso contiene grossi riordinamenti, come cromosomi rotti, copie multiple di singoli cromosomi, delezioni di grandi segmenti cromosomici o di interi cromosomi. Riordinamenti cromosomici e cancro Traslocazioni cromosomiche non casuali sono spesso associate ad una varietà di tumori, soprattutto di tipo ematopoietico e sarcomi infantili. Oltre alla loro utilità diagnostica, le traslocazioni cromosomiche sono sempre più utilizzate per indirizzare le decisioni terapeutiche. Meccanismi di ricombinazione che hanno un ruolo potenziale nella produzione non casuale di traslocazioni cromosomiche 1. Ricombinazione illegittima V(D)J: V(D)J recombination: il processo per cui segmenti discontinui V (variabile), D (diversità) e J (congiungimento) si ricongiungono nei linfociti, portando a riordinamenti del DNA in queste cellule. 2. Class Switch Recombination (CSR): comportamento normale delle cellule-b, che porta al rimpiazzo di una regione del segmento genomico costante (c) con un altro. 3. Ricombinazione omologa 4. Non homologous end joining (NHEJ): un meccanismo di riparo del DNA in cui due estremità non omologhe del DNA sono riparate per ligazione di una all altra Siti fragili comuni del genoma

10 CROMOSOMI E TUMORI Le anomalie cromosomiche fanno parte della descrizione classica del fenotipo citologico delle cellule tumorali INDIVIDUAZIONE DI RIORDINAMENTI NON CASUALI Agli inizi, e ancora oggi, lo studio dei riordinamenti non casuali è stato riportato essenzialmente nel campo delle emopatie maligne, poiché le cellule ematiche si prestano molto meglio delle cellule dei tumori solidi all esplorazione citogenetica 10

11 Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology I. SINDROMI MIELOPROLIFERATIVE (MPD) - Chronic myelogenous leukaemia (CML) - Polycytemia vera (PV) - Idiopathic myelofibrosis - Essential thrombocythemia (ET) - Atypical chronic myelogenous leukemia (acml) II. SINDROMI MIELODISPLASTICHE (MDS) - Del(5q) and myeloid malignancies - Others III. LEUCEMIE ACUTE MIELOIDI (AML) - First group: AML with recurrent cytogenetic translocations - Second group: Multilineage AML (maml) - Third group: Secondary AML - Fourth group: others AML, Morphological and Immunophenotyping classification 11

12 Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology IV. LEUCEMIE ACUTE LINFOIDI (ALL) - t(4;11)(q21;q23) - Others 11q23 (MLL) - t(9;22)(q34;q11) - t(12;21)(p12;q22) - t(8;14)(q24;q32) and t(2;8)(p12;q24) and t(8;22)(q24;q11) variants - 14q11 rearrangements - B Cell/ T Cell - Others V. LINFOMI NON HODGKIN/ /CHRONIC LYMPHOPROLIFERATIVE DISEASES - B-cell chronic lymphoproliferative disorders - B-cell Non Hodgkin Lymphomas - T Cell 12

13 Classificazione morfologica delle leucemie acute. Tabella 1. Classificazione FAB (French-American-British) SOTTO NOME COMUNE % PEROX SUDAN ESTERASI CITO GENI TIPO CASI NERO ASPECIFICA GENETICA INTERESSATI M0 M1 M2 AML A MINIMA DIFFERENZIAZIONE AML SENZA MATURAZIONE AML CON 3 NEG NEG NEG (*) INV(3Q26) T(3;3) EVI POS POS NEG POS POS NEG T(8;21) AMLI-ETO Le AML sono state divise in 8 sottotipi (M0-M7) in base alla morfologia cellulare e al grado di differenziamento. MATURAZIONE 30 T(6;9) DEK-CAN M3 LEUCEMIA ACUTA PROMIELOCITICA 20 POS POS NEG T(15;17) T(11;17) PML-RARa PLZF-RARa T(5;17) NPM-RARa M4 LEUCEMIA ACUTA MIELOMONOCITICA 20 POS POS POS 11q23 INV(3q26) T(3;3) T(6;9) MLL DEK-CAN EVI 1 M4 Eo LEUCEMIA ACUTA MIELOMONOCITICA 5-10 POS POS POS INV(16) T(16;16) CBFb -MYH11 Con eosinofili M5 LEUCEMIA ACUTA MONOCITICA 2-9 NEG NEG POS 11q23 T(8;16) MLL MOZ-CBP M6 ERITROLEUCEMIA 3-5 POS POS NEG.. M7 LEUCEMIA ACUTA MEGACARIOCITICA 3-12 NEG NEG POS (**) T(1;22) NON NOTI Dati del !

