Prof. Maria Nicola GADALETA

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1 Prof. Maria Nicola GADALETA Facoltà di Scienze Biotecnologiche Corso di Laurea in Biotecnologie Sanitarie e Farmaceutiche Biochimica e Biotecnologie Biochimiche DISPENSA N. 4 AMMINOACIDI

2 α-amminoacidi PROTEICI O STANDARD Gli aminoacidi (AA) presenti nella cellula possono essere il prodotto di idrolisi delle proteine (αaa proteici o standard; αaa rari o non standard) o metaboliti liberi (AA non proteici). Gli α-amminoacidi hanno proprietà strutturali comuni

3 CLASSIFICAZIONE BIOCHIMICA DEI 20 AMMINOACIDI STANDARD R non polare (o idrofobico) (8-9 AA) Sono i meno solubili in acqua; il meno idrofobico è l alalnina. * AMMINOACIDO SIMBOLI GRUPPO ## (Glicina) (P.M. 75) Gly G Alanina Ala A Valina Val V Leucina Leu L Isoleucina Ile I Prolina Pro P Gruppo imminico Metionina Met M Fenilalanina Phe F Gruppo fenile Triptofano (P.M. 204) Trp W Indolo * per Tyr vedi AA con R polare non carico ## la Glicina avendo come R solo H è in alcuni casi inserito fra gli AA con R non polare (idrofobico), in altri fra gli amminoacidi con R polare non carico (idrofilico). L anello piridinico comprende sia Cα che NH 2.

4 R polare non carico a ph neutro (idrofilico) (6-7 AA) Sono più solubili dei precedenti; R può formare legami H con H 2 O. I più polari (Cys e Tyr*) a ph 7 sono debolmente ionizzati. AMMINOACIDO (Glicina) Gly G Serina Ser S Treonina Thr T Cisteina Cys C Tirosina* Tyr Y Asparagina Asn N Glutamina Gln Q * R aromatiico: vedi pagina precedente

5 R polare carico a ph 7 (idrofilici) (5 AA) Tutti con R completamente ionizzato a ph 6-7, negativi o positivi, tranne His che ha pk R ~ 6. AMMINOACIDO CARICA Aspartato Asp D - Glutammato Glu E - Lisina Lys K + Arginina Arg R + Istidina His H +

6 Altre classificazioni di amminoacidi AA acidi: AA basici: glutammato e aspartato: AA monoamminodicarbossilici arginina e lisina: AA diamminomonocarbossilici istidina (anello imidazolico) AA solforati: AA aromatici: cisteina e metionina fenilalanina, triptofano e tirosina

7 GLUTAMMATO MONOSODICO (MSG) * casa * aumenta il sapore dei cibi dadi ristorante GLUTAMMATO Amminoacidi proteine Neurotrasmettitore (versatilità delle biomolecole, principio di economia) Idrolizzati proteici vegetali (dadi) > 40% di MSG Sindrome da ristorante cinese (eccessivo uso di MGS) dai capogiri al mal di testa all affaticamento 2% popolazione umana estremamente sensibile evitare : questo condimento funghi piselli altri vegetali ricchi in MSG Esempio di amminoacido utile all organismo dannoso in quantità eccessiva

8 AMMINOACIDI RARI O NON-STANDARD (prodotti dalla modificazione post-traduzionale) 4-idrossiprolina proteine fibrose = collageno non idrossilazione = scorbuto γ - carbossiglutammato Protrombina non carbossilazione = emorragia Selenocisteina (derivato della serina) Si ottiene dalla sostituzione dell OH ossidrilico Ser con Selenio. E presente nella glutatione perossidasi e in poche altre proteine. Cistina Si ottiene dalla ossidazione del gruppo sulfidrilico di due cisteine con formazione di un ponte disolfuro

9 AMMINOACIDI NON-PROTEICI circa 300 nella cellula β - alanina (acido pantotenico) δ γ β α ornitina (ciclo dell urea) δ γ β α citrullina (ciclo dell urea)

10 AMMINOACIDI ESSENZIALI Amminoacidi che l organismo non può sintetizzare o sintetizza in quantità insufficiente. Per l uomo sono 10 di cui 8 per tutta la vita 2 solo per il bambino Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Thr, Trp, Val per tutta la vita Arg e His nell infanzia (rapida crescita) durante la gravidanza Tyr solo per i fenilchetonurici

11 STEREOCHIMICA DEGLI αamminoacidi Tutti gli α-amminoacidi, tranne la glicina che non ha C chiralico, ruotano il piano della luce polarizzata Centro chiralico = Carbonio con 4 sostituenti diversi = otticamente attivo Poichè la disposizione degli orbitali di legame intorno al Cα è tetraedrico i 4 gr sostituenti possono disporsi nello spazio in 2 modi diversi e quindi gli AA presentano 2 possibili stereoisomeri. Questi stereoisomeri sono immagini speculari non sovrapponibili = eniantiomeri

12 CONFIGURAZIONE ASSOLUTA DEGLI AA : D, L La configurazione assoluta non fa riferimento alle proprietà ottiche delle molecole ma solo alla configurazione secondo la convenzione di Fisher dei quattro sostituenti attorno a 1 C chiralico. D L configurazione assoluta Il Cα è il C asimmetrico = centro chirale = tutti i sostituenti del C sono diversi. Convenzione di Fisher da: Nelson & Cox

13 CONFIGURAZIONE RELATIVA ROTAZIONE SPECIFICA [α] D 25 = rotazione oss. (deg x 100) lungh. camm. ott. (dm) x conc. (gr/100ml) D = linea del Na nm AMMINOACIDI 25 [α] D L-alanina +1.8 L-arginina L-leucina L-isoleucina L-fenilalanina L-ac. Glutammico configurazione relativa: Destrogiri + d) Levogiri - l) Rotazione specifica di alcuni amminoacidi isolati da proteine, in soluzione acquosa. Dipende dalla natura di R, non dipende dalla configurazione assoluta del C asimmetrico sono tutti L stereoisomeri. Il grado e il segno di rotazione specifica dipendono dal ph.

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16 Stereoisomeri : Enantiomeri proprietà fisiche e chimiche identiche ad eccezione: 1. rotazione del piano della luce polarizzata in misura uguale ma direzione opposta 2. reagiscono in modo diverso con reagenti a loro volta asimmetrici (ENZIMI) se prodotti da una reazione organica gli amminoacidi sono ottenuti sotto forma di racemo L-D Se sintetizzati con reazioni enzimatiche si ottengono solo gli isomeri L, perché gli enzimi sono anch essi asimmetrici. Stereoisomeri possibili 2 n n = n 0 di C asimmetrici Glicina n = 0 Treonina e isoleucina n = 2 (4 possibili stereoisomeri)

17 SPETTRI DI ASSORBIMENTO DEGLI AMMINOACIDI Gli amminoacidi non assorbono nel visibile Tutti gli amminoacidi assorbono nell estremo U.V. < 220 nm a causa del doppio legame del gruppo COOH Tre amminoacidi assorbono nell U.V. intorno a 280 nm; Trp Tyr Phe BANDA DEL TRIPTOFANO Queste caratteristiche si riflettono nelle proteine che possono essere dosate attraverso lettura spettrofotometrica a 280 nm.

18 LEGGE DI LAMBERT BEER Legge valida solo ad A = A λmax A λ max = ε c l l = percorso ottico (A) ε = coefficiente di estinzione molare c = concentrazione sostanza in esame A = log I 0 / I t I 0 = intensità luce incidente nell U.V. (A λmax ) I = intensità luce t trasmessa da: Nelson & Cox

19 PROPRIETA ACIDO-BASICHE DEGLI AMMINOACIDI Gli amminoacidi cristallini hanno : 1. punto di ebollizione >> C 2. alta solubilità in acqua Queste proprietà sono tipiche dei reticoli cristallini di molecole dotate di carica le cui forze attrattive sono di tipo elettrostatico; viceversa sarebbero stati stabilizzati da forze di Van der Waals, più deboli, e quindi avrebbero avuto punti di fusione più bassi. Gli amminoacidi cristallizzano come ioni dipolari o zwitterioni e si trovano in questa forma anche in soluzioni acquose neutre. Gli amminoacidi hanno infatti: 1. alte costanti dielettriche D 2. grandi momenti dipolari un riflesso di cariche sia positive che negative sulla stessa molecola.

20 STATI DI IONIZZAZIONE DI UN AMMINOACIDO IN FUNZIONE DEL ph Gli amminoacidi disciolti in acqua possono comportarsi: come ACIDI (donatori di protoni) come BASI (accettori di protoni) sono chiamati ELETTROLITI ANFOTERI o ANFOLITI

21 Un semplice amminoacido mono amino-monocarbossilico, come la GLICINA, è di fatto un acido diprotico quando è completamente protonato, in questa forma ha, cioè, due gruppi che possono ionizzarsi per dare protoni. La CURVA DI TITOLAZIONE DELLA GLICINA presenta due distinti stadi, corrispondenti ciascuno alla rimozione di un protone. da: Nelson & Cox

22 all inizio della titolazione la Glicina è nella forma completamente protonata al punto di flesso della I a sigmoide sono presenti quantità equimolecolari di COO - e COOH; questo ph è il pk del gruppo che viene titolato. (pk 1 = 2.34) a ph = 5.97 è completa la titolazione del primo gruppo e si inizia a rimuovere il secondo protone. La forma prevalente è NH 3 -CHR-COO - al punto di flesso della II a parte si avrà quantità equimolecolare di NH 3+ e NH 2. Questo ph è il pk del gruppo NH 3+ (pk 2 = 9.60) la titolazione è completa quando la forma predominante diventerà NH 2 -CHR-COO - (completamente deprotonata)

23 La curva di titolazione predice la carica elettrica degli AA A ph = 5.97 la forma prevalente è lo ZWITTERIONE (cioè senza carica netta). Questo ph è detto PUNTO ISOELETTRICO (pi) ed è dato dalla media aritmetica dei due valori di pk (nel caso di amminoacidi privi di gruppi R dissociabili). Es. Glicina pi = / 2 = 5.97 pi = pk 1 + pk 2 2 a ph = pi di un amminoacido 1. carica netta = 0 2. non si muove in un campo elettrico 3. presenta la minima solubilità a ph > pi la carica netta della Glicina sarà -, pertanto si muoverà verso il polo + a ph < pi la carica netta della Glicina sarà +, pertanto si muoverà verso il polo a ph = 1 la Glicina sarà completamente protonata con carica netta + = 1 a ph = 2.34 dove [NH 3 + -CHR-COOH] = [NH 3 + -CHR-COO - ], la Glicina avrà carica netta + = 0.5 così per tutti i valori di ph si può calcolare la frazione di carica netta posseduta dall amminoacido. Importante per la separazione elettroforetica.

24 Gli amminoacidi con gruppi R ionizzabili hanno curve di titolazione più complesse con tre stadi corrispondenti alle tre tappe di ionizzazione, con tre valori di pk. Se i valori di pk sono molto simili le curve si fondono. La curva di titolazione dell istidina. Il ph isoelettrico (pi) è il valore al quale ci sono un ugual numero di cariche positive e negative. La molecola non ha carica netta. pi = 7.6 = pk 2 + pk R 2

25 VALORI DI pk A DI ALCUNI AMMINOACIDI E LORO pi AMMINOACIDI PK 1 -COOH PK 2 -NH 3 PK R PI Glicina Alanina Leucina Serina Treonina Glutamina a. aspartico a. glutammico Istidina Cisteina Tirosina Lisina Arginina nessun amminoacido mono amino mono carbossilico ha capacità tamponante nelle zone di ph fisiologico (7.4) da 6.0 a 8.0 tranne l ISTIDINA il cui pk R è = 6. E un amminoacido raro ma molto importante (per es. in Hb e nel sito attivo degli enzimi) il pi degli amminoacidi acidi è uguale a pk 1 + pk R il pi degli amminoacidi basici è uguale a pk 2 + pk R 2 2

26 In pratica, a ph fisiologico l istidina può associare e dissociare il protone con la stessa facilità. Può pertanto comportarsi da acido o da base: dipende dall ambiente circostante. Importante in Hb e nella catalisi acido-basica.

27 GENERALITA sulle proprietà acido-basiche degli AA il pi degli amminoacidi neutri non è esattamente 7 (come ci si aspetterebbe se COOH e NH 2 avessero la stessa forza), ma COOH come acido è un pò più forte di NH 2 come base il gruppo α COOH è un acido più forte di altri gruppi carbossilici (es. acido acetico ha il pk = 4.76). Ciò è dovuto alla repulsione che si instaura tra i protoni che vengono liberati e la carica positiva del gruppo α aminico (con le sue cariche + stabilizza la carica del COO - dissociato) il pka del gruppo aminico della Glicina viene modificato verso il basso rispetto ai valori medi di un gruppo aminico primario: ciò è dovuto alla forza di attrazione degli atomi elettronegativi dell ossigeno del -COOH, aumentando contemporaneamente la tendenza del gruppo NH 3 a cedere un H + tutti gli amminoacidi mono amino mono carbossilici con gruppi R privi di carica hanno valori di pk 1 quasi uguali ( ) così per i valori di pk 2 (8.8-11). Le curve di titolazione sono simili a quelle della Glicina il gruppo β - carbossilico dall a. aspartico e il γ - carbossilico dell a. glutammico sebbene completamente ionizzati a ph 7 hanno valori di pk molto più alti dei gruppi α COOH, cioè molto più simili a quelli degli acidi carbossilici semplici come a. acetico il gruppo SH delle cisteine e il gruppo OH della tirosina sono debolissimi acidi. A ph 7 SH è ionizzato all 8%, mentre l -OH è ionizzato all 0.01% Queste considerazioni sono importanti per spiegare, per esempio, il meccanismo di catalisi nel sito attivo degli enzimi.

28 Metodi per l analisi qualitativa e quantitativa degli AA 1. SEPARAZIONE e ANALISI QUALITATIVA degli AA Tecniche basate sulle proprietà di adsorbimento e miscibilità (o ripartizione) 1. cromatografia su carta 2. su strato sottile (TLC) 3. liquida ad alta pressione (HPLC) Principi in base ai quali operano le suddette tecniche: 1. principio di ripartizione 2. di ripartizione o di adsorbimento 3. di ripartizione o di adsorbimento (sc. ionico) Tecniche basate sulle proprietà di carica 1. elettroforesi su carta 2. cromatografia a scambio ionico 2. ANALISI QUANTITATIVA Analisi spettrofotometrica per tirosina, triptofano fenilalanina 1. colorimetrica (ninidrina fino a 1 µmole) 2. fluorimetrica (fluorescamina fino a 1 pmoli) (cloruro di dansile fino a 1 pmoli)

29 Cromatografia su colonna

30 Analisi degli amminoacidi Reazione con la ninidrina per l analisi quantitativa colorimetrica degli amminoacidi La reazione con la ninidrina distrugge la molecola degli amminoacidi. Il composto colorato si sviluppa dopo esposizione degli amminoacidi a 100 C. La prolina, che è un imminoacido dà un composto giallo (λ max = 440 nm). Sensibilità: micromole (10-6moli ); µg

31 da: Nelson & Cox