14 Attivazione del proto-oncogene c-myc per traslocazione cromosomica. Strachan and Read, Copyright 2012 Linfoma di Burkitt Nel linfoma di Burkitt, una traslocazione 8;14 trasferisce l oncogene MYC nelle vicinanze del locus IGH (codificante le catene pesanti delle immunoglobulina) sul cromosoma 14. Con la traslocazione i due si trovano giustapposti testa a testa in orientamento trascrizionale opposto e il gene MYC viene posto sotto l influenza di elementi regolativi associati al locus IGH specifici per le cellule B, quali gli enhancer indicati con la lettera E. Ciò determina alti livelli di espressione di MYC nelle cellule B. Lewin Il Gene VIII 2006 Traslocazioni cromosomiche reciproche nel linfoma di Burkitt Nel 60-70% circa dei casi la traslocazione è di tipo 8;14 e genera cromosomi: - t(8;14)(q24;q32) Nel restante 30-40% la traslocazione coinvolge sempre la rottura in 8q24 (gene c-myc) ed i cromosomi 2 e 22, generando le traslocazioni: - t(2;8)(p12;q24), in 10-15%, e - t(8;22)(q24;q11) in 2-5% - altri riordinamenti Chr 8q24 locus c-myc Chr 14q32 locus cluster dei geni IgH (catene pesanti Ig) Chr 14q11.2 TCRα (T cell receptor) Chr 2p12 locus K (catene leggere χ delle Ig) Chr 22q11 locus λ (catene leggere λ delle Ig) TCR T cell receptor 14

15 Cromosoma Philadelphia (CML) Diagramma dei cromosomi umani 9 e 22 e della traslocazione reciproca che genera, nella leucemia mieloide cronica (CML), la formazione del cromosoma Philadelphia (Ph ) q q Fig a) Sono indicati la localizzazione e l orientamento dei geni c-abl e bcr, così come del prodotto della fusione bcr-abl. b) Rappresentazione schematica dei geni c-abl e bcr, con gli esoni raffigurati come cassette. Le regioni in cui si verificano i punti di rottura che danno origina alle traslocazioni sono indicate da parentesi graffe. In conseguenza della traslocazione si origina un nuovo gene (chimerico) comprendente la regione 5 di bcr e gran parte di c-abl. La trascrizione, sotto il controllo del promotore di bcr, genera un mrna chimerico che è tradotto in una proteina composta per un terzo dagli aminoacidi di bcr e per due terzi da quelli di c-abl Lewin Il Gene VIII 2006 ALL Leucemia Linfoblastica Acuta CML Leucemia Mieloide Cronica bcr breakpoint cluster region bcr-abl proteina di fusione in cui sequenze N-terminali da bcr sono unite a sequenze c-abl. La mancanza della regione N-terminale di c-abl attiva la chinasi la capacità trasformante. 15

16 approccio citogenetico e citogenetico molecolare (FISH): cromosoma Philadelphia nella leucemia mieloide cronica Chr Philadelphia nella CML t(9;22)(q34;q11) - ABL-BCR su DER9 (nessuna proteina prodotta) - BCR-ABL su Ph (proteina di fusione coinvolta nella proliferazone cellulare) 16

17 Linfomi Non Hodgkin Diagnosi TRASLOCAZIONE t(14;18)(q32;q21) approccio molecolare RT-PCR (geni di fusione o traslocazioni con punto di rottura noto): t(14;18)gene:bcl crom.14 cat.pesante Ig primer crom.18 gene bcl primer cat.pesante Ig primer nessun prodotto traslocazione 14;18 gene bcl primer t(14;18)(q32;q21) prodotto di RT-PCR del gene ibrido 17

18 Leucemia Acuta Promielocitica (APL) (geni coinvolti PML-RARα) La traslocazione t(15;17)(q22;q21) è associata clinicamente alla leucemia acuta promielocitica (APL) In verde chr17 In rosso chr15 Individuazione del gene per il retinoblastoma (Rb) 18

19 Modello del doppio colpo Knudson propose un modello (two-hit hypothesis) secondo il quale, affinche si abbia il retinoblastoma, e necessario che in una linea di cellule retiniche si verifichino due distinti eventi mutazionali I evento ( hit ) II evento ( hit ) I soggetti con retinoblastoma ereditario hanno ereditato una di queste mutazioni, la quale, pertanto, e presente in tutte le loro cellule retiniche e, quindi, e necessario un secondo evento perche si produca il tumore. Il retinoblastoma sporadico, invece, si forma solo quando due eventi mutazionali indipendenti avvengono nella stessa linea cellulare. Cio si realizza piu raramente, per cui l insorgenza e piu tardiva e i tumori sono invariabilmente monolaterali. 19

20 Retinoblasoma Il primo indizio sulla posizione del gene Rb e stato fornito da soggetti rari affetti da retinoblastomi bilaterali, concomitanti anomalie congenite e assenza di familiarita delezione 13q13-q14 L analisi cromosomica di questi pazienti ha dimostrato la presenza di una delezione del braccio lungo del cromosoma 13 di dimensione variabile ma con condivisione delle bande 13q13- q14: questa osservazione suggeriva che in tale regione si localizzasse un gene predisponente al retinoblastoma Ipotesi - Una mutazione in un gene del cromosoma 13 costituirebbe il primo evento e, nel caso di familiarità, e presente nelle cellule normali dei portatori. - Il secondo evento consisterebbe nella perdita della copia normale rimanente di questo gene... Per la verifica del secondo evento: si puo ricorrere a tecniche di biologia molecolare, come il Southern Blot di DNA dei soggetti di una famiglia affetta, usando sonde del cromosoma 13 per analizzare la perdita di eterozigosita (LOH) 20

21 Perdita di eterozigosita LOH famiglia con figlia affetta da retinoblastoma: RFLP della regione mutata Cellule tumorali Clonaggio del gene del retinoblastoma la ricerca del gene si è concentrata sulla banda 13q14 e si sono cercate le sequenze espresse nelle cellule retiniche normali, che risultassero mutate nei soggetti affetti da retinoblastoma familiare il punto di partenza è stato fornito dalla scoperta di un gruppo di tumori che presentavano una delezione omozigote corrispondente ad una sequenza di DNA clonata dalla regione 13q14 Nel retinoblastoma il trascritto era assente o di dimensioni molto diversi dal normale pazienti con retinoblastoma ereditario portatori di tumori con delezioni omozigoti presentavano delezioni eterozigoti nei tessuti costituzionali... Rb e un oncosoppressore 21

22 Meccanismi di acquisizione della seconda mutazione + + Rb + Non disgiunzione e duplicazione C.O mitotico + Rb delezione mutazione puntiforme + Rb Conversione genica Rb Rb + Rb Rb Rb + Rb - Rb x Rb 22

23 Modello per lo sviluppo a più stadi del carcinoma del colon Strachan and Read, Genetica Umana Molecolare, Zanichelli editore S.p.A. Copyright 2012 Fig In numerosi tumori, eventi di perdita, attivazione o mutazione in particolari geni vengono frequentemente riscontrati in particolari stadi istologici. Ciò fornisce più uno strumento concettuale per capire come si sviluppa un tumore che una descrizione operativa. Ogni cancro del colon-retto si è probabilmente evoluto attraverso i medesimi stadi istologici, ma lo spettro delle corrispondenti alterazioni genetiche è più ampio. 23

24 Lewin Il Gene VIII

25 Fluorescence In Situ Hybridizaton (FISH) Si riferisce all ibridazione su preparati citologici di sonde sito o cromosoma-specifiche, marcate fluorescentemente Permette di visualizzare specifici siti su cromosomi in metafase o in cellule interfasiche Permette di identificare aberrazioni cromosomiche numeriche e/o strutturali (precedentemente bandeggio cromosomico) Utile nel risolvere problemi diagnostici, quali identificazione di cromosomi marker e ricostruzione di aberrazioni cromosomiche complesse in metafasi di tumori Strumento importante in discipline di ricerca di base che vanno dalla radiobiologia alla citogenetica evolutiva Sonde per painting (Chromosome Painting) Si riferisce all ibridazione su preparati citologici di sonde sito o cromosoma-specifiche, marcate fluorescentemente Le sonde per il painting vengono prodotte o con purificazione dei cromosomi o per microdissezione di normali cromosomi metafasici. Si possono ottenere sonde per il reverse chromosome painting: i cromosomi aberranti vengono isolati e utilizzati come sonde per il painting sui cromosomi di metafasi normali La microdissezione invece, permette la produzione di sonde per specifiche regioni cromosomiche 25

26 Ibridazione in situ di sonde per painting specifiche per i cromosomi 2 e 5 Colorazione simultanea in diversi colori dei 46 cromosomi di una metafase di una cellula umana normale. Cariogramma ottenuto dalla metafase utilizzando un analisi automatizzata e colori falsi creati dal computer. 26

27 Citogenetica dei tumori Con il diminuire della qualità dei cromosomi e l aumento del numero di aberrazioni, aumenta l utilità del painting cromosomico per chiarire il pattern dei riordinamenti cromosomici Metafase, e corrispondente cariogramma, ottenuti da una linea cellulare di un cancro al polmone non a piccole cellule, dopo painting a 7 fluorocromi. 27

28 Citogenetica clinica Il problema maggiore è dovuto alla presenza di cromosomi marker e ad anello la cui origine non può essere identificata con le sole tecniche di bandeggio cromosomico; la caratterizzazione di queste strutture è importante per valutare le possibili conseguenze fenotipiche Il painting permette di identificare agevolmente i cromosomi marker, le traslocazioni criptiche e i riordinamenti complessi E tuttavia difficile evidenziare con questa tecnica le aberrazioni intracromosomiche combinazione di bandeggio e painting 28

